專利名稱：用于石斑魚成分鑒別的引物、試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及用于石斑魚成分鑒別的特異性寡核苷酸引物，包含本發(fā)明的寡核苷酸引物的PCR檢測試劑盒，以及用于石斑魚成分鑒別的檢測方法，屬于生物技術領域。
背景技術：
隨著經(jīng)濟的發(fā)展和人們生活水平的進步，近些年名優(yōu)魚類的消費發(fā)展極為迅猛， 由于不同品種魚類的價值差異巨大，錯誤標簽和以次充好等現(xiàn)象越來越多。為保護消費者權益，需要確定產(chǎn)品所用魚類的真實性和種類，建立一種可靠而簡便的魚類物種鑒定方法。傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定方法適合整條魚的品種鑒定，依賴于魚的整體形態(tài)，一旦進行了加工，如魚片、魚糜等，魚種的形態(tài)鑒定將變得很困難?；贒NA的檢測方法由于其特異性和高穩(wěn)定性，在魚類的物種鑒定中起到了越來越重要的作用。目前在物種鑒定領域應用最廣泛的DNA的檢測方法包括DNA序列分析、物種特異性PCR、實時熒光PCR、RFLP等。石斑魚泛指鱸形目鯧科石斑魚亞科里的各屬魚類，中國主要為石斑魚屬，部分石斑魚亦可見于鰓棘鱸屬、駝背鱸屬等其他屬。石斑魚價格昂貴，經(jīng)濟價值高。制假售假、以次充好的現(xiàn)象頻頻發(fā)生。國內(nèi)外學者對石斑魚物種鑒定的研究較少，Trotta等2005年發(fā)表了利用實時熒光PCR進行石斑魚鑒偽的方法(J Agric Food Chem, 2005, 53，2039-2045)。陳雙雅等2011年發(fā)表了應用PCR-RFLP方法鑒定石斑魚不同品種的方法(色譜，2011，29， 677-680)ο本申請發(fā)明人設計特異性寡核苷酸引物，通過PCR技術建立了石斑魚成分的檢測方法，PCR反應結(jié)束后根據(jù)特異性擴增DNA片段的位置判定實驗樣品是否為石斑魚。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于，提供了一種用于石斑魚成分鑒別的特異性寡核苷酸引物。本發(fā)明的另一個目的在于，提供了一種用于石斑魚成分鑒別的試劑盒。本發(fā)明的再一個目的在于，提供了一種用于石斑魚成分鑒別的PCR檢測方法。為了達到上述目的，本發(fā)明的技術方案是
一種用于石斑魚成分鑒別的特異性寡核苷酸引物，本發(fā)明通過分析已報道的石斑魚 16S核糖體核糖核酸(16S ribosomal RNA, 16S rRNA)基因序列設計，由正向引物Grof和反向引物Gror組成，所述正向引物的堿基序列SEQ ID No. 1和所述反向引物的堿基序列SEQ ID No. 2如下。使用本發(fā)明的引物對，能夠特異、靈敏地擴增出目的片段。SEQ ID No. 1 :5，- TgCCCTgTgACTATATgTT -3， SEQ ID No. 2 :5，- gTACATTCAgTCCTTgC -3，。一種用于石斑魚成分鑒別的PCR檢測試劑盒，含有權利要求1所述引物的試劑盒。一種用于石斑魚成分鑒別的PCR檢測方法，包括如下步驟(1)根據(jù)上述引物的核苷酸序列信息合成引物Grof和Gror，將上述引物分別配制成濃度為10 Mfliol/L的溶液作為試劑盒，備用。(2)提取魚的肌肉組織的基因組DNA溶液備用。(3)以樣品基因組DNA為模板，利用所述的特異性寡核苷酸引物Grof和Gror進行PCR擴增，反應結(jié)束后凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，根據(jù)是否出現(xiàn)323 bp的特異性PCR擴增條帶判定結(jié)果。所述的PCR反應體系為25 μ L，即在0.2 mL的PCR反應管中加入2. 5μ L IOXPCR 緩沖液 2. 5 μ L MgCl2 (25 mmol/L),2. 5 μ L dNTP (2.5 mmol/L),0. 2 μ L DNA 聚合酶(5 U/μ L), 1 μ L GrofClO ymol/L),l μ L GrorC 10 ymol/L),l μ L 基因組 DNA，14. 3 μ L 超純水。反應條件為95 "C, 5 min ；94 "C 1 min，60 "C 30 s，72 "C 20 s，共 40 個循環(huán)； 72 "C 延伸 7 min。所述的判定結(jié)果是根據(jù)電泳出現(xiàn)323 bp的特異性PCR擴增條帶作為檢出石斑魚成分的結(jié)論。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明根據(jù)石斑魚16S rRNA基因序列設計特異性寡核苷酸引物，利用PCR方法鑒別石斑魚成分；本發(fā)明檢測方法能夠快速準確地判斷樣品是否有石斑魚成分，為食品安全提供了保證。本發(fā)明具有特異性好、檢測方法快速簡便、準確性高、 靈敏度高的特點。


圖1是本發(fā)明PCR檢測10種石斑魚的試驗結(jié)果；1 一 10依次為斑鰓棘 ψ (.Plectropomus maculatus)、豹紋魚思棘 ψ (.Plectropomus leopardus),馬它背售盧 {Cromileptes altivelis )、寬客頁售盧{Promicrops lanceolatus)、JftJl石斑魚{Epinephelus quoyanus )、赤點石斑魚{Epinephelus akaara )、云紋石斑魚{Epinephelus moara )、掠點 ￠3 !!. {Epinephelus fuscogut ta tus ) > ^ ^ " !!. {Epinephelus coioides )禾口青石斑魚 {Epinephelus awoara )的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果，均產(chǎn)生323 bp條帶；
圖2是本發(fā)明石斑魚成分PCR檢測方法的靈敏度試驗結(jié)果。1 一 7依次為石斑魚含量分別為10 %、5 %、1 %、0·5 %、0· 1 %、0.05 %和0. 01%的魚肉樣品的PCR檢測結(jié)果。
具體實施例方式1.首先進行引物的設計
本實施例的用于鑒別石斑魚成分PCR檢測方法的引物，根據(jù)石斑魚16S基因序列(Genebank 序列號 JF750749、JF750750、JF750751、JF750752、JF750753、JF750756、 JF750755、JF750757)，采用引物設計軟件I^rimer 5. 0設計而成。引物由正向引物Grof和反向引物Gror組成，其中正向引物Grof的序列SEQ ID No. 1和反向引物Gror的序列SEQ ID No. 2 如下
SEQ ID No. 1 :5，- TgCCCTgTgACTATATgTT -3， SEQ ID No. 2 :5，- gTACATTCAgTCCTTgC -3，。2.其次是引物的合成
根據(jù)上述核苷酸序列信息由TAKARA公司合成引物Grof和Gror。將上述引物分別配制成濃度為10 Mfflol/L的溶液作為試劑盒，備用。3.再是基因組DNA的提取(現(xiàn)有技術)
1)取魚的肌肉組織剪碎后，用液氮充分研磨混勻。從中取約25 mg置于滅菌的1.5 mL 離心管中，按照QIAGEN DNeasy血液和組織DNA提取試劑盒制備樣品的基因組DNA溶液。2)加入180 μ ATL緩沖液和20 PL蛋白酶K，漩渦混勻，56 °C水浴約1 h，并不斷搖動，至組織完全消化。3)加入200 μ AL緩沖液，漩渦混勻。加入200 μ 無水乙醇，再次混勻。4)將離心管中的溶液轉(zhuǎn)移至置于2 mL收集管中的DNeasy Mini spin column柱中，12 000 rpm離心1 min，棄收集管和管中的離心液體。5)將spin column柱套在新的2 mL收集管中，加入500 μ Affl緩沖液，12 000 rpm離心1 min，棄收集管和管中的離心液體。6)將spin column柱套在新的2 mL收集管中，加入500 μ AW2緩沖液，12 000 rpm離心3 min，棄收集管和管中的離心液體。7)將spin column柱置于新的1. 5 mL離心管中，加入100 μ 65 °C預熱的AE緩沖液溶解DNA，室溫靜置2 min。8)12 000 rpm離心2 min。離心管中的液體即為提取的DNA模板。檢測DNA濃度及質(zhì)量(DNA濃度不低于0.05 mg/L), - 20 °C保存?zhèn)溆谩?.再是PCR擴增 DPCR反應體系和反應條件
以上述提取的基因組DNA為模板，進行PCR反應。PCR反應體系為25 μ L，即在0.2 mL的PCR反應管中加入2. 5μ L 10XPCR緩沖液，2. 5 μ L MgCl2 (25 mmol/L),2. 5 μ L dNTP (2.5 mmol/L),0. 2 μ L DNA 聚合酶(5 U/ μ L), 1 μ L Grof (10 ymol/L),l μ L Gror (10 ymol/L),l μ L 基因組 DNA, 14. 3 μ L 超純水
將樣品管放入PTC-200 PCR儀(美國Bio-feid公司)，設置反應條件為95 °C，5 min ；94 "C 1 min, 60 "C 30 s，72 "C 20 s，共 40 個循環(huán)；72 "C 延伸 7 min。2 ) PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測
用IXTAE電泳緩沖液制備廣1.5 %的瓊脂糖凝膠。取10 UL PCR擴增產(chǎn)物與1 μ L 10Χ上樣緩沖液混合后，在凝膠板上的孔中點樣。用100 bp的DNA Marker做分子量標記。 設置電壓(3V/cnT5V/cm)，電泳時間為50 min 60 min。用凝膠成像儀(Alpha Imager EP) 拍照記錄。采用上述正向引物Grof和反向引物Gror特異性PCR擴增的石斑魚16S基因片段長度為323 bp，根據(jù)樣品是否產(chǎn)生323 bp的PCR擴增條帶判定樣品中是否含有石斑魚成分。3)用于石斑魚成分鑒別的PCR方法的特異性確定
取不同品種石斑魚10份，其他常見魚類30份，按上述方法分別提取基因組DNA，并進行 PCR擴增，凝膠電泳檢測結(jié)果。結(jié)果顯示10個石斑魚品種均特異性產(chǎn)生323 bp的擴增條帶，檢測結(jié)果如圖1所示。其他30種魚中均未產(chǎn)生323 bp的擴增條帶。表明建立的PCR 方法具有良好的特異性，可用于石斑魚成分的檢測。
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4)用于石斑魚成分鑒別的PCR方法的靈敏度確定
將青石斑魚組織與花鱸組織混合，配制成青石斑魚相對百分含量(W/V)為10 %、5 %、1 %、0. 5 %、0. 1 %、0.05 %、0.01 %的魚類組織樣品，按實施例2方法分別提取基因組DNA，再按實施例3的方法進行PCR擴增，凝膠電泳檢測結(jié)果。檢測結(jié)果如圖2所示。表明建立的 PCR方法可從石斑魚含量為0.05 %的樣品中成功檢測出石斑魚。具有較高的靈敏度，符合檢測的要求。
權利要求
1.一種用于石斑魚成分鑒別的特異性寡核苷酸引物，由正向引物Grof和反向引物 Gror組成，所述正向引物的堿基序列為SEQ ID No. 1，所述反向引物的堿基序列為SEQ ID No. 2。
2.一種用于石斑魚成分鑒別的PCR檢測試劑盒，其特征在于含有權利要求1所述引物的試劑盒。
3.一種用于石斑魚成分鑒別的PCR檢測方法，其特征在于以樣品基因組DNA為模板， 利用權利要求1所述的特異性寡核苷酸引物進行PCR擴增，反應結(jié)束后凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，根據(jù)是否出現(xiàn)323 bp的特異性PCR擴增條帶判定結(jié)果。
4.如權利要求3所述的一種用于石斑魚成分鑒別的PCR檢測方法，其特征在于所述的PCR反應體系為25 μ L，即在0.2 mL的PCR反應管中加入2. 5μ L IOXPCR緩沖液，2. 5 μ L MgCl2 (25 mmol/L),2. 5 μ L dNTP (2.5 mmol/L),0. 2 μ L DNA 聚合酶(5 U/μ L), 1 μ L Grof (10 ymol/L),l μ L Gror (10 ymol/L),l μ L 基因組 DNA，14. 3 μ L 超純水； 反應條件為95 "C, 5 min ；94 "C 1 min，60 "C 30 s，72 "C 20 s，共 40 個循環(huán)；72 "C 延伸 7 min。
5.如權利要求3所述的一種用于石斑魚成分鑒別的PCR檢測方法，其特征在于所述的判定結(jié)果是根據(jù)電泳出現(xiàn)323 bp的特異性PCR擴增條帶作為檢出石斑魚成分的結(jié)論。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于石斑魚成分鑒別的特異性寡核苷酸引物、PCR檢測試劑盒和檢測方法，所述引物對由正向引物Grof和反向引物Gror組成，其核苷酸序列見SEQIDNo.1和SEQIDNo.2。本發(fā)明具有引物特異性好，檢測方法快速準確的特點，為進出口魚類食品安全提供了保證。
文檔編號C12N15/11GK102373283SQ201110356939
公開日2012年3月14日 申請日期2011年11月11日 優(yōu)先權日2011年11月11日
發(fā)明者周昱, 徐敦明, 王嘉鶴, 陳偉玲, 陳雙雅 申請人:廈門出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心