專利名稱：生產(chǎn)水牛誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及干細(xì)胞領(lǐng)域，尤其是一種生產(chǎn)水牛誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
1981年，Evans等建立了來(lái)源于小鼠囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)的ES(胚胎干細(xì)胞)細(xì)胞系。20世紀(jì)90年代，Thomson等也獲得了人類和靈長(zhǎng)類的ES細(xì)胞系。胚胎干細(xì)胞具有兩大特殊屬性，一是保持無(wú)限增殖和自我更新的能力；二是具有分化形成各種組織細(xì)胞的潛力，即分化成包括三個(gè)胚層在內(nèi)的各種組織和細(xì)胞。鑒于人類胚胎干細(xì)胞的特殊屬性，在再生醫(yī)學(xué)等方面具有廣闊的應(yīng)用前景，如通過(guò)干細(xì)胞移植、定向分化和組織再生，可以促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)和疾病治療。由于人類胚胎干細(xì)胞的獲得存在著對(duì)早期胚胎的損害等倫理問(wèn)題， 故許多研究者通過(guò)對(duì)大家畜ES細(xì)胞的研究，把有蹄類家畜ES細(xì)胞作為人類疾病模型，因?yàn)檫@些有蹄類家畜(如豬和牛)的體型、器官大小、解剖學(xué)特性等生理特征與人類相似。此外， 家畜ES研究也具有其本身的價(jià)值，家畜的ES細(xì)胞可以作為精確基因操作的靶細(xì)胞，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)家畜的定向遺傳改良，造福于人類。近20年來(lái)，有蹄類家畜ES的報(bào)道很多，包括羊、馬、 牛、豬、水牛等。然而，綜合此類報(bào)道，這些家畜的ES細(xì)胞都命名為“ES-樣”細(xì)胞，沒(méi)有得到真正的家畜ES細(xì)胞系，家畜ES細(xì)胞建系仍然困難。鑒于人類ES細(xì)胞獲得所面臨的倫理問(wèn)題和家畜ES細(xì)胞建系困難等問(wèn)題，需要建立一種獲得人類和家畜類胚胎干細(xì)胞的新途徑。2006年，Yamanaka等采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體攜帶四個(gè)轉(zhuǎn)錄因子0Ct4、SOX2、Klf4、C-MyC將小鼠體細(xì)胞直接重編程為多能干細(xì)胞。隨后， 許多研究都表明轉(zhuǎn)錄因子0ct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、Lin28、E-cadherin等可以將不同物種的不同細(xì)胞重編程為具有胚胎干細(xì)胞特性的多能干細(xì)胞。由此，人類誘導(dǎo)多能干細(xì)胞解決了胚胎損傷的倫理問(wèn)題，家畜誘導(dǎo)多能干細(xì)胞則解決了建系困難等問(wèn)題。目前一些家畜的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，如豬、羊等，可以傳至30-50代。特別是豬誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，嵌合體實(shí)驗(yàn)表明，豬誘導(dǎo)多能干細(xì)胞可以產(chǎn)生嵌合體后代且具有生殖遺傳能力，這將為家畜誘導(dǎo)多能干細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作，改良其生產(chǎn)和繁殖性能提供新的途徑。水牛主要分布我國(guó)南部地區(qū)，主要應(yīng)用于役力、肉食和產(chǎn)奶。水牛奶營(yíng)養(yǎng)尤為豐富，其蛋白、維生素及微量元素等均高于普通的牛奶。據(jù)統(tǒng)計(jì)，1公斤水牛奶所含營(yíng)養(yǎng)價(jià)值相當(dāng)于1. 85公斤黑白花牛奶。但是，水牛低繁殖率和低產(chǎn)奶量制約著水牛奶業(yè)的發(fā)展，亟待通過(guò)基因技術(shù)對(duì)水牛品種進(jìn)行改良。以胚胎干細(xì)胞為靶細(xì)胞的定點(diǎn)精確轉(zhuǎn)基因技術(shù)，是水牛定向遺傳改良的一種理想方法。Huang和George等人分別使用水牛囊胚分離培養(yǎng)出水牛 "ES-樣”細(xì)胞，并用此細(xì)胞作為轉(zhuǎn)基因靶細(xì)胞和核移植供體，分別得到了表達(dá)GFP的囊胚和克隆后代。然而，由于來(lái)源于胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的水牛ES細(xì)胞受材料限制、克隆形成率低、建系困難等因素制約，至今也未獲得真正的水牛胚胎干細(xì)胞系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種生產(chǎn)水牛誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法。
為解決上述技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明采用如下技術(shù)方案生產(chǎn)水牛誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，其特征在于主要包括以下步驟< 1 >特異性轉(zhuǎn)錄因子的克隆分別提取水牛生殖嵴和^3-T細(xì)胞的總RNA，采用 RT-PCR技術(shù)，克隆出水牛干細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子0ct4，Sox2, Klf4，c-Myc, Nanog, Lin28 和細(xì)胞永生化基因SV401arge T (LT)，分別連接到PMD-18T載體上，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證和多重序列比較后，確認(rèn)目的片段正確；<2>逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的構(gòu)建以pMX逆轉(zhuǎn)錄病毒載體為基本骨架，目的片段經(jīng)酶切后，連接到PMX載體上，構(gòu)建出生產(chǎn)水牛誘導(dǎo)干細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 pMX-0ct4-IRES-GFP, pMX_Sox2，pMX-Klf4, pMX-c-Myc，pMX-Nanog，pMX_Lin28，pMX-LT ；其中，為了檢測(cè)誘導(dǎo)過(guò)程中，外源轉(zhuǎn)基因的表達(dá)和沉默，將IRES-GFP連接到pMX-0ct4下游，在同一個(gè)啟動(dòng)子的作用下，同時(shí)表達(dá)0ct4和綠色熒光標(biāo)記基因GFP ；<3>病毒的包轉(zhuǎn)將攜帶特異性轉(zhuǎn)錄因子的載體分別與包膜質(zhì)粒pCMV-VSVG用脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染包裝Platinum-GP細(xì)胞；轉(zhuǎn)染48小時(shí)和72小時(shí)收集病毒上清液2次；新鮮的病毒上清或者經(jīng)過(guò)超速離心后，采用批量快速測(cè)定法(LaSRT)測(cè)定病毒滴度；其中，新鮮病毒的滴度為4X 106IU/mL，經(jīng)超離后可達(dá)IX 108IU/mL以上；<4>水牛誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的制備誘導(dǎo)的水牛體細(xì)胞為組織塊法分離和培養(yǎng)的水牛胎兒耳部成纖維細(xì)胞，將攜帶轉(zhuǎn)錄因子的病毒上清等比例混合，以不同的組合(OS，0SK, OSKM，OSKMT,OSKMNL,0SKMNLT)感染水牛胎兒成纖維細(xì)胞，確定能誘導(dǎo)出水牛干細(xì)胞的最佳組合；其中，未經(jīng)超離的病毒上清連續(xù)感染靶細(xì)胞2次，每次感染12h ；超離后的病毒上清采用1次感染20h ；經(jīng)病毒感染后的細(xì)胞，胰酶消化，以5X104的密度接種到預(yù)先經(jīng)過(guò)絲裂霉素處理好的小鼠胎兒成纖維細(xì)胞(MEFs)上，并改換含有白血病抑制因子(LIF)和成纖維樣生長(zhǎng)因子(bFGF)的干細(xì)胞培養(yǎng)基，每2-3天換液一次；在感染后12-18天，水牛誘導(dǎo)干細(xì)胞的初始克隆開(kāi)始形成；到18-M天克隆形態(tài)明顯，并表現(xiàn)出類似于小鼠胚胎干細(xì)胞(mES)樣的形態(tài)；挑取克隆，并用Iml的注射器針頭將克隆分成小塊，或者用胰酶消化成小塊之后接種到MEFs上繼續(xù)擴(kuò)增；水牛誘導(dǎo)干細(xì)胞分離和傳代的方法類似于人胚胎干細(xì)胞(hEQ的培養(yǎng)方法。特異性轉(zhuǎn)錄因子0ct4序列為序列表SEQ. ID. No. 1的堿基序列；特異性轉(zhuǎn)錄因子Sox2序列為序列表SEQ. ID. No. 2的堿基序列；特異性轉(zhuǎn)錄因子Klf4序列為序列表SEQ. ID. No. 3的堿基序列；特異性轉(zhuǎn)錄因子c-Myc序列為序列表SEQ. ID. No. 4的堿基序列；特異性轉(zhuǎn)錄因子Nanog序列為序列表SEQ. ID. No. 5的堿基序列；特異性轉(zhuǎn)錄因子LiM8序列為序列表SEQ. ID. No. 6的堿基序列；細(xì)胞永生化基因SV401arge T序列為序列表SEQ. ID. No. 7的堿基序列。本發(fā)明采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體攜帶特異性轉(zhuǎn)錄因子0ct4，Sox2，Klf4，c-Myc，Nanog， LiM8和細(xì)胞永生化基因SV40 large T (LT)，將水牛體細(xì)胞，如胎兒成纖維細(xì)胞，直接重編程為具有類似于胚胎干細(xì)胞特性的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。水牛誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的產(chǎn)生，可以提供一種獲得水牛干細(xì)胞的新途徑，可以在一定程度上彌補(bǔ)水牛胚胎干細(xì)胞難分離、難培養(yǎng)、 難建系的問(wèn)題，水牛誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的產(chǎn)生，更是為水牛干細(xì)胞信號(hào)通路及建系的研究提供干細(xì)胞來(lái)源，同時(shí)也為水牛定向遺傳改良提供一條新的途徑。


圖 1 是 RT-PCR 克隆水牛特異性轉(zhuǎn)錄因子 0ct4，Sox2, c_Myc，Klf4, Nanog, Lin28 電泳圖。圖2是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體攜帶水牛特異性轉(zhuǎn)錄因子載體構(gòu)建圖，圖中所示載體為 pMX-0ct4-IRES-GFP和pMX_Sox2，其他轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)載體和Sox2類似。圖3是水牛誘導(dǎo)多能干細(xì)胞形成過(guò)程不同時(shí)期細(xì)胞的形態(tài)圖。圖4是免疫熒光技術(shù)檢測(cè)水牛誘導(dǎo)多能干細(xì)胞表達(dá)AP，0ct4, Sox2, Nanog, E-Cadherin, SSEA-I, SSEA-4，TRA-1-81 結(jié)果圖。圖5是RT-PCR檢測(cè)水牛誘導(dǎo)多能干細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)基因0ct4，Sox2，Nanog， STAT3, GP130, F0XD3, E-Cadherin, bFGF 和 p53 結(jié)果圖。圖6是RT-PCR檢測(cè)水牛誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中外源轉(zhuǎn)基因沉默和表達(dá)結(jié)果圖，圖中 外源轉(zhuǎn)基因在biPSl和biPS2中完全沉默，在biPS3中部分表達(dá)。圖7是水牛誘導(dǎo)多能干細(xì)胞體外分化形成擬胚體(EB)細(xì)胞圖及表達(dá)三個(gè)胚層標(biāo)志基因電泳圖，圖中AFP，GATA4(內(nèi)胚層)、ACTA2 (中胚層)、TUBB3 (外胚層)。圖8是水牛誘導(dǎo)多能干細(xì)胞體內(nèi)分化形成畸胎瘤圖，圖中石蠟切片HE染色表明水牛誘導(dǎo)多能干細(xì)胞能分化為三個(gè)胚層的組織。
具體實(shí)施例方式—、水牛特異性轉(zhuǎn)錄因子的克隆及其逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道統(tǒng)計(jì)出0ct4，Sox2, c_Myc，Klf4，Nanog, Lin28在胎兒生殖嵴的原生殖干細(xì)胞中表達(dá)。Trizol法提取生殖嵴的總RNA，01igodT引物和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶5min, 42° lh，95° 5min)反轉(zhuǎn)得到的cDNA-20°保存?zhèn)溆?。采用特異性引物擴(kuò)取水牛誘導(dǎo)干細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的開(kāi)放性閱讀框(ORF)，所選用的引物，酶切位點(diǎn)，退火溫度如表1所示，各基因片段長(zhǎng)度如圖1所示。將PCR產(chǎn)物，膠回收，連接到pMDlS-T載體上，最后測(cè)序驗(yàn)證這些片段正確。本發(fā)明使用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體以pMX為骨架。根據(jù)載體上多克隆位點(diǎn)的酶切位點(diǎn)，雙酶切PMX載體和位于pMDIS-T上的目的片段，膠回收后，連接重組質(zhì)粒。最后用于誘導(dǎo)水牛多能干細(xì)胞的重組質(zhì)粒為pMX-0ct4-IRES-GFP，pMX_Sox2，pMX_Klf4，pMX-c-Myc， pMX-Nanog, pMX_Lin28，pMX-LT，如圖 2 所示。表IRT-PCR擴(kuò)取水牛特異性轉(zhuǎn)錄因子的引物和反應(yīng)條件
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)水牛誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，其特征在于主要包括以下步驟<1>特異性轉(zhuǎn)錄因子的克隆分別提取水牛生殖嵴和^3-T細(xì)胞的總RNA，采用RT-PCR 技術(shù)，克隆出水牛干細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子0ct4，Sox2, Klf4，c-Myc，Nanog, Lin28和細(xì)胞永生化基因SV401arge Τ,分別連接到PMD-18T載體上，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證和多重序列比較后，確認(rèn)目的片段正確；<2>逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體的構(gòu)建以ρΜΧ逆轉(zhuǎn)錄病毒載體為基本骨架，目的片段經(jīng)酶切后，連接到PMX載體上，構(gòu)建出生產(chǎn)水牛誘導(dǎo)干細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 pMX-0ct4-IRES-GFP, pMX_Sox2，pMX-Klf4, pMX-c-Myc，pMX-Nanog, pMX_Lin28，pMX-LT ；其中，為了檢測(cè)誘導(dǎo)過(guò)程中，外源轉(zhuǎn)基因的表達(dá)和沉默，將IRES-GFP連接到pMX-0ct4下游，在同一個(gè)啟動(dòng)子的作用下，同時(shí)表達(dá)0ct4和綠色熒光標(biāo)記基因GFP ；<3>病毒的包轉(zhuǎn)將攜帶特異性轉(zhuǎn)錄因子的載體分別與包膜質(zhì)粒pCMV-VSVG用脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染包裝platinum-GP細(xì)胞；轉(zhuǎn)染48小時(shí)和72小時(shí)收集病毒上清液2次；新鮮的病毒上清或者經(jīng)過(guò)超速離心后，采用批量快速測(cè)定法測(cè)定病毒滴度；其中，新鮮病毒的滴度為 4\106叨/!^，經(jīng)超離后可達(dá)1\108貝/11^以上；<4>水牛誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的制備誘導(dǎo)的水牛體細(xì)胞為組織塊法分離和培養(yǎng)的水牛胎兒耳部成纖維細(xì)胞，將攜帶轉(zhuǎn)錄因子的病毒上清等比例混合，以不同的組合OS，OSK, 0SKM, OSKMT, OSKMNL, 0SKMNLT感染水牛胎兒成纖維細(xì)胞，確定能誘導(dǎo)出水牛干細(xì)胞的最佳組合； 其中，未經(jīng)超離的病毒上清連續(xù)感染靶細(xì)胞2次，每次感染12h ；超離后的病毒上清采用1 次感染20h ；經(jīng)病毒感染后的細(xì)胞，胰酶消化，以5X IO4的密度接種到預(yù)先經(jīng)過(guò)絲裂霉素處理好的小鼠胎兒成纖維細(xì)胞上，并改換含有白血病抑制因子和成纖維樣生長(zhǎng)因子的干細(xì)胞培養(yǎng)基，每2-3天換液一次；在感染后12-18天，水牛誘導(dǎo)干細(xì)胞的初始克隆開(kāi)始形成；到 18-M天克隆形態(tài)明顯，并表現(xiàn)出類似于小鼠胚胎干細(xì)胞樣的形態(tài)；挑取克隆，并用Iml的注射器針頭將克隆分成小塊，或者用胰酶消化成小塊之后接種到MEFs上繼續(xù)擴(kuò)增。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)水牛誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，其特征在于 所述的特異性轉(zhuǎn)錄因子0ct4序列為序列表SEQ. ID. No. 1的堿基序列； 所述的特異性轉(zhuǎn)錄因子Sox2序列為序列表SEQ. ID. No. 2的堿基序列； 所述的特異性轉(zhuǎn)錄因子Klf4序列為序列表SEQ. ID. No. 3的堿基序列； 所述的特異性轉(zhuǎn)錄因子c-Myc序列為序列表SEQ. ID. No. 4的堿基序列； 所述的特異性轉(zhuǎn)錄因子Nanog序列為序列表SEQ. ID. No. 5的堿基序列； 所述的特異性轉(zhuǎn)錄因子LiM8序列為序列表SEQ. ID. No. 6的堿基序列；所述的細(xì)胞永生化基因SV401arge T序列為序列表SEQ. ID. No. 7的堿基序列。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種生產(chǎn)水牛誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的方法，采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體攜帶特異性轉(zhuǎn)錄因子Oct4，Sox2，Klf4，c-Myc，Nanog，Lin28和細(xì)胞永生化基因SV40large T(LT)，將水牛體細(xì)胞，如胎兒成纖維細(xì)胞，直接重編程為具有類似于胚胎干細(xì)胞特性的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。水牛誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的產(chǎn)生，可以提供一種獲得水牛干細(xì)胞的新途徑，可以在一定程度上彌補(bǔ)水牛胚胎干細(xì)胞難分離、難培養(yǎng)、難建系的問(wèn)題，水牛誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的產(chǎn)生，更是為水牛干細(xì)胞信號(hào)通路及建系的研究提供干細(xì)胞來(lái)源，同時(shí)也為水牛定向遺傳改良提供一條新的途徑。
文檔編號(hào)C12N15/12GK102433308SQ20111035969
公開(kāi)日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2011年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月14日
發(fā)明者劉慶友, 石德順, 羅嬋, 鄧彥飛 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)