專利名稱：大鯢病毒性出血病細胞培養(yǎng)滅活疫苗及制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防控領域，具體涉及到一種大鯛病毒性出血病的細胞培養(yǎng)滅活疫苗，同時還涉及該滅活疫苗的制備方法，以及該大鯢病毒性出血病細胞培養(yǎng)滅活疫苗的用途。本發(fā)明所用的鯉上皮瘤細胞系(EPC)由武漢大學保藏中心保藏，保藏號為
CCTCCGDC0174 ;大鯢病毒性出血病毒病原-大鯢虹彩病毒由本實驗室從患典型出血病的
大鯢體內(nèi)分離并鑒定，由武漢大學保藏中心保藏，保藏號為CCTCC V201134。
背景技術：
大鯛(Chinese giant salamander)是我國特有的珍稀水生兩棲類動物,俗稱“娃娃魚”，屬于國家二級保護動物。大鯢肉質細嫩、營養(yǎng)豐富，并且具有很高的藥用價值，也是 水生動物向陸生動物過渡的類型，對研究物種進化有重要意義。隨著國家對大鯢人工繁育馴養(yǎng)以及經(jīng)營利用的許可，目前大鯢已經(jīng)成為一種珍貴的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種，在全國20多個省市都有養(yǎng)殖，市售價格約在2400元/kg，養(yǎng)殖效益非常可觀。同時，由于大鯢養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模的不斷增加和集約化程度的提高，疾病成為制約養(yǎng)殖更大發(fā)展的瓶頸。近5年來，許多養(yǎng)殖場都暴發(fā)了大鯢病毒性出血病。該病傳染性強且死亡率高,對大鯢養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。我們通過病原學研究發(fā)現(xiàn)，此病由大鯢虹彩病毒感染引起，并分離鑒定了大鯢虹彩病毒。該病目前尚無有效的藥物治療方法。疫苗免疫被認為是控制水生動物病毒性傳染性疾病的最佳手段。建立大鯢病毒性出血病細胞培養(yǎng)滅活疫苗的制備方法，制備大鯢病毒性出血病細胞培養(yǎng)滅活疫苗，對于開展疫苗的規(guī)?；a(chǎn)與病害的免疫預防有重要意義。細胞培養(yǎng)滅活疫苗由于其生產(chǎn)成本低、工藝簡單且安全性能好，可廣泛應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中疾病的防控。目前尚未見到大鯢病毒性出血病細胞培養(yǎng)滅活疫苗的相關報道，本發(fā)明首次利用魚類細胞系，建立了一種高效、安全、可規(guī)模生產(chǎn)的大鯢病毒性出血病細胞培養(yǎng)滅活疫苗的制備方法，并制備出大鯢病毒性出血病細胞培養(yǎng)滅活疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種大鯢病毒性出血病細胞培養(yǎng)滅活疫苗，該疫苗含完整的病毒抗原蛋白，在效價為105TCID5Q/ml時免疫效果好。此外用亞硫酸鈉NaSO3中和殘余福爾馬林，消除了滅活劑自身的毒性，提高了疫苗的安全性。本發(fā)明提供了一種大鯢病毒性出血病細胞培養(yǎng)滅活疫苗的制備方法。本發(fā)明制備疫苗的生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)工藝簡單，獲得疫苗的數(shù)量多，疫苗的安全性與免疫原性好，該方法使用0.2% (V/V)的滅活劑福爾馬林于37°C滅活48-72小時即可達到完全滅活病毒的目的。該方法簡單快捷，滅活徹底，并且不破壞抗原蛋白的完整性。本發(fā)明還有一個目的是在于提供了一種大鯢病毒性出血病細胞培養(yǎng)滅活疫苗在制備治療或預防大鯢病毒性出血病藥物中的應用。通過應用該疫苗對大鯢苗種進行注射免疫，其免疫保護率達82 %，浸泡免疫的保護率達73 %。
為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術措施大鯢病毒性出血病細胞培養(yǎng)滅活疫苗的制備方法，其步驟是A. EPC細胞復蘇取液氮中保存的EPC細胞，37°C溫育2 3分鐘使其融化，加入含10% (V/V)小牛血清的 MEM (Eagle' s minimum essential medium, Sigma)培養(yǎng)液(5ml/T25培養(yǎng)瓶，pH7. 2 7. 5)，轉移至培養(yǎng)瓶中25 26°C靜置6 8小時培養(yǎng)，待細胞貼壁后換新鮮培養(yǎng)液。在細胞培養(yǎng)2 3天鋪滿培養(yǎng)瓶底后，用胰蛋白酶消化法進行傳代培養(yǎng)。B. EPC細胞培養(yǎng)取長滿單層的鯉魚上皮瘤細胞2瓶，在無菌超凈臺里吸棄舊培養(yǎng)基，每瓶添加2ml濃度為0. 25% (V/V)胰酶消化液，在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細胞解離形成單個細胞后，迅速添加2ml含10% (V/V)小牛血清的MEM培養(yǎng)基中和胰酶，用移液管輕吹細胞瓶底，收集細胞懸液至15ml離心管里，1000r/min離心5min。離心結束后，吸棄上上清液，添加4-6ml含10% (V/V)小牛血清的MEM培養(yǎng)基懸浮細胞沉淀。取4個T25細胞培養(yǎng)瓶，每 瓶加4ml新鮮配置的培養(yǎng)基再添加1-1. 5ml細胞懸液，置于25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞形成匯合單層后，用于擴增大鯢虹彩病毒。C. GSIV病毒擴增待EPC傳代細胞在瓶底鋪滿時，吸出培養(yǎng)液，然后按1/10的培養(yǎng)基體積加入感染的病毒懸液，病毒的感染復數(shù)MOI (Multiplicity of infection)為I 5PFU/cell，在病毒吸附細胞40 60分鐘后，補加含2% (V/V)小牛血清的MEM(pH7. 2
7.5)維持液進行病毒增殖。D. GSIV病毒的收獲病毒連續(xù)培養(yǎng)3-6天，在顯微鏡下觀察，待鯉魚上皮瘤細胞出現(xiàn)典型細胞病變效應時，立即將T25細胞瓶置于_80°C冰箱凍存，結凍后取出細胞瓶放室溫(20-25°C,以下相同)慢慢溶解，如此反復凍融兩次，在超凈臺里用移液管輕吹培養(yǎng)瓶壁，將病毒感染的細胞懸液裝入50ml無菌離心管里，以4000r/min離心20min，收集離心后上清液，即獲得擴增病毒液，用于后續(xù)滴度實驗以及滅活疫苗制備。E.病毒滴度測定將待測病毒液進行一系列10倍稀釋(KT1 10_1(1)，按上述病毒增殖方法在96孔板上感染EPC細胞。在病毒感染24 120小時內(nèi)，每天觀察細胞病變情況并記錄。按Reed-Muench法計算病毒滴度TCID5tl值。此病毒滴度即為滅活疫苗的效價。F. GSIV病毒的滅活取IOOml大鯢虹彩病毒原液，加入0. 2ml福爾馬林，使其終濃度為0. 2% (V/V)，混合均勻后置于37°C條件下滅活48-72h，待滅活結束后添加終濃度為
0.05%的亞硫酸鈉中和殘余福爾馬林，即獲得大鯢虹彩病毒滅活疫苗原液，并置于4°C冰箱保存?zhèn)溆?。G.滅活病毒疫苗的使用將滅活好的疫苗用魚用生理鹽水(0. 65% )稀釋至效價為105TCID5(l/ml，即得到可直接使用的大鯢細胞培養(yǎng)滅活疫苗。3、大鯢病毒性出血病毒病原-大鯢虹彩病毒由本實驗室從患典型出血病的大
鯛體內(nèi)分離并鑒定，大鯛屬；中國大鯛(Andrias davidianus);娃病毒屬大鯛虹彩病毒；武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏單位；保藏號CCTCC V201134。所述的大鯢病毒性出血病細胞培養(yǎng)滅活疫苗含有鯉上皮瘤細胞系(EPC)，CCTCC⑶C0174。本疫苗具有如下特征I.本疫苗對EPC細胞和健康大鯢不具感染力。2.本疫苗含有GSIV病毒的全部完整蛋白。3.本疫苗效價為 105TCID5Q/ml。
4.本疫苗無菌、無滅活劑殘留。5.本疫苗為紅色澄清液體，pH7. 0 7. 5。6.本疫苗只對大鯢病毒性出血病有效。滅活疫苗的安全性檢驗I)滅活效果檢驗取制備好的疫苗按上述病毒增殖的方法接種EPC細胞，同時設置陰性對照，觀察5 6天，若出現(xiàn)細胞病變效應則表明病毒滅活不完全；若未見細胞病變效應，再盲傳2次,若盲傳出現(xiàn)細胞病變,則表明病毒滅活仍不完全，若盲傳2次均未出現(xiàn)細胞病變，則表明病毒滅活完全，疫苗安全。將盲傳未出現(xiàn)細胞病變效應的細胞培養(yǎng)物置_80°C -室溫凍融2次，采用病毒核酸提取試劑盒提取病毒核酸，用針對病毒外衣殼蛋白
基因(MCP)設計的多聚酶鏈式反應(PCR)引物進行病毒核酸的PCR檢測，同時設置陽性病毒核酸對照。如果從盲傳培養(yǎng)病毒材料中的病毒核酸檢測結果為陰性，則說明病毒被徹底滅活。2)無菌檢驗取上述制備好的疫苗，接種腦浸液細菌培養(yǎng)基(BHI)平板，用劃線法涂平板后于37°C培養(yǎng)15天，若有菌落生長，則表明疫苗有細菌污染，需用0. 22iim濾膜過濾除菌后使用；若無菌落生長，則表明疫苗是無菌的。3)魚體安全性實驗取上述制備好的疫苗,注射健康I 2齡大鯢30尾體長10 20cm)，注射劑量為0. 3 0. 5ml/尾，陰性對照注射相同劑量的生理鹽水。飼養(yǎng)15 30天，若疫苗組出現(xiàn)死亡，而陰性對照組未出現(xiàn)死亡，表明疫苗不安全；若疫苗組和陰性對照組均未見死亡，則表明疫苗安全。一種大鯢病毒性出血病細胞培養(yǎng)滅活疫苗在制備治療或預防大鯢病毒性出血病藥物中的應用。滅活疫苗的保護效果評估的步驟是I.取健康的I 2齡大鯢30尾(體長10 20cm)于20°C室內(nèi)飼養(yǎng)10天，分組每尾注射0. 3 0. 5ml不同稀釋度的滅活疫苗，同時用MEM細胞培養(yǎng)液注射相同數(shù)量的大鯢作為陰性對照，20°C飼養(yǎng)10天后，隨意從每組中取出一部分魚采血做血清中和試驗，測定免疫魚與對照魚的血清中和抗體水平；2.將每組中的另一部分魚以強毒攻擊，測定其免疫保護率。經(jīng)試驗測定，免疫魚中和抗體效價為I : 1024 ;免疫保護率高達82%。在較大規(guī)模的免疫保護效果測定試驗中，用大鯢病毒性出血病細胞培養(yǎng)滅活疫苗(效價為105TCID5(l/ml)按每尾0. 2ml的劑量浸泡免疫1000尾大鯢(規(guī)格5 10cm，另設對照組100尾，養(yǎng)殖水浸泡)，正常飼養(yǎng)6個月后，免疫組成活率達到73%，對照組成活率為40%，相對免疫保護力達到55%。表明用福爾馬林滅活的病毒疫苗注射和浸泡途徑對大鯢進行免疫，均有很強的保護保護力，可以有效預防大鯛病毒性出血病。本發(fā)明與傳統(tǒng)滅活疫苗相比，具有以下主要優(yōu)點I.制備方法簡單快捷、操作方便，適于規(guī)?；可a(chǎn)和應用。2.疫苗免疫原性好，免疫保護力高。3.病毒滅活徹底，安全性高。4.可進行浸泡和注射免疫。浸泡免疫的保護率達73%，注射免疫保護率達82%。5.具有商品化推廣價值，與免疫佐劑同時使用可進一步提供魚體免疫保護率。
具體實施例方式實施例I :大鯢虹彩病毒GSIV的制備方法，其步驟是A. EPC細胞培養(yǎng)取液氮中保存的EPC細胞，37°C溫育2 3分鐘融化，加入含10%(V/V)小牛血清的MEM培養(yǎng)液(5ml/T25培養(yǎng)瓶，pH 7. 2 7. 5)，轉移至培養(yǎng)瓶中26°C培養(yǎng)6 8小時，待細胞貼壁后換新鮮培養(yǎng)液。細胞培養(yǎng)2 3天鋪滿培養(yǎng)瓶底后，采用0. 1%
0.5%的胰蛋白酶消化貼壁細胞，進行傳代培養(yǎng)。所述的培養(yǎng)基為MEM(Eagle' s minimumessential medium) Sigma 公司。B. GSIV病毒制備待傳代后的EPC細胞在培養(yǎng)瓶底覆蓋率達80%以上時，去掉培養(yǎng)液，然后按1/10的培養(yǎng)基體積加入感染的病毒懸液，病毒的感染復數(shù)MOI (Multiplicityofinfection)為I 5PFU/cell，在病毒吸附細胞40 60分鐘后，補加含2 % (V/V)小 牛血清的MEM(pH7或7. 2 7. 5)維持液進行病毒增殖。所述的培養(yǎng)基為MEM(Eagle' sminimum essential medium) Sigma 公司。C. GSIV病毒的收獲在病毒感染48 72h期間，細胞病變效應達80%時收獲病毒，-80°C至室溫凍融2次，4°C條件下4000rpm離心20分鐘，取上清。此上清即為制備滅活疫苗的GSIV病毒液，于_80°C保存?zhèn)溆?。D.病毒滴度測定將待測病毒懸液進行一系列10倍稀釋(KT1 10_1(1)，按上述病毒增殖方法在96孔板上感染EPC細胞。在病毒感染24 120小時，分別觀察細胞病變情況。按Reed-Muench法計算病毒滴度TCID5Q。此病毒滴度即為滅活疫苗的效價。本發(fā)明所用的鯉上皮瘤細胞系(EPC)由武漢大學保藏中心保藏，保藏號為=CCTCC⑶C0174 ；實施例2 大鯢病毒性出血病細胞培養(yǎng)滅活疫苗的制備方法，其步驟是A. GSIV病毒的滅活取保存于_80°C的GSIV純化病毒液于室溫融化,加入福爾馬林溶液使其終濃度為0. 2%% (V/V)，混合均勻后置于37°C條件下滅活48-72h滅活結束后，添加終濃度為0. 05%的亞硫酸鈉中和殘余福爾馬林，即獲得大鯢虹彩病毒滅活疫苗原液，并置于4°C冰箱保存?zhèn)溆?。B.將滅活好的疫苗用生理鹽水(0. 65% )稀釋至效價為105TCID5Q/ml，得到可供直接使用的大鯢虹彩病毒細胞培養(yǎng)福爾馬林滅活疫苗。C.滅活疫苗的安全性檢驗I)滅活效果取上述制備好的疫苗，按上述病毒增殖的方法接種EPC細胞，同時設置陰性對照，觀察5 6天，若出現(xiàn)細胞病變效應，則表明病毒滅活不完全；若未見細胞病變效應，再盲傳2次,若盲傳出現(xiàn)細胞病變,則表明病毒滅活仍不完全，若盲傳2次均未出現(xiàn)細胞病變，則表明病毒滅活完全，疫苗安全。將盲傳未出現(xiàn)細胞病變效應的細胞培養(yǎng)物置_80°C -室溫凍融2次，采用病毒核酸提取試劑盒提取病毒核酸，用針對病毒外衣殼蛋白基因(MCP)設計的多聚酶鏈式反應(PCR)引物進行病毒核酸的PCR檢測，同時設置陽性病毒核酸對照。如果從盲傳培養(yǎng)病毒材料中的病毒核酸檢測結果為陰性，則說明病毒被徹底滅活。2)無菌檢驗取上述制備好的疫苗，接種腦浸出液細菌培養(yǎng)基平板，涂平板后于37°C培養(yǎng)15天，若有菌落生長，則表明疫苗有細菌污染，需用0. 22 ii m濾膜過濾除菌后使用；若無菌落生長，則表明疫苗是無菌的。魚體實驗取上述制備好的疫苗，注射健康大鯢30尾，注射劑量為0. 3 0. 5ml/尾，同時注射魚用生理鹽水作為陰性對照。飼養(yǎng)15天，若疫苗組出現(xiàn)死亡，而陰性對照組未出現(xiàn)死亡，表明疫苗不安全；若疫苗組和陰性對照組均未見死亡，則表明疫苗安全。大鯢病毒性出血病毒病原——大鯢虹彩病毒由本實驗室從患典型出血病的大鯢體內(nèi)分離并鑒定，由武漢大學保藏中心保藏，保藏號為CCTCC V201134。一種大鯢病毒性出血病細胞培養(yǎng)滅活疫苗，所述的滅活疫苗中含有鯉上皮瘤細胞系(EPC)，CCTCC⑶C0174。實施例3 一種大鯢病毒性出血病細胞培養(yǎng)滅活疫苗在制備治療或預防大鯢病毒性出血病藥物中的應用，其具體步驟是A.實驗室小規(guī)模實驗健康的大鯢(體長10 20cm)于室內(nèi)飼養(yǎng)10天后，分組每尾注射0. 3 0. 5ml不同稀釋度的滅活疫苗，同時用MEM細胞培養(yǎng)液注射另一批魚做陰 性對照，20°C飼養(yǎng)10天后，隨意從每組中取出一部分魚采血做血清中和試驗，測定免疫魚與對照魚的血清中和抗體水平；將每組中的另一部分魚以強毒攻擊測定其免疫保護率。經(jīng)試驗測定，其中和抗體效價為I : 1024 ;保護率高達82%。B.較大規(guī)模實驗用大鯢出血病細胞培養(yǎng)滅活疫苗(效價為IO5TCID5cZml)按每尾0. 2ml的劑量浸泡免疫1000尾大鯢魚種(規(guī)格10 20cm，另設對照組100尾，養(yǎng)殖水浸泡)，正常飼養(yǎng)6個月后，統(tǒng)計實驗組與對照組實驗魚的成活率。實驗結果顯示，免疫組成活率達到73%，對照組成活率為40%，相對免疫保護力達到55%。C.以上兩實驗結果表明，用福爾馬林滅活的大鯢病毒性出血病細胞培養(yǎng)滅活疫苗以注射和浸泡途徑對大鯢進行免疫，均有很強的保護保護力，可以有效預防大鯢病毒性出血病。
權利要求
1.一種大鯢病毒性出血病細胞培養(yǎng)滅活疫苗，其特征在于中國大鯢(Andriasdavidianus)，CCTCC V201134。
2.根據(jù)權利要求I所述的一種大鯢病毒性出血病細胞培養(yǎng)滅活疫苗，其特征在于所述的滅活疫苗含有鯉上皮瘤細胞系(EPC)，CCTCC⑶C0174。
3.權利要求I所述的一種大鯢病毒性出血病細胞培養(yǎng)滅活疫苗的制備方法，其步驟是 A.EPC細胞復蘇取液氮中保存的EPC細胞，37°C溫育2 3分鐘使其融化，加入含10%V/V小牛血清的MEM培養(yǎng)液5ml/T25培養(yǎng)瓶，pH7. 2 7. 5，轉移至培養(yǎng)瓶中25 26°C靜置6 8小時培養(yǎng)，在細胞培養(yǎng)2 3天鋪滿培養(yǎng)瓶底后，用胰蛋白酶消化法進行傳代培養(yǎng)； B.EPC細胞培養(yǎng)取長滿單層的鯉魚上皮瘤細胞，在無菌超凈臺里吸棄舊培養(yǎng)基，每瓶添加2ml濃度為0. 25% V/V胰酶消化液，添加2ml含10% V/V小牛血清的MEM培養(yǎng)基中和胰酶，用移液管輕吹細胞瓶底，收集細胞懸液至15ml離心管里，1000r/min離心5min，離心結束后，吸棄上上清液，添加4-6ml含10% V/V小牛血清的MEM培養(yǎng)基懸浮細胞沉淀，取4個T25細胞培養(yǎng)瓶，每瓶加4ml新鮮配置的培養(yǎng)基再添加1-1. 5ml細胞懸液，置于25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞形成匯合單層后，用于擴增大鯢虹彩病毒； C.GSIV病毒擴增待EPC傳代細胞在瓶底鋪滿時，吸出培養(yǎng)液，然后按1/10的培養(yǎng)基體積加入感染的病毒懸液，病毒的感染復數(shù)MOI為I 5PFU/cell，在病毒吸附細胞40 60分鐘后，補加含2% V/V小牛血清的MEM維持液進行病毒增殖； D.GSIV病毒的收獲病毒連續(xù)培養(yǎng)3-6天，在顯微鏡下觀察，待鯉魚上皮瘤細胞出現(xiàn)典型細胞病變效應時，將T25細胞瓶置于_80°C冰箱凍存，結凍后取出細胞瓶放室溫溶解，反復凍融兩次，在超凈臺里用移液管輕吹培養(yǎng)瓶壁，將病毒感染的細胞懸液裝入50ml無菌離心管里，以4000r/min離心20min，收集離心后上清液，獲得擴增病毒液，用于后續(xù)滴度實驗以及滅活疫苗制備； E.病毒滴度測定將待測病毒液進行一系列10倍稀釋KT1 10_1(1，在96孔板上感染EPC細胞，在病毒感染24 120小時內(nèi)，按Reed-Muench法計算病毒滴度TCID5tl值，病毒滴度為滅活疫苗的效價； F.GSIV病毒的滅活取IOOml大鯢虹彩病毒原液，加入0. 2ml福爾馬林，使其終濃度為0.2% V/V，混合均勻后置于37°C條件下滅活48-72h，待滅活結束后添加終濃度為0. 05%的亞硫酸鈉中和殘余福爾馬林，獲得大鯢虹彩病毒滅活疫苗原液，并置于4°C冰箱保存?zhèn)溆茫? G.滅活病毒疫苗的使用將滅活好的疫苗用魚用生理鹽水0.65%稀釋至效價為105TCID5(l/ml，得到直接使用的大鯢細胞培養(yǎng)滅活疫苗。
4.權利要求I所述的一種大鯢病毒性出血病細胞培養(yǎng)滅活疫苗在制備治療或預防大鯢病毒性出血病藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種大鯢病毒性出血病細胞培養(yǎng)滅活疫苗及制備方法和應用，其步驟A．EPC細胞復蘇；B．EPC細胞培養(yǎng)，用于擴增大鯢虹彩病毒；C．GSIV病毒擴增待EPC傳代細胞在瓶底鋪滿時，加入感染的病毒懸液；D．GSIV病毒的收獲病毒連續(xù)培養(yǎng)，獲得擴增病毒液，用于后續(xù)滴度實驗以及滅活疫苗；E．病毒滴度測定，病毒滴度為滅活疫苗的效價；F．GSIV病毒的滅活獲得大鯢虹彩病毒滅活疫苗原液，置于冰箱保存；G．滅活病毒疫苗將滅活好的疫苗用魚用生理鹽水稀釋，得到大鯢細胞培養(yǎng)滅活疫苗。滅活疫苗在制備治療或預防大鯢病毒性出血病藥物中的應用。方法簡單、操作方便，病毒滅活徹底，安全性高。浸泡免疫的保護率達73%，注射免疫保護率達82%。
文檔編號C12N7/06GK102764432SQ201110357360
公開日2012年11月7日 申請日期2011年11月11日 優(yōu)先權日2011年11月11日
發(fā)明者周勇, 孫建濱, 孟彥, 曾令兵, 肖漢兵, 肖藝, 馬杰, 高正勇 申請人:中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所