專利名稱：黑斑皮蠹與花斑皮蠹的鑒定方法及其專用引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種黑斑皮蠹與花斑皮蠹的鑒定方法及其專用引物。
背景技術(shù)：
斑皮蠹屬害蟲是重要的倉儲害蟲。目前對斑皮蠹的鑒定，主要根據(jù)形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行判別。但由于斑皮蠹類成蟲個體一般都比較小，且種間的形態(tài)差異不明顯，經(jīng)常造成鑒定中的種間混淆。皮蠹個體小，成蟲體長2. 0-3. 5mm，且形態(tài)酷似不易區(qū)分。對成蟲的鑒定，主要根據(jù)觸角棒節(jié)數(shù)、觸角窩深淺、鞘翅顏色及斑紋特點(diǎn)等來鑒別；幼蟲體長4. 0-6. Omm, 一般是根據(jù)著生的剛毛數(shù)量和類型、第8腹節(jié)背板前脊溝是否完整和上內(nèi)唇感覺乳突的個數(shù)等來鑒別。皮蠹的形態(tài)鑒別需要解剖后在顯微鏡下觀察，例如兩者幼蟲最重要的鑒別特征為觸角和上內(nèi)唇，只有0. 1-0. 2mm大小，而其上的特征，如剛毛和乳突就更加細(xì)小，因此稍有不慎就可能將其破壞或丟失。這就不但需要鑒定工作者有豐富的技術(shù)經(jīng)驗并且還得保證皮蠹害蟲的完整性，從而使得皮蠹近緣種害蟲的形態(tài)鑒定成為了日益費(fèi)時費(fèi)事的難題。COI基因是動物線粒體DNA中非常保守的編碼蛋白基因，它具有相對的保守性同時又有足夠的變異，即使是親緣關(guān)系很近的類群也存在幾個百分比的差異，所以COI常被用來反映種群遺傳變異信息，分析親緣關(guān)系較近的種、種下分類單元等。COI的序列差異性分析在雙翅目、直翅目、鞘翅目、膜翅目、纓翅目等昆蟲的鑒別中都被用來作為重要的鑒別依據(jù)。而且其DNA序列本身很少存在插入和缺失，使序列比對更容易操作。目前，COI序列差異性分析已經(jīng)成為物種間分類最普遍的分子標(biāo)記之一。分子生物學(xué)技術(shù)手段已被用于昆蟲的鑒定分類中，目前對皮蠹屬近緣種的鑒定， 主要采用傳統(tǒng)的形態(tài)分類學(xué)，盡管也有采用PCR擴(kuò)增片段，通過測序來鑒定的方法，但耗時且費(fèi)用高，還沒有相關(guān)的快速分子生物學(xué)檢測方法。因此如何能夠快速準(zhǔn)確的對斑皮蠹進(jìn)行鑒定，已成為亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種檢測皮蠹的引物對。本發(fā)明提供的引物對，由引物1和引物2組成；上述引物對中，所述引物1和引物2的核苷酸序列分別為序列表中序列1和序列表中序列2。上述引物對中，所述皮蠹為黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。本發(fā)明的另一個目的是提供一種檢測皮蠹的試劑。本發(fā)明提供的試劑，由上述引物對和AflII組成。在上述試劑中，所述引物對和所述AflII為獨(dú)立包裝；在上述試劑中，所述皮蠹為黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。
本發(fā)明的第三個目的是提供一種檢測皮蠹的PCR試劑。本發(fā)明提供的PCR試劑，由上述的引物對、dNTP、DNA聚合酶及PCR緩沖液組成；在上述PCR試劑中，所述引物對中的各引物在所述PCR試劑中的濃度均為0. 5μΜ。在上述PCR試劑中，所述皮蠹為黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。本發(fā)明的第四個目的是提供一種檢測皮蠹的試劑盒。本發(fā)明提供的試劑盒，包括上述的試劑或上述的PCR試劑；在上述試劑盒中，所述皮蠹為黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。上述引物對或上述試劑或上述PCR試劑或上述試劑盒在檢測或輔助檢測皮蠹中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；上述應(yīng)用中，所述皮蠹具體為黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。本發(fā)明的第五個目的是提供一種檢測或輔助檢測皮蠹的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟1)用上述引物對或上述試劑或上述PCR試劑或上述試劑盒中的引物對對待測皮蠹進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；2)分別用AflII酶切步驟1)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，得到酶切產(chǎn)物，若所述酶切產(chǎn)物為535bp和347bp大小，則待測皮蠹為或候選為黑斑皮蠹；若所述酶切產(chǎn)物仍為880bp大小，則待測皮蠹為或候選為花斑皮蠹。在上述方法的PCR擴(kuò)增中，以待測皮蠹的基因組DNA為模板；在上述方法的PCR擴(kuò)增中，退火溫度為50°C-55°C，在本發(fā)明的實施例中采用的退火溫度為55°C。在上述方法中，檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的方法為瓊脂糖凝膠電泳或測序。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明根據(jù)斑皮蠹屬種之間線粒體基因序列差異性，尋找斑皮蠹不同種的物種特異性變異位點(diǎn)，建立對這些斑皮蠹種的分子鑒定體系，最終實現(xiàn)檢疫性斑皮蠹及其近緣種的快速、準(zhǔn)確、高效鑒定。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1、縮短檢測所需時間，從收集樣品到檢測完畢僅需1天。2、所需樣品量大大減少，同時檢測精準(zhǔn)度大大提高。甚至蟲體不完全時也可以進(jìn)行檢測鑒定，且結(jié)果可信度高。3、成本大大降低。此外，本方法還彌補(bǔ)了傳統(tǒng)分類鑒定中需要提供完整蟲體的要求，因為在實際檢疫工作中，斑皮蠹屬害蟲在生活過程中不斷在糧?；蚱渌麅Σ匚飪?nèi)穿行，身上的毛極易脫落，尤其幼蟲體表組織柔軟，使得有些蟲體不能保持完整，而本實驗方法即使在蟲體不完全時也可以進(jìn)行檢測鑒定。


圖1為皮蠹的PCR擴(kuò)增結(jié)果圖2為限制酶AflII酶切皮蠹PCR產(chǎn)物的電泳圖
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例1、引物的設(shè)計根據(jù)已有的谷斑皮蠹的序列(基因序列號FJ58973)，設(shè)計引物Tgla-F 5-CAACATTTATTTTGATTT-3 (序列 1)Tgla-R 5-TCCAATGCACTAATCTGCCA-3 (序列 2)實施例2、黑斑皮蠹與花斑皮蠹的鑒定1、皮蠹樣品DNA的提取分別取編號為1和2的兩頭皮蠹分別由黃埔出入境檢驗檢疫局(采集于廣州黃埔)和山東農(nóng)業(yè)大學(xué)提供(采集于山東泰安)，采用Tiangen組織基因組DNA提取試劑盒 (TIANamp Genomic DNA Kit)，按照說明提取被測樣品總DNA。具體為將活蟲在200 μ 1 GA緩沖液中研磨碎，混勻后加入20ul蛋白酶K，37°C放置4hr。隨后加入200 μ 1 GB緩沖液，混勻后，在70°C放置lOmin。加入200ul無水乙醇，充分混勻15s。將所得溶液轉(zhuǎn)入CB3 吸附柱中，離心，12，OOOrpm，30s，倒掉廢液，將吸附柱放回收集管中。向吸附柱CB3中加入 0. 5ml⑶緩沖液，離心，12，OOOrpm，30s，倒掉廢液，將吸附柱放回收集管中。向吸附柱CB3 中加入0. 7ml漂洗液PW，離心，12，OOOrpm，30s，倒掉廢液，將吸附柱放回收集管中。向吸附柱CB3中加入0. 5ml漂洗液PW，離心，12，OOOrpm，30s，倒掉廢液，將吸附柱放回收集管中。 離心，12，OOOrpm，2min，倒掉廢液，將吸附柱CB3置于室溫幾分鐘，以徹底晾干殘余的漂洗液。將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入干凈的離心管中，向吸附膜中央滴加50ul洗脫緩沖液TE，室溫放置 5min, 12，OOOrpm離心2min,分別得到1和2的總DNA。2、PCR 擴(kuò)增分別以上述1得到的1和2的總DNA為模板，以Tgla-F和Tgla-R為正反向引物，加入PCR試劑盒提供試劑(Tiangen)，進(jìn)行片斷擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20ul，其中2 μ 1 IOXTaqReaction Buffer 緩沖液，1. 25U Taq polymerase, 1 μ 1 dNTP (終濃度 125 μ Μ)， 0. 5μΜ/弓丨物(終濃度0· 5μΜ/引物)，20ng DNA。反應(yīng)條件為95°C，5min，1個循環(huán)；94°C, 30s，55°C，45s，72°C，lmin，35 個循環(huán)；最后 72°C延伸 10min，l 個循環(huán)。擴(kuò)增后產(chǎn)物在2%瓊脂糖膠中進(jìn)行電泳，結(jié)果如圖1所示，可以看出，其中1為1 號皮蠹PCR產(chǎn)物，2為2號皮蠹PCR產(chǎn)物，3. 200bp DNAladder (Tiangen)從上到下依次為 第一條帶4000bp ；其它從2200bp開始，每條遞減200bp，直至最低條帶200bp ；可以看出， 均得到大小約為880bp的PCR產(chǎn)物。2、酶切及結(jié)果檢測將上述1號皮蠹PCR產(chǎn)物和2號皮蠹PCR產(chǎn)物分別采用特異性酶AflII進(jìn)行酶切，酶切體系20yL反應(yīng)體系如下10U Afl ΙΙ,2μ L 10 X NEBuffer, 0. 2 μ LlOO X BSA, DNA 的 PCR 產(chǎn)物 17. 3 μ L (終濃度約 370ng/ul)。將混合體系在 PCR 儀 37°C 條件下孵育ι小時后，各取 ο μ L酶切產(chǎn)物，經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物并拍照。酶切后產(chǎn)物在2%瓊脂糖膠中進(jìn)行電泳，電泳后EB染色，以檢測酶切結(jié)果，具體為取lOulDNA擴(kuò)增產(chǎn)物，與樣品緩沖液混合均勻，點(diǎn)入2%瓊脂糖膠中，進(jìn)行電泳，90V， 35min。電泳后EB染色lOmin，在UV燈下檢測結(jié)果。若得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)過AflII酶切后得到535bp和347bp的片段，則待測樣品為
黑斑皮蠹；
若得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)過AflII酶切后仍為880bp左右的片段，則待測樣品為花斑皮蠹。結(jié)果如圖2所示，其中1. IOObpDNAladder(Tiangen)，從上到下依次為第一條帶1500bp ；其它從IOOObp開始，每條遞減lOObp，直至最低條帶100bp，2. 1號皮蠹PCR產(chǎn)物酶切后，3. 2號皮蠹PCR產(chǎn)物酶切后，4. 200bp DNAladder(Tiangen)從上到下依次為第一條帶4000bp ；其它從2200bp開始，每條遞減200bp，直至最低條帶200bp?？梢钥闯觯? 號皮蠹PCR產(chǎn)物酶切后得到535bp和347bp的產(chǎn)物，2號皮蠹PCR產(chǎn)物酶切后，仍為880bp 左右的片段，說明1號皮蠹為黑斑皮蠹，2號皮蠹為花斑皮蠹。將上述1號皮蠹PCR產(chǎn)物和2號皮蠹PCR產(chǎn)物分別送去測序，結(jié)果分別為序列表中的序列4和序列表中的序列3，與genbank比對，序列4即為黑斑皮蠹的COI部分序列，而序列3即為花斑皮蠹的COI部分序列，這個檢測結(jié)果與本發(fā)明的檢測結(jié)果一致，證明本發(fā)明的方法正確。
權(quán)利要求
1.一種檢測皮蠹的引物對，由引物1和引物2組成所述引物1和引物2的核苷酸序列分別為序列表中序列1和序列表中序列2。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物對，其特征在于 所述皮蠹為黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。
3.—種檢測皮蠹的試劑，由權(quán)利要求1或2所述的引物對和AflII組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑，其特征在于 所述引物對和所述AflII為獨(dú)立包裝；所述皮蠹為黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。
5.一種檢測皮蠹的PCR試劑，由權(quán)利要求1或2所述的引物對、dNTP、DNA聚合酶及PCR 緩沖液組成；所述引物對中的各引物在所述PCR試劑中的濃度均為0. 5μΜ ；所述皮蠹為黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。
6.一種檢測皮蠹的試劑盒，包括權(quán)利要求3或4所述的試劑或權(quán)利要求5所述的PCR 試劑；所述皮蠹為黑斑皮蠹和/或花斑皮蠹。
7.權(quán)利要求1或2所述引物對或權(quán)利要求3或4所述試劑或權(quán)利要求5所述PCR試劑或權(quán)利要求6所述試劑盒在檢測或輔助檢測皮蠹中的應(yīng)用；所述皮蠹具體為黑斑皮蠹和 /或花斑皮蠹。
8.—種檢測或輔助檢測皮蠹的方法，包括如下步驟1)用權(quán)利要求1或2所述引物對或權(quán)利要求3或4所述試劑或權(quán)利要求5所述PCR試劑或權(quán)利要求6所述試劑盒中的引物對對待測皮蠹進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物；2)分別用AflII酶切步驟1)得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，得到酶切產(chǎn)物，若所述酶切產(chǎn)物為535bp和347bp大小，則待測皮蠹為或候選為黑斑皮蠹； 若所述酶切產(chǎn)物僅為880bp大小，則待測皮蠹為或候選為花斑皮蠹。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增中，以待測皮蠹的基因組DNA為模板； 所述PCR擴(kuò)增的退火溫度為50°C -55°C。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9的方法，其特征在于所述檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的方法為瓊脂糖凝膠電泳或測序。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種黑斑皮蠹與花斑皮蠹的鑒定方法及其專用引物。本發(fā)明提供的引物對，由引物組1和引物2組成；上述引物對中，所述引物1和引物2的核苷酸序列分別為序列表中序列1和序列表中序列2。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明根據(jù)斑皮蠹屬種之間線粒體基因序列差異性，尋找斑皮蠹不同種的物種特異性變異位點(diǎn)，建立對這些斑皮蠹種的分子鑒定體系，最終實現(xiàn)檢疫性斑皮蠹及其近緣種的快速、準(zhǔn)確、高效鑒定。
文檔編號C12Q1/68GK102399878SQ20111036189
公開日2012年4月4日 申請日期2011年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月15日
發(fā)明者劉二龍, 劉聰, 呂英姿, 林惠嬌, 樊武疆, 王新國, 班麗萍, 蔣湘 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)