專利名稱：拮抗結(jié)核分枝桿菌表面脂糖的核酸適配子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬微生物免疫和臨床治療領(lǐng)域，具體涉及一種能用于治療和診斷由人結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium Tuberculosis, H37Rv) [ATCC 93009(4)]導(dǎo)致的結(jié)核病的單鏈 DNA適配子，本發(fā)明還涉及該適配子的在診斷或治療結(jié)核感染中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前，結(jié)核病仍然是威脅人類生命健康的主要傳染病之一，也是導(dǎo)致人類死亡的主要因素之一。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，目前全球約20億人感染結(jié)核，2008年全球約1110萬(wàn)人患有活動(dòng)性肺結(jié)核，且約有180萬(wàn)人死于結(jié)核病。隨著結(jié)核耐藥菌株的不斷出現(xiàn)，結(jié)核病的治療面臨巨大的挑戰(zhàn)，全球范圍急需開(kāi)發(fā)新型的結(jié)核病治療藥物。結(jié)核病治療方面，目前最常用的結(jié)核治療藥物利福平、異煙胼、鏈霉素、吡嗪酰胺以及乙胺丁醇，雖然是目前有效的結(jié)核治療藥物，但利福平、異煙胼及吡嗪酰胺對(duì)患者都具有肝臟毒性，二者聯(lián)合應(yīng)用肝臟毒性更大(Capelle P，Dhumeaux D，Mora Μ, Feldmann G, Berthelot P.Effect of rifampicin on liver function in man.Gut. 1972,13 (5) 366-371)；鏈霉素雖然可以通過(guò)抑制蛋白質(zhì)合成來(lái)有效的殺滅結(jié)核分支桿菌，但是該藥物可造成不可逆的第八對(duì)腦神經(jīng)損害，包括共濟(jì)失調(diào)、眩暈、耳鳴、耳聾等，同時(shí)與其他氨基糖苷類相似，可引起腎臟毒性反應(yīng)(Furst G, Maurer J, Schlegel J. Monitoring ototoxic side effects in streptomycin therapy of tuberculosis patients with transitory evoked otoacoustic emissions ΤΕ0ΑΕ. Pneumologie. 1995,49(11) :590-595)；而乙胺丁醇主要與異煙胼、利福平、吡嗪酰胺聯(lián)合應(yīng)用于治療的強(qiáng)化期，但其毒副作用與其劑量成正比，可弓I起嚴(yán)重的視神經(jīng)炎(Lim SA. “ Ethambutol-associated optic neuropathy“. Ann. Acad. Med. Singap. 2006，35 (4) :274-278)。同時(shí)，由于不規(guī)范用藥等多種因素導(dǎo)致以上幾種結(jié)核治療藥物耐藥率越來(lái)越高。盡管不斷有人進(jìn)行新藥物諸如mOXiflOXacin、R207910 的開(kāi)發(fā)研制，然而目前新的抗結(jié)核病藥物發(fā)展趨勢(shì)總體較慢，急需研制新型抗結(jié)核藥物。脂糖是結(jié)核分枝桿菌胞壁的主要成分，大約30%結(jié)核分枝桿菌基因參與了脂類的合成和代謝。甘露糖修飾的脂阿拉伯甘露聚糖(Mannosylated lipoarabinomannan, ManLAM)是主要存在于致病的人結(jié)核分枝桿菌胞壁中的脂糖。研究表明，脂糖ManLAM可以通過(guò)抑制樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)的成熟、增加免疫抑制性細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素IO(IL-IO) 的表達(dá)、抑制白細(xì)胞介素12(IL-12)的表達(dá)以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的產(chǎn)生等一系列機(jī)制來(lái)抑制機(jī)體的免疫功會(huì)邑(Barnes PF, Roy S，et al. Mannose-capped lipoarabinomannan-and prostaglandin E2~dependent expansion of regulatory T cells in human Mycobacterium tuberculosis infection. Eur J Immunol. 2008，38(2) :459-469)。SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)蹄選技術(shù)是90年代發(fā)展起來(lái)的一種新的體外篩選技術(shù)，它運(yùn)用大容量的單鏈隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)， 并結(jié)合體外PCR擴(kuò)增技術(shù)，以指數(shù)富集與靶分子特異結(jié)合的寡核苷酸配基，經(jīng)過(guò)多輪篩選后獲得高親和力、特異性強(qiáng)的寡核苷酸適配子(aptamers) (Stoltenburg R，Reinemann C，Strehlitz B.SELEX—a(r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomol Eng. 2007,24(4) :381-403)，具有庫(kù)容量大、親和力高、靶分子范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，已成功運(yùn)用于許多靶分子的篩選中，已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于包括感染性疾病、腫瘤等的診斷制劑開(kāi)發(fā)研究中，是極具診斷潛力的新型小分子制劑。本研究采用SELEX技術(shù)篩選獲得了能與毒性結(jié)核分枝桿菌H37Rv表面脂糖ManLAM特異性結(jié)合的單鏈DNA適配子，通過(guò)封閉具有免疫抑制作用的ManLAM，逆轉(zhuǎn)其免疫抑制效應(yīng)，達(dá)到良好的治療效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種能與毒性結(jié)核分支桿菌H37Rv表面脂糖 ManLAM特異性結(jié)合的單鏈DNA適配子ZXLl。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供上述DNA適配子在制備診斷結(jié)核病試劑中的應(yīng)用；本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供上述DNA適配子在制備抗結(jié)核藥物中的應(yīng)用；本發(fā)明的目的還在于提供制備上述DNA適配子的方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種能特異性結(jié)合毒性結(jié)核分支桿菌H37Rv的DNA適配子，其具有ZXLl所示的核苷酸序列。本發(fā)明通過(guò)隨機(jī)單鏈DNA文庫(kù)以及引物的構(gòu)建、SELEX篩選、PCR擴(kuò)增、親和力測(cè)定、體外不同細(xì)菌結(jié)合實(shí)驗(yàn)等得到具有與毒性結(jié)核分支桿菌H37Rv高特異性、高親和力的 DNA適配子，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。通過(guò)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)該適配子可以逆轉(zhuǎn) ManLAM導(dǎo)致的免疫抑制作用，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)該適配子具有很好的抗結(jié)核感染能力。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在本發(fā)明SEQ ID No. 1的基礎(chǔ)上，通過(guò)替換、缺失和/或者插入一個(gè)或幾個(gè)核苷酸，也能得到與本發(fā)明具有同等功能的適配子序列，例如SEQ ID No.5所示的序列。 另外，以SEQ ID No. 1為核心序列，按SEQ ID No. 2 (n30為SEQ ID No. 1所示的核心序列) 中SEQ ID No. 2由所述核心序列向3’和/或5’端延伸所得到的序列。由此，本發(fā)明適配子包括DSEQ ID No. 1所示的核苷酸序列；2)SEQ ID No. 1所示核苷酸序列經(jīng)替換、缺失和/或者插入一個(gè)或幾個(gè)核苷酸形成的具有SEQ ID No. 1同等功能的序列；或，3)含有SEQ ID No. 1所示核苷酸序列為核心序列并兩邊延長(zhǎng)的序列，如SEQ ID No. 2由1)所述序列向3’和/或5’端延伸所得到的序列，其中SEQ ID No. 2中的n30為1) 所述的核心序列。具體地，本發(fā)明采用下述方法獲得特異性結(jié)合毒性結(jié)核分枝桿菌H37Rv 的DNA適配子1、構(gòu)建隨機(jī)單鏈DNA(ssDNA)文庫(kù)及引物構(gòu)建長(zhǎng)度88 個(gè)堿基的單鏈 DNA 文庫(kù)5，-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACAG TCCGAGCC-N30-GGGTCAATGCGTCATA-3’，其中N代表A，T, C, G四個(gè)隨機(jī)堿基。上游引物為 5，-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACAGTCCGAGCC-3，，畫線部分為 EcoRI 的 DNA 限制性酶切位點(diǎn)；下游引物為5，-GCGGGATCCTATGACGCATT GACCC-3’，畫線部分為BamHI的DNA限制性酶切位點(diǎn)。隨機(jī)單鏈DNA文庫(kù)以及引物均可由公司合成。2、dsDNA及ssDNA文庫(kù)的PCR擴(kuò)增及保存
每一輪篩選前先將ssDNA文庫(kù)擴(kuò)增為dsDNA文庫(kù)后保存，取少量dsDNA文庫(kù)作為模板擴(kuò)增出下一輪篩選的ssDNA文庫(kù)。反應(yīng)程序均為95°C 5min，95°C 36s,60°C 36s， 72°C 8 ，20-30個(gè)循環(huán)，72°C 5min。循環(huán)次數(shù)根據(jù)具體的擴(kuò)增效果進(jìn)行調(diào)整。PCR產(chǎn)物通過(guò)3%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，膠純化試劑盒進(jìn)行回收(按照試劑盒產(chǎn)品說(shuō)明書操作)。3、SELEX 篩選每輪篩選所用的ssDNA量均為40pmol，使用前置于85°C水浴10分鐘后迅速冰浴 5min ；將提純的毒性結(jié)核分支桿菌表面的脂糖ManLAM(按照參考文獻(xiàn)的方法進(jìn)行提取純化)溶于包被緩沖液中包被96孔ELISA板，4°C過(guò)夜；使用篩選洗脫液反復(fù)洗滌6次后加入 40pmol的ssDNA文庫(kù)，37°C孵育Ih后用篩選洗脫液洗滌6次；在篩選孔中加入100μ 1高壓滅菌的雙蒸水(ddH20)，95°C加熱10分鐘；將孔內(nèi)ddH20吸至新的EP管中，然后加入2倍體積的無(wú)水乙醇及1/10體積的NaAc (3M)置于_70°C沉淀過(guò)夜，最后通過(guò)凝膠回收。上述篩選緩沖液為20mM pH 7. 4Tris · HCl, 137mM NaCl,5mM KCl,2mM CaCl2, ImM MgCl204、ManLAM梯度壓力篩選為了獲得高特異性結(jié)合的DNA適配子，選用ManLAM梯度篩選來(lái)增加篩選壓力。前三輪用8 μ g的ManLAM，后續(xù)篩選逐漸降低ManLAM的用量，第4輪到第9輪用0. 8 μ g，第10 到第12輪ManLAM量降為0. 08 μ g。并從第5輪開(kāi)始通過(guò)外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)進(jìn)行反篩，第5至第7輪用IX IO6的PBMC反篩，第8至第10輪用5X IO6的PBMC反篩，第11、12 輪用1 X IO7的PBMC反篩。收集第4輪獲得的ssDNA適配子40pmol，使用前置于85°C水浴 IOmin后冰浴5min ；將分離的正常人PBMC包被ELISA板，加入ssDNA適配子，37°C孵育Ih 后吸取上清液；然后將上清液重復(fù)步驟2與ManLAM進(jìn)行作用。5、ssDNA適配子庫(kù)與毒性結(jié)核分枝桿菌ManLAM的親和力比較采用Elisa的方法測(cè)定每一輪的ssDNA和ManLAM的親和力。具體方法如下用每一輪的dsDNA和生物素標(biāo)記的引物2通過(guò)不對(duì)稱PCR擴(kuò)增大量的ssDNA適配子，然后瓊脂糖凝膠電泳回收，測(cè)濃度后備用；用0. 8μ g的ManLAM包被ELISA板，4°C過(guò)夜；用含有0. 05% Tween-20的PBS(PBST)洗6次；每孔加入含鮭魚精DNA(100g/mL)的PBS 100 μ L進(jìn)行封閉，37°C，Ih,用PBST洗6次后每孔分別加入100 μ L含生物素標(biāo)記的每一輪的生物素標(biāo)記的ssDNA (40pmol),37°C, Ih ；用PBST洗6次；每孔加入1 1000稀釋的HR標(biāo)記的鏈霉親和素 37°C，30min ；TMB 顯色。通過(guò)檢測(cè)，第12輪具有與ManLAM最高的親和力，將第12輪ssDNA進(jìn)行不對(duì)稱PCR 擴(kuò)增，得到dsDNA產(chǎn)物，經(jīng)DNA限制性內(nèi)切酶EcoRI以及BamHI消化后連接于質(zhì)粒pUC19 載體(Yanisch-Perron, C.，1985)上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5a (Hanahan，D.，1983)，通過(guò)氨芐青霉素進(jìn)行抗性篩選，挑取單克隆，提取質(zhì)粒后進(jìn)行測(cè)序，得到上述的核苷酸序列(如SEQ ID No. 1所示)。進(jìn)而，本發(fā)明提供上述DNA適配子ZXLl在制備診斷試劑中的應(yīng)用。以ZXLl為模板，PCR擴(kuò)增生物素以及熒光素(FAM)標(biāo)記的適配子，然后采用E1ISA、流式細(xì)胞術(shù)以及激光共聚焦的方法測(cè)定與不同細(xì)菌的結(jié)和力。結(jié)果顯示，ZXLl與毒性結(jié)核分枝桿菌H37Rv具有最高的親和力，與其它的分支桿菌及金黃色葡萄球菌等親和力很低，與卡介苗以及無(wú)毒的恥垢分支桿菌親和力很低。因而可以使用本發(fā)明適配子對(duì)結(jié)核分枝桿菌H37Rv進(jìn)行檢測(cè)，說(shuō) 診斷是否感染結(jié)核菌。本發(fā)明還提供上述DNA適配子ZXLl在制備抗結(jié)核病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明研究表明將結(jié)核分枝桿菌與樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)混合，單鏈DNA適配子ZXLl可以降低H37Rv導(dǎo)致的樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)成熟的減少，同時(shí)增加IL-12的產(chǎn)生，降低IL-10的產(chǎn)生，說(shuō)明該適配子能刺激細(xì)胞免疫；毒性結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染Balb/c小鼠后，使用單鏈適配子ZXLl進(jìn)行治療，然后觀察小鼠的生存情況，發(fā)現(xiàn)該適配子可以延長(zhǎng)結(jié)核感染的小鼠的生存率；毒性結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染小鼠后經(jīng)ZXLl治療，發(fā)現(xiàn)適配子治療組小鼠脾臟指數(shù)低于PBS對(duì)照組，說(shuō)明該適配子能抗結(jié)核感染；抗酸染色證實(shí)，結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染的小鼠在適配子 ZXLl作用后與未使用適配子組小鼠相比，小鼠肺臟的細(xì)菌載量明顯減少，說(shuō)明該適配子能抗結(jié)核感染；此外，結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染的小鼠在適配子ZXLl作用后與未使用適配子組小鼠相比，小鼠肺臟及脾臟的病理改變明顯較輕，說(shuō)明該適配子能抗結(jié)核。因而，本發(fā)明適配子可以制成抗結(jié)核病的藥物，用于預(yù)防或治療結(jié)核分枝桿菌感染所引起的疾病。本發(fā)明ssDNA可以采用任何方法制備獲得，例如包括不限于直接合成；通過(guò)不對(duì)稱PCR得到；采用普通PCR方法，在任一引物上連接可分離標(biāo)記(例如生物素標(biāo)記)，獲得 PCR產(chǎn)物后變性分離(例如采用生物素-親和素系統(tǒng)分離)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果一、篩選獲得的ssDNA適配子可特異性與毒性結(jié)核分枝桿菌H37Rv表面ManLAM 結(jié)合，可以直接封閉ManLAM的免疫抑制作用。適配子制備簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉，確保了獲得的 ssDNA適配子特異性的結(jié)合在毒性結(jié)核分枝桿菌表面，進(jìn)一步提高了治療的靶向性。二、為克服臨床上結(jié)核治療出現(xiàn)的日益嚴(yán)重的耐藥問(wèn)題和副作用大的問(wèn)題提供了新的解決思路。本發(fā)明制備的針對(duì)毒性結(jié)核分支桿菌表面ManLAM的ssDNA適配子為小分子核酸，其分子結(jié)構(gòu)不同于廣譜抗生素，無(wú)耐藥的可能；同時(shí)它只針對(duì)結(jié)核分支桿菌發(fā)揮作用，對(duì)益生菌無(wú)害。三、免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)該適配子可以有效的逆轉(zhuǎn)ManLAM所致的免疫抑制作用，具有治療結(jié)核病效果。四、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，小鼠行毒性結(jié)核分枝桿菌攻毒后，用ssDNA適配子處理后的小鼠生存率明顯延長(zhǎng)，肺臟菌落明顯少于對(duì)照組，脾臟、肺臟病理變化也較對(duì)照組輕，說(shuō)明ssDNA適配子可以有效的降低結(jié)核分枝桿菌的感染，延長(zhǎng)結(jié)核感染小鼠的生存時(shí)間。此外，該適配子已經(jīng)克隆到PUC19載體上，且已經(jīng)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Dffia中，可以直接通過(guò)該菌種進(jìn)行大量制備該適配子?？偠灾?，本發(fā)明提供的DNA適配子與毒性結(jié)核分支桿菌作用特異性高，親和力強(qiáng)，為結(jié)核病的診斷提供了新型的制劑。克服了臨床上對(duì)結(jié)核抗原診斷的非特異性、不靈敏性以及周期長(zhǎng)的缺點(diǎn)，為結(jié)核病的診斷和治療提供了一種新的途徑。


圖1. SELEX技術(shù)篩選特異性結(jié)合毒性結(jié)核分枝桿菌H37Rv表面ManLAM的ssDNA 適配子擴(kuò)增結(jié)果圖。用合成的隨機(jī)ssDNA文庫(kù)與ManLAM進(jìn)行作用，去掉未結(jié)合的部分，第5輪開(kāi)始通過(guò)PBMC進(jìn)行反篩，共篩選12輪。每輪篩選前將ssDNA文庫(kù)擴(kuò)增為dsDNA文庫(kù)，保存，以dsDNA文庫(kù)為模板擴(kuò)增下一輪ssDNA文庫(kù)。圖2.等溫滴定法測(cè)定ZXLl與ManLAM的親和力結(jié)果示意圖。以0rigin6. 0軟件對(duì)ZXLl和ManLAM作用的稀釋熱進(jìn)行雙位點(diǎn)模型非線性最小方差擬合，得到本征結(jié)合常數(shù)Ka0 ZXLl與ManLAM結(jié)合常數(shù)為Ka :5. 27 X IO5 (士2. 9 X IO3)M-1， 而對(duì)照適配子ZXL4與ManLAM幾乎沒(méi)有親和力。圖3.表面等離子共振技術(shù)(SPR)測(cè)定單鏈DNA適配子ZXLl與ManLAM的親和力結(jié)果示意圖。以BiacoreTlOO軟件對(duì)ZXLl和ManLAM作用進(jìn)行擬合，得到二者的解離常數(shù)KD值， 適配子ZXLl與ManLAM作用的解離常數(shù)KD值為8. 907 X 1θΛ 。圖4Α、4Β.適配子ZXLl與不同細(xì)菌親和能力大小的結(jié)果示意圖。以ZXLl為模板，PCR擴(kuò)增生物素以及熒光素(FAM)標(biāo)記的適配子，然后采用 E1ISA、流式細(xì)胞術(shù)以及激光共聚焦的方法測(cè)定與不同細(xì)菌的結(jié)和力。圖4Α顯示，ZXLl與毒性結(jié)核分枝桿菌H37Rv具有最高的親和力，與其它的分支桿菌及金黃色葡萄球菌等親和力很低；4Β顯示，ZXLl與毒性結(jié)核分枝桿菌H37Rv具有最高的親和力，而與卡介苗以及無(wú)毒的恥垢分支桿菌親和力很低。圖5. ZXLl在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用結(jié)果示意圖。圖6Α、6Β.適配子ZXLl逆轉(zhuǎn)ManLAM所致的免疫抑制作用結(jié)果示意圖。將結(jié)核分枝桿菌與樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)混合，單鏈DNA適配子ZXLl可以降低H37Rv 導(dǎo)致的樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)成熟的減少，同時(shí)增加IL-12的產(chǎn)生，降低IL-10的產(chǎn)生，說(shuō)明該適配子能刺激細(xì)胞免疫。圖7.適配子ZXLl延長(zhǎng)結(jié)核分枝桿菌感染小鼠的生存率結(jié)果示意圖。毒性結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染Balb/c小鼠后，使用單鏈適配子ZXLl進(jìn)行治療，然后觀察小鼠的生存情況，發(fā)現(xiàn)該適配子可以延長(zhǎng)結(jié)核感染的小鼠的生存率。圖8.適配子ZXLl降低結(jié)核感染小鼠脾臟重量指數(shù)結(jié)果示意圖。毒性結(jié)核分枝桿菌H37Rv感染小鼠后經(jīng)ZXLl治療，發(fā)現(xiàn)適配子治療組小鼠脾臟指數(shù)低于PBS對(duì)照組，說(shuō)明該適配子能抗結(jié)核感染。圖9.結(jié)核感染恒河猴適配子ZXLl治療示意圖。圖9A-B結(jié)核感染恒河猴血液學(xué)變化；圖9C適配子ZXLl治療組肺臟中結(jié)核荷菌量明顯少于PBS對(duì)照組。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例IDNA適配子的篩選本發(fā)明可以特異性結(jié)合毒性結(jié)核分枝桿菌H37Rv的DNA適配子，按照下列步驟篩選獲得1、構(gòu)建隨機(jī)單鏈DNA文庫(kù)及引物構(gòu)建長(zhǎng)度88 個(gè)堿基的單鏈 DNA 文庫(kù)5，-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACAG TCCGAGCC-N30-GGGTCAATGCGT CATA-3’，其中N代表A，T，C，G四個(gè)隨機(jī)堿基。上游引物為5，-GCGGAATTCTAATACGACTCACTATAGGGAACAGTCCGAGCC-3，，畫線部分為 EcoRI 的 DNA 限制性酶切位點(diǎn)；下游引物為5，-GCGGGATCCTATGACGCATTGACCC-3，，畫線部分為BamHI的DNA限制性酶切位點(diǎn)。隨機(jī)單鏈DNA文庫(kù)以及引物均可由上海博亞生物有限公司合成。2、dsDNA及ssDNA文庫(kù)的PCR擴(kuò)增及保存每一輪篩選前先將ssDNA文庫(kù)擴(kuò)增為dsDNA文庫(kù)后保存，取少量dsDNA文庫(kù)作為模板擴(kuò)增出下一輪篩選的ssDNA文庫(kù)。反應(yīng)程序均為95°C 5min，95°C 36s,60°C 36s， 72°C別s，20-30個(gè)循環(huán)，72°C 5min，均參照IBM公司Klenow Fragment產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。 PCR產(chǎn)物通過(guò)3%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，膠純化試劑盒進(jìn)行回收。3、SELEX 篩選每輪篩選所用的ssDNA量均為40pmol，使用前置于85°C水浴10分鐘后迅速冰浴 5min ；將提純的毒性結(jié)核分支桿菌表面的脂糖ManLAM(按照參考文獻(xiàn)的方法進(jìn)行提取純化)溶于包被緩沖液中包被96孔ELISA板，4°C過(guò)夜；使用篩選洗脫液反復(fù)洗滌6次后加入 40pmol的ssDNA文庫(kù)，37°C孵育Ih后用篩選洗脫液洗滌6次；在篩選孔中加入1001高壓滅菌的雙蒸水(ddH20)，95°C加熱10分鐘；將孔內(nèi)ddH20吸至新的EP管中，然后加入2倍體積的無(wú)水乙醇及1/10體積的NaAc (3M)置于_70°C沉淀過(guò)夜，最后通過(guò)凝膠回收。上述SELEX 篩選緩沖液為20mM pH 7.4 Tris · HCl，137mM NaCl, 5mM KCl,2mM CaCl2, ImM MgCl2。4、ManLAM梯度壓力篩選為了獲得高特異性結(jié)合的DNA適配子，選用ManLAM梯度篩選來(lái)增加篩選壓力。前三輪用8 μ g的ManLAM，后續(xù)篩選逐漸降低ManLAM的用量，第4輪到第9輪用0. 8 μ g，第10 到第12輪ManLAM量降為0. 08 μ g。并從第5輪開(kāi)始通過(guò)外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)進(jìn)行反篩，第5至第7輪用IX IO6的PBMC反篩，第8至第10輪用5X IO6的PBMC反篩，第11、12 輪用1 X IO7的PBMC反篩。收集第4輪獲得的ssDNA適配子40pmol，使用前置于85°C水浴 IOmin后冰浴5min ；將分離的正常人PBMC包被ELISA板，加入ssDNA適配子，37°C孵育Ih 后吸取上清液；然后將上清液重復(fù)步驟2與ManLAM進(jìn)行作用。5、ssDNA適配子庫(kù)與毒性結(jié)核分枝桿菌ManLAM的親和力比較采用ElISA的方法測(cè)定每一輪的ssDNA和ManLAM的親和力。具體方法如下用每一輪的dsDNA和生物素標(biāo)記的引物2通過(guò)不對(duì)稱PCR擴(kuò)增大量的ssDNA適配子，然后瓊脂糖凝膠電泳回收，測(cè)濃度后備用；用0. 8μ g的ManLAM包被ELISA板，4°C過(guò)夜；用含有0. 05% Tween-20的PBS (PBST)洗6次；每孔加入含鮭魚精DNA (100 μ g/mL)的PBS 100 μ L進(jìn)行封閉，37°C，Ih,用PBST洗6次后每孔分別加入100 μ L含生物素標(biāo)記的每一輪的生物素標(biāo)記的ssDNA(40pmol)，37°C, Ih ；用PBST洗6次；每孔加入1 1000稀釋的HR標(biāo)記的鏈霉親和素 37°C，30min ；TMB 顯色。通過(guò)檢測(cè)，第12輪具有與ManLAM最高的親和力，將第12輪ssDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到dsDNA產(chǎn)物，經(jīng)DNA限制性內(nèi)切酶EcoRI以及BamHI消化后連接于質(zhì)粒pUC19載體(Yanisch-Perron，C.，1985)上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5a (Hanahan，D.，1983)，通過(guò)氨芐青霉素進(jìn)行抗性篩選，挑取單克隆，提取質(zhì)粒后進(jìn)行測(cè)序，得到SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列 (命名為ZXL1)。6、等溫滴定法測(cè)定ssDNA適配子與ManLAM的親和力
將測(cè)序得到的ssDNA適配子通過(guò)等溫滴定法測(cè)定與ManLAM的親和力，37°C時(shí)適配子與ManLAM相互作用的熱力學(xué)性質(zhì)的測(cè)定在美國(guó)MicroCal公司生產(chǎn)的VP型等溫滴定量熱儀上進(jìn)行。滴定實(shí)驗(yàn)中，將ManLAM溶液裝入250 μ L的滴定注射器，適配子溶液放入1. 43ml 的樣品池，攪拌器以200r/min的速度攪拌，每間隔300s加入10 μ 1的ManLAM溶液到適配子溶液中，共滴25次。參比池中加入去離子水作為樣品池的熱平衡參照。另做一空白實(shí)驗(yàn)以扣除ManLAM溶液稀釋熱的影響，即在樣品池中加入緩沖液，用ManLAM溶液滴定。ManLAM 溶液的稀釋熱經(jīng)測(cè)定非常小，可略去。所有的溶液都在相應(yīng)溫度條件下真空脫氣處理以減小信號(hào)噪音，積分每個(gè)峰面積并扣除稀釋熱后得到結(jié)合反應(yīng)熱，對(duì)適配子與ManLAM的摩爾比作圖得到反應(yīng)等溫線。以MicroCal公司提供的Origin 6. O軟件中的兩結(jié)合位點(diǎn)模型進(jìn)行非線性最小方差擬合，可計(jì)算出二者作用的本征結(jié)合常數(shù)Ka。如圖2所示，以0rigin6. O軟件對(duì)ZXLl和ManLAM作用的稀釋熱進(jìn)行雙位點(diǎn)模型非線性最小方差擬合，得到本征結(jié)合常數(shù)Ka。ZXLl與ManLAM結(jié)合常數(shù)為Ka: 5. 27X 105(士2. 9X lO^M—1，ZXLl該序列經(jīng)替換、缺失和/或者插入一個(gè)或幾個(gè)核苷酸形成的具有SEQ ID No. 1類似空間結(jié)構(gòu)或同等功能的序列，如ZXL2(序列為:5，-ggccggatag cgacggggcc attccaagaa-3')，其與ZXLl具有類同等功能，具有與ManLAM的高親和力的結(jié)合常數(shù)(Ka 5. 03x104M_1)(如圖 2A)，而對(duì)照適配子 ZXL4 (序列為5，-CACGCCCAATAGTGGCTC CAGCTCATCTCT)與ManLAM幾乎沒(méi)有親和力(如圖2)。7、表面等離子共振技術(shù)(SPR)測(cè)定DNA適配子ZXLl與ManLAM的親和力大小將親和力最高的單鏈DNA適配子ZXLl通過(guò)表面等離子共振技術(shù)(SPR)測(cè)定與 ManLAM的親和力大小。該親和力測(cè)定在Biacore TlOO表面等離子共振儀上進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)中， 將252Ru的適配子ZXLl固定在knsor Chip CM5芯片(購(gòu)自Biacore AB)的Fc4通道上， Fc3通道加不同濃度的ManLAM (濃度分別為0、0. 5Χ1(Γ7Μ、1Χ1(Γ7Μ、2Χ1(Γ7Μ、4Χ1(ΓΜ)，進(jìn)樣速度為30μ Ι/min，進(jìn)樣時(shí)間為lmin。如圖3所示，將反應(yīng)數(shù)據(jù)通過(guò)Biocore TlOO軟件進(jìn)行擬合，得到適配子ZXLl與ManLAM結(jié)合的解離常數(shù)KD值為8. 907X10—1。實(shí)施例2適配子ZXLl與不同細(xì)菌的結(jié)合力大小檢測(cè)用生物素標(biāo)記的下游引物(5’-GCGGGATCCTATGACGCATTGACCC-3’)通過(guò)不對(duì)稱PCR 擴(kuò)增獲得大量的生物素標(biāo)記的ssDNA適配子，按照每孔IXlO5的不同細(xì)菌包被ELISA板，4°C 過(guò)夜；用含有0. 05% Tween-20的PBS (PBST)洗6次；每孔加入含鮭魚精DNA(100 μ g/mL) 的PBS 100 μ L進(jìn)行封閉，37°C，Ih,用PBST洗6次后每孔分別加入100 μ L含生物素標(biāo)記的每一輪的生物素標(biāo)記的ssDNAGOpmol)，37°C，Ih;用PBST洗6次；每孔加入1 1000稀釋的HR標(biāo)記的鏈霉親和素37°C，30min ；TMB顯色。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)適配子ZXLl與毒性結(jié)核分枝桿菌H37Rv、卡介苗以及恥垢分枝桿菌的結(jié)合力大小。首先通過(guò)熒光FAM標(biāo)記的下游引物不對(duì)稱擴(kuò)增大量FAM標(biāo)記的適配子 ZXLl，取上述三種細(xì)菌，調(diào)整濃度至lX107ml，分別取100 μ 1細(xì)菌于EP管中，75%乙醇固定 15min后PBS洗3次，每管加入4 μ g帶有熒光標(biāo)記的單適配子，混勻，于37°C孵育2小時(shí)。 PBS洗3次后上機(jī)檢測(cè)。激光共聚焦顯微鏡測(cè)定適配子ZXLl與毒性結(jié)核分枝桿菌H37Rv以及卡介苗BCG 的結(jié)合力。首先制備FAM標(biāo)記的適配子ZXLl，取H37Rv及BCG兩種細(xì)菌調(diào)整濃度至IXlO4/ml，分別取1001均勻的涂布在包有多聚賴氨酸的載玻片上，自然晾干，PBS洗3次，將FAM 標(biāo)記的適配子ZXLl均勻的滴在涂有細(xì)菌的載玻片上，于37°C孵育池后PBS洗3次上機(jī)檢測(cè)。結(jié)果如圖4所示，圖4A顯示，ZXLl與毒性結(jié)核分枝桿菌H37Rv具有最高的親和力， 與其它的分支桿菌及金黃色葡萄球菌等親和力很低；圖4B顯示，ZXLl與毒性結(jié)核分枝桿菌 H37Rv具有最高的親和力，而與卡介苗以及無(wú)毒的恥垢分支桿菌親和力很低。表明，本發(fā)明適配子具有良好的特異性。實(shí)施例3ZXL1在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用收集結(jié)核病人的血清(武漢市醫(yī)療救治中心，其中急性未經(jīng)治療的結(jié)核病患者17 例，反復(fù)多次住院化療的結(jié)核病人18例，男性患者M(jìn)例，女性患者11例，患者最小年齡為 11歲，最大年齡為57歲)及14例健康志愿者血清(武漢大學(xué)中南醫(yī)院檢驗(yàn)科)。在酶標(biāo)板孔中加入血清樣品包被，并加入通過(guò)生物素標(biāo)記的適配子ZXL1，加入 HRP標(biāo)記的鏈酶親和素，37°C孵育1小時(shí)；PBS洗三次后加入TMB進(jìn)行顯色5分鐘；2M硫酸終止反應(yīng)后酶標(biāo)儀讀數(shù)；進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如5所示，與健康志愿者相比，結(jié)核病患者血清中 ManLAM抗體的0D450均明顯升高(p = 0. 0023)。結(jié)果證明ZXLl在結(jié)核病診斷中具有應(yīng)用前景。實(shí)施例4適配子ZXLl對(duì)ManLAM所致的免疫抑制作用的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ZXLl對(duì)ManLAM作用的DC細(xì)胞成熟的影響。首先無(wú)菌分離新鮮的人外周血單個(gè)核細(xì)胞，使用CD14+的磁珠分選出CD14+的細(xì)胞，計(jì)數(shù)后于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，隔日更換含有IL-4和GM-CSF的1640培養(yǎng)基，2天后加入ManLAM，7天后加入脂多糖(LPQ刺激成熟。實(shí)驗(yàn)分組分別為培養(yǎng)基對(duì)照組、LPS刺激組、LPS+ManLAM組以及 LPS+ManLAM+ZXLl組。最后分別收集培養(yǎng)上清及每組細(xì)胞，將收集的細(xì)胞分別用熒光標(biāo)記 ⑶80、⑶83以及⑶86抗體進(jìn)行標(biāo)記，流式檢測(cè)三種分子的表達(dá)水平。酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法(ELISA法)檢測(cè)培養(yǎng)上清中IL-10以及IL-12的表達(dá)。如上，在培養(yǎng)的DC細(xì)胞中分別加H37Rv、BCG以及ManLAM，收集上清后，采用eBiosicence (San Diego, CA)的IL-10以及IL-12細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒，ELISA檢測(cè)IL-10和IL-12的表達(dá)水平。結(jié)果如6所示，單鏈DNA適配子ZXLl可以降低H37Rv導(dǎo)致的樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)成熟的減少，同時(shí)增加IL-12的產(chǎn)生，降低IL-10的產(chǎn)生，說(shuō)明該適配子能刺激細(xì)胞免疫。實(shí)施例5動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用IO7CFU的H37R結(jié)核菌感染小鼠，小鼠分6組，每組6只，第一組小鼠感染后作磷酸緩沖液(PBQ處理，第二組小鼠感染后行鏈霉素治療，第三組為不相關(guān)適配子(ZXL4)對(duì)照組，第四組 第六組為不同劑量ZXLl治療組(分別為5 μ g、10 μ g、15 μ g)。感染后三天開(kāi)始治療，每隔三天注射一次，共注射三次。所有小鼠均為尾靜脈注射，實(shí)驗(yàn)前H37Rv均經(jīng)過(guò)小鼠體內(nèi)傳代，以保證足夠的毒力。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，篩選獲得的ssDNA適配子ZXLl可以明顯延長(zhǎng)結(jié)核感染小鼠的生存率，脾臟指數(shù)較PBS對(duì)照組明顯減小，降低結(jié)核分枝桿菌感染后小鼠肺臟的荷菌量，明顯減輕感染小鼠肺臟及脾臟的病理變化。由此可見(jiàn)，本發(fā)明適配子可以制備成抗結(jié)核病的藥物， 用于防治結(jié)核菌感染所引起的疾病。
另外，本發(fā)明還對(duì)恒河猴進(jìn)行了治療實(shí)驗(yàn)，恒河猴結(jié)核感染模型前期實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)適配子ZXLl也具有一定的結(jié)核治療作用，與PBS對(duì)照組相比，適配子治療組恒河猴血沉、 急性反應(yīng)蛋白、體重均未見(jiàn)明顯異常，肺部X線表現(xiàn)輕于PBS對(duì)照組；同時(shí)肺組織、外周淋巴結(jié)組織病理變化輕于PBS對(duì)照組，且與鏈霉素治療組無(wú)明顯差異。申請(qǐng)人:還進(jìn)一步對(duì)由ZXLl所衍生的序列進(jìn)行了上述實(shí)施例2 5的相關(guān)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，這些衍生的也具有同等的功能。這些序列包括1)SEQ ID No. 5 所示的序列；2) SEQ ID No. 2 (n30 為 SEQ ID No. 1 及 5)所示的序列；3)上述2)的序列由SEQ ID No. 1所示序列向5’端延伸5個(gè)核苷酸所得到的序列；4)上述2)的序列由SEQ ID No. 5所示序列向3，端延伸10個(gè)核苷酸所得到的序列；5)上述2)的序列由SEQ ID No. 1所示序列向5’端延伸12個(gè)核苷酸向3’端延伸 8個(gè)核苷酸所得到的序列。
權(quán)利要求
1.一種拮抗結(jié)核分枝桿菌表面脂糖的核酸適配子，其核苷酸序列為1)SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列；2)SEQ ID No. 1所示核苷酸序列經(jīng)替換、缺失和/或者插入一個(gè)或幾個(gè)核苷酸形成的具有SEQ ID No. 1同等功能的序列；或，3)含有SEQID No. 1所示核苷酸序列為核心序列并兩邊延長(zhǎng)的序列，如SEQ ID No. 2 由1)所述序列向3’和/或5’端延伸所得到的序列，其中SEQ ID No. 2中的n30為1)所述的核心序列。
2.權(quán)利要求1所述核酸適配子在制備結(jié)核病診斷試劑中的應(yīng)用。
3.含有權(quán)利要求1所述核酸適配子的診斷試劑。
4.權(quán)利要求1所示的核酸適配子在制備預(yù)防或治療結(jié)核病藥物中的應(yīng)用。
5.一種抗結(jié)核病藥物，其含有權(quán)利要求1所述的核酸適配子。
6.制備權(quán)利要求1所述核酸適配子的方法，其采用1)人工合成；2)不對(duì)稱PCR；或，3)采用PCR法，在其中一個(gè)引物中引入生物素標(biāo)記，PCR產(chǎn)物變性后用親和素分離。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種拮抗結(jié)核分枝桿菌表面脂糖的核酸適配子及其用途。該適配子是針對(duì)毒性結(jié)核分枝桿菌表面脂糖ManLAM的并具有抗結(jié)核感染和增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能的小分子單鏈DNA(ssDNA)，其核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。該小分子單鏈DNA具有與傳統(tǒng)抗結(jié)核藥物不同的新靶點(diǎn)和新結(jié)構(gòu)，具有直接封閉ManLAM的免疫抑制作用。該適配子制備簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉，確保了獲得的單鏈DNA適配子特異性的結(jié)合在毒性結(jié)核分枝桿菌表面，進(jìn)一步提高了治療的靶向性。克服了傳統(tǒng)上結(jié)核治療出現(xiàn)中日益嚴(yán)重的耐藥問(wèn)題和副作用大的問(wèn)題，可作為一種有效的新型抗結(jié)核藥物或結(jié)核病診斷試劑。
文檔編號(hào)C12R1/32GK102373213SQ20111036198
公開(kāi)日2012年3月14日 申請(qǐng)日期2011年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月16日
發(fā)明者潘勤, 王其龍, 章曉聯(lián) 申請(qǐng)人:章曉聯(lián)