專(zhuān)利名稱：一種抑制蛋白在水溶液中聚集并物性修飾的方法及產(chǎn)物和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品領(lǐng)域，涉及蛋白的物性修飾，特別涉及一種新型的抑制蛋白聚集的方法，以及這些修飾蛋白在食品領(lǐng)域的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)廣泛存在于動(dòng)植物中，其具有的營(yíng)養(yǎng)特性和功能特性(乳化性、起泡性、持水性等)使其在食品工業(yè)以及醫(yī)藥保健、飼料行業(yè)均得到了廣泛的應(yīng)用，其不僅對(duì)食品在制造、加工或保藏中的物理化學(xué)性質(zhì)起著重要的作用，還可以有效的提高產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。 但天然植物蛋白具有高疏水性，在某些食品體系中的應(yīng)用受到限制，因而需要對(duì)蛋白進(jìn)行物性修飾來(lái)提高其功能特性，擴(kuò)大其應(yīng)用領(lǐng)域。在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域，已經(jīng)對(duì)蛋白質(zhì)聚集和影響蛋白質(zhì)聚集的因素有了廣泛的研究，如高溫(熱處理)、高鹽或低酸等因素常常誘發(fā)蛋白質(zhì)聚集。這是因?yàn)榈鞍追肿拥囊恍┓磻?yīng)基團(tuán)在水溶液中由于分子內(nèi)作用力以及疏水相互作用被包埋于結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，而熱處理能使其從分子內(nèi)部轉(zhuǎn)移到分子表面，從而因疏水相互作用等誘發(fā)蛋白聚集。但是熱處理又是蛋白制品加工過(guò)程中不可避免的單元操作，如熱殺菌、噴霧干燥等。因此目前如何控制蛋白質(zhì)在熱處理過(guò)程中或高鹽、低酸性條件下的聚集行為成為蛋白質(zhì)領(lǐng)域的研究難點(diǎn)。近幾年有文獻(xiàn)報(bào)道蛋白質(zhì)的聚集和許多有害基因疾病的關(guān)系，說(shuō)明探討蛋白質(zhì)聚集行為的控制不僅在食品領(lǐng)域，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域同樣具有非常重要的理論和實(shí)際意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種新型的抑制蛋白在水溶液中聚集的方法，同時(shí)得到一種功能性良好的蛋白物性修飾產(chǎn)物，使其兼具蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)和糖的穩(wěn)定作用，以作為食品添加劑應(yīng)用于食品生產(chǎn)中。本發(fā)明模擬生命科學(xué)領(lǐng)域的大分子擁擠體系，將多糖和蛋白質(zhì)處于加入高分子惰性擁擠試劑聚乙二醇的大分子擁擠環(huán)境中，體系中的擁擠試劑為多糖和惰性高聚物聚乙二醇，蛋白能夠處于少聚集的反應(yīng)狀態(tài)，同時(shí)對(duì)蛋白進(jìn)行物性修飾，以改善蛋白功能特性，擴(kuò)大其應(yīng)用范圍。該法具有操作方便、性能穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，方法具有良好的工業(yè)化、規(guī)?；膽?yīng)用前景及有利于食品及醫(yī)用放大生產(chǎn)，其對(duì)于擴(kuò)展蛋白的應(yīng)用空間具有相當(dāng)重要的實(shí)際意義。本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種抑制蛋白在水溶液中聚集并物性修飾的方法，包括以下步驟(1)將蛋白用緩沖液溶解，蛋白的質(zhì)量份數(shù)為1 10份，緩沖溶液是pH6. 0 8. 0 的0. OlM 0. 2M的任意緩沖鹽體系；(2)將大分子擁擠試劑加入步驟(1)的溶液中混勻，在60 95°C的恒溫磁力攪拌器中攪拌4 30h后，冰浴迅速冷卻至室溫；所述大分子擁擠試劑為包括多糖和惰性擁擠試劑聚乙二醇在內(nèi)的大分子物質(zhì)的混合物；
(3)將步驟(2)得到的產(chǎn)物離心，除去不溶物；(4)將步驟C3)得到的產(chǎn)物透析以除去惰性擁擠試劑聚乙二醇及其它小分子物質(zhì)，得到少聚集的蛋白物性修飾產(chǎn)物。優(yōu)選地，步驟( 所述大分子擁擠試劑的總質(zhì)量份數(shù)為10 40份，多糖與聚乙二醇的質(zhì)量比為1 1 1 3。優(yōu)選地，步驟(1)所述蛋白為大豆7S球蛋白、大豆分離蛋白、乳清蛋白、β-乳球蛋白或牛血清白蛋白BSA。優(yōu)選地，步驟( 所述多糖為葡聚糖、卡拉膠、瓜爾豆膠和可溶性淀粉中的一種或一種以上。優(yōu)選地，步驟⑵所述惰性擁擠試劑聚乙二醇為PEG2000、PEG3000、PEG3350或 PEG4000。優(yōu)選地，步驟(3)所述離心速度為3000 5000rpm，離心時(shí)間為20 30min。優(yōu)選地，步驟(4)所述透析溫度為4°C，時(shí)間為M 48h。本發(fā)明所述的方法來(lái)抑制蛋白質(zhì)的聚集，同時(shí)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行物性修飾。所述的蛋白產(chǎn)物明顯抑制了蛋白宏觀聚集體的形成，是一種有效的蛋白質(zhì)去聚集方法，且產(chǎn)物水溶性、乳化性、起泡性等功能性質(zhì)有很大的提高。能用于制備改性蛋白、食品添加劑或醫(yī)藥行業(yè)中，尤其是產(chǎn)物經(jīng)純化后作為可溶性的蛋白添加劑應(yīng)用于酸性運(yùn)動(dòng)型飲料中或者作為新型乳化劑應(yīng)用于肉制品中。本發(fā)明原理如下本發(fā)明采用“大分子擁擠環(huán)境”作為生成蛋白物性修飾產(chǎn)物的反應(yīng)體系，通過(guò)將生命科學(xué)領(lǐng)域中擁擠理論對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的科學(xué)現(xiàn)象進(jìn)一步應(yīng)用于修飾蛋白的制備，當(dāng)體系中存在有高濃度的生物大分子時(shí)，大分子之間的反應(yīng)遵循分子排斥容積理論，促進(jìn)反應(yīng)向溶質(zhì)總體積減小的方向，即朝結(jié)合方向移動(dòng)；另外，大分子擁擠環(huán)境下蛋白分子構(gòu)型趨于穩(wěn)定，蛋白變性程度以及聚合程度將會(huì)減輕。大分子擁擠環(huán)境能夠使蛋白分子在水溶液中處于非聚集或者較少聚集的反應(yīng)狀態(tài)。本發(fā)明將蛋白、多糖和聚乙二醇置于大分子擁擠環(huán)境中，多糖既充當(dāng)了大分子擁擠試劑，又能與蛋白發(fā)生糖基化反應(yīng)，形成共價(jià)結(jié)合的大分子復(fù)合物，其既保留了蛋白質(zhì)的表面活性又具有多糖的親水性能。同時(shí)惰性擁擠試劑聚乙二醇的加入能進(jìn)一步有效促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行及抑制蛋白聚集。糖基化對(duì)于蛋白質(zhì)聚集的調(diào)節(jié)作用直接與肽鏈的折疊和聚集的動(dòng)態(tài)區(qū)間有關(guān)，通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合到蛋白質(zhì)肽鏈上的糖鏈能夠影響蛋白質(zhì)的聚集行為，而這可以用來(lái)解釋糖基化對(duì)于蛋白質(zhì)聚集行為的調(diào)節(jié)作用，一方面，通過(guò)糖基化降低蛋白質(zhì)表面疏水性而抑制了蛋白質(zhì)的聚集行為，另一方面，糖鏈共價(jià)連接到蛋白質(zhì)分子上減少了蛋白質(zhì)正電荷的數(shù)量導(dǎo)致蛋白質(zhì)電荷發(fā)生變化，從而改變了分子之間的靜電排斥作用，最終影響了蛋白質(zhì)的聚集行為。因此，本發(fā)明想通過(guò)糖基化及大分子擁擠環(huán)境共同作用控制蛋白質(zhì)聚集行為。在蛋白質(zhì)聚集過(guò)程中，濁度和粒度是常用來(lái)表征蛋白聚集程度的重要指標(biāo)。因此在反應(yīng)過(guò)程中選用濁度和粒度作為檢測(cè)指標(biāo)。濁度反映了溶液中不同懸浮粒子的大小及數(shù)量，蛋白質(zhì)聚集至一定程度，溶液中顆粒直徑變大，溶液濁度升高，也稱為宏觀聚集體。粒徑分布采用馬爾文納米粒度分布儀來(lái)研究，利用動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)研究溶液中聚集體粒子的粒徑分布。方法為將糖基化產(chǎn)物溶于緩沖液中，于MOnm處測(cè)定濁度，另取上述溶液用粒度分布儀測(cè)定粒徑分布。并對(duì)蛋白的溶解性、乳化性、起泡性、熱穩(wěn)定性等功能性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，以反映蛋白功能特性的顯著改善。本發(fā)明具有如下的優(yōu)點(diǎn)及有益效果(1)在大分子擁擠環(huán)境下進(jìn)行蛋白與多糖的共價(jià)接枝，不僅有利于共價(jià)接枝的進(jìn)行，而且用大分子擁擠環(huán)境及糖基化兩個(gè)方面共同作用來(lái)抑制蛋白質(zhì)的聚集行為，為一種全新的抑制蛋白質(zhì)聚集的方法。(2)本發(fā)明有效解決了食品加工過(guò)程中熱處理導(dǎo)致的蛋白質(zhì)聚集行為，且能在高鹽、低酸等食品加工過(guò)程中常遇到的極端條件下應(yīng)用，并對(duì)蛋白進(jìn)行有效的物性修飾，從而擴(kuò)展了蛋白質(zhì)在食品中的應(yīng)用范圍。(3)本發(fā)明具有工業(yè)化、規(guī)?；膽?yīng)用前景，亦能有效應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。實(shí)施例1準(zhǔn)確稱取0. 5g大豆7S球蛋白，溶解于IOmL 0. 01mol/L pH 6. 5的磷酸鈉緩沖溶液，稱取1. 5g葡聚糖和1. 5g聚乙二醇(PEG3000)加入到緩沖液中混勻，于恒溫磁力攪拌器中在95°C反應(yīng)6h，反應(yīng)結(jié)束后迅速冰浴冷卻至室溫(25°C )終止反應(yīng)，產(chǎn)物5000rpm離心 20min，于4°C透析48h以除去惰性擁擠試劑聚乙二醇及其它小分子物質(zhì)。將產(chǎn)物冷凍干燥， 得到蛋白的物性修飾產(chǎn)物。對(duì)比實(shí)施例1準(zhǔn)確稱取0. 5g大豆7S球蛋白，溶解于IOmL 0. 01mol/L pH 6. 5的磷酸鈉緩沖溶液，稱取1. 5g葡聚糖加入到緩沖液中混勻，于恒溫磁力攪拌器中在95°C反應(yīng)6h，反應(yīng)結(jié)束后迅速冰浴冷卻至室溫(25°C )終止反應(yīng)，產(chǎn)物5000rpm離心20min，于4°C透析48h以除去惰性擁擠試劑聚乙二醇及其它小分子物質(zhì)。將產(chǎn)物冷凍干燥，得到糖基化的蛋白產(chǎn)物。采用濁度表征蛋白的聚集程度，采用乳化性來(lái)標(biāo)準(zhǔn)蛋白的功能特性。實(shí)施例1和對(duì)比實(shí)施例1蛋白的聚集情況及乳化性對(duì)比結(jié)果如表1所示表 1
實(shí)施例1對(duì)比實(shí)施例1蛋白物性修飾產(chǎn)物糖基化蛋白濁度(nm)0. 0210. 048乳化性(m2/g)6542 從表1可以看出，本發(fā)明實(shí)施例1中以聚乙二醇作為惰性大分子擁擠試劑所得蛋白物性修飾產(chǎn)物濁度較低，且蛋白的乳化性更好。說(shuō)明在惰性擁擠試劑聚乙二醇存在的大分子擁擠環(huán)境下對(duì)蛋白進(jìn)行改性，能有效的抑制蛋白在水溶液中的聚集，并顯著改善蛋白的乳化性能。
實(shí)施例2準(zhǔn)確稱取0. Ig大豆7S球蛋白，溶解于IOmL 0. 01mol/L pH 6的磷酸鈉緩沖溶液， 稱取0. 5g葡聚糖和1.5g聚乙二醇(PEG2000)加入到緩沖液中混勻，于恒溫磁力攪拌器中在80°C反應(yīng)10h，反應(yīng)結(jié)束后迅速冰浴冷卻至室溫(25°C )終止反應(yīng)，產(chǎn)物4000rpm離心 30min，于4°C透析24h以除去惰性擁擠試劑聚乙二醇及其它小分子物質(zhì)。將產(chǎn)物冷凍干燥， 得到蛋白的物性修飾產(chǎn)物。對(duì)比實(shí)施例2準(zhǔn)確稱取0. Ig大豆7S球蛋白，溶解于IOmL 0. 01mol/L pH 6的磷酸鈉緩沖溶液， 稱取0. 5g葡聚糖加入到緩沖液中混勻，于恒溫磁力攪拌器中在80°C反應(yīng)10h，反應(yīng)結(jié)束后迅速冰浴冷卻至室溫(25°C )終止反應(yīng)，產(chǎn)物4000rpm離心30min，于4°C透析Mh以除去惰性擁擠試劑聚乙二醇及其它小分子物質(zhì)。將產(chǎn)物冷凍干燥，得到糖基化的蛋白產(chǎn)物。表權(quán)利要求
1.一種抑制蛋白在水溶液中聚集并物性修飾的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將蛋白用緩沖液溶解，蛋白的質(zhì)量份數(shù)為1 10份，緩沖溶液是PH6.0 8.0的 0. OlM- 0. 2M的任意緩沖鹽體系；(2)將大分子擁擠試劑加入步驟(1)的溶液中混勻，在60 95°C的恒溫磁力攪拌器中攪拌4 30h后，冰浴迅速冷卻至室溫；所述大分子擁擠試劑為包括多糖和惰性擁擠試劑聚乙二醇在內(nèi)的大分子物質(zhì)的混合物；(3)將步驟(2)得到的產(chǎn)物離心，除去不溶物；(4)將步驟C3)得到的產(chǎn)物透析后，得到少聚集的蛋白物性修飾產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟( 所述大分子擁擠試劑的總質(zhì)量份數(shù)為10 40份，多糖與聚乙二醇的質(zhì)量比為1 1 1 3。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述蛋白為大豆7S球蛋白、 大豆分離蛋白、乳清蛋白、β -乳球蛋白或牛血清白蛋白BSA。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟( 所述多糖為葡聚糖、卡拉膠、瓜爾豆膠和可溶性淀粉中的一種或一種以上。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟( 所述惰性擁擠試劑聚乙二醇為 PEG2000、PEG3000、PEG3350 或 PEG4000。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述離心速度為3000 5000rpm，離心時(shí)間為20 30min。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(4)所述透析溫度為4°C，時(shí)間為 24 她。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求1 7任一項(xiàng)所述的方法制備的少聚集的蛋白物性修飾產(chǎn)物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述蛋白物性修飾產(chǎn)物的應(yīng)用，其特征在于，所述產(chǎn)物經(jīng)純化后作為可溶性的蛋白添加劑應(yīng)用于酸性運(yùn)動(dòng)型飲料中或者作為新型乳化劑應(yīng)用于肉制品中。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種抑制蛋白在水溶液中聚集并物性修飾的方法及產(chǎn)物和應(yīng)用，包括以下步驟(1)將蛋白用緩沖液溶解，蛋白的質(zhì)量份數(shù)為1～10份，緩沖溶液是pH 6.0～8.0的0.01M～0.2M的任意緩沖鹽體系；(2)將大分子擁擠試劑加入步驟(1)的溶液中混勻，在60～95℃的恒溫磁力攪拌器中攪拌4～30h后，冰浴迅速冷卻至室溫；(3)將產(chǎn)物離心，除去不溶物；(4)將步驟(3)得到的產(chǎn)物透析后，得到少聚集的蛋白物性修飾產(chǎn)物。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單且易于操作，產(chǎn)物在抑制蛋白聚集的同時(shí)，蛋白水溶性、乳化性、起泡性、熱穩(wěn)定性等功能性質(zhì)有很大的提高，能用于制備改性蛋白、食品添加劑或醫(yī)藥行業(yè)中。
文檔編號(hào)A23J3/00GK102499320SQ20111036107
公開(kāi)日2012年6月20日 申請(qǐng)日期2011年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月14日
發(fā)明者張曦, 楊曉泉, 齊軍茹 申請(qǐng)人:華南理工大學(xué)