專利名稱：奧爾森派琴蟲可視化環(huán)介導等溫擴增檢測試劑及檢測方法
技術領域：
本發(fā)明屬于環(huán)介導等溫擴增檢測技術領域，尤其涉及了可視化環(huán)介導等溫擴增 (LAMP)檢測技術在海水貝類奧爾森派琴蟲檢測中的應用。
背景技術：
派琴蟲是影響貝類養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要病原，為世界動物衛(wèi)生組織規(guī)定的必報水生動物疫病之一，可感染蛤仔、扇貝、牡蠣、鮑魚、貽貝等貝類。在歐洲、美洲和亞洲等海域均有過貝類感染的報道。2000年，我國黃海沿岸爆發(fā)了菲律賓蛤仔的大規(guī)模死亡，派琴蟲是其中危害最大的病原生物之一。在我國，目前由于派琴蟲的檢測技術有液體巰基醋酸鹽培養(yǎng)基(RFTM)培養(yǎng)方法、 PCR/熒光PCR檢測方法。如中國專利申請?zhí)枮?008102246547公開了一種用于派琴蟲檢測的實時熒光PCR引物和探針，所述的引物對特異性針對派琴蟲基因組DNA中ITS2序列的保守區(qū)域，所述探針特異性針對于該引物對擴增區(qū)域中的GC高含量區(qū)，該探針的5’端具有報告熒光染料標記，3’端具有淬滅熒光染料標記。但是液體巰基醋酸鹽培養(yǎng)基(RFTM)培養(yǎng)方法即可培養(yǎng)派琴蟲，也可以培養(yǎng)某些雙鞭毛類，缺乏專一性，而且僅能檢測到派琴蟲的休眠孢子，同時RFTM檢測方法需要7天時間，敏感度較低，只有當每克組織內原蟲數(shù)量高于 1000個時方可檢出，因此在實際工作中具有一定的局限性。對于PCR/熒光PCR檢測方法， 雖然其敏感性高、特異性強，但是其通常需要昂貴、精密的一起設備，對實驗環(huán)境和操作者技術要求也比較高，同時，由于PCR相關反應需要經(jīng)過DNA的熱變性、長時間的溫度循環(huán)等等，耗時較長，從3小時到20小時不等，不利于食品中毒的現(xiàn)場快速診斷和處理，所以目前情況來看，在實驗室研究中應用較多，在食品衛(wèi)生實際檢驗中由于相對要求比較高，推廣應用上有一定難度。環(huán)介導等溫擴增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是由日本的榮研株式會社的Notomi等人于2000年開發(fā)出來的一種新型的核酸擴增方法，其特點是針對靶基因的6個區(qū)域設計4種特異引物，在鏈置換DNA聚合酶的作用下，60 65°C恒溫擴增，15 60分鐘左右即可核酸擴增，效率可達IO9 101°個數(shù)量級，具有操作簡單、特異性強、快速靈敏、產(chǎn)物易檢測等特點。在DNA合成時，從脫氧核酸三磷酸基質中析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的鎂離子反應，產(chǎn)生大量焦磷酸鎂沉淀，呈現(xiàn)白色；或在有鈣黃綠素、 SYBR Green等顏色指示劑存在的情況下，反應產(chǎn)物呈現(xiàn)出特定的顏色。因此，可以把渾濁度或顏色作為反應的指標，只用肉眼觀察到白色渾濁沉淀或特定顏色，就能鑒定擴增與否， 而不需要繁瑣的電泳和染色過程。LAMP反應不需要PCR儀和昂貴的試劑，有著廣泛的應用前景。但是，目前尚未見有利用環(huán)介導等溫擴增(LAMP)對貝類奧爾森派琴蟲進行檢測的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種更方便、特異性強、成本低、通過肉眼直接檢測熒光來判斷結果的奧爾森派琴蟲可視化環(huán)介導等溫擴增(LAMP)檢測試劑及檢測方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術方案奧爾森派琴蟲可視化環(huán)介導等溫擴增檢測試劑，針對奧爾森派琴蟲的5. 8S核糖體RNA與內轉錄2間隔區(qū)序列，設計6條特異性LAMP擴增引物，其中包括兩條外引物F3和B3、兩條內引物FIP和BIP、兩條環(huán)引物 LF和LB ；所述擴增引物的核苷酸序列分別為
F3 為 5，-GCAGAATTCCGTGAACCAGT-3，， B3 為 5，-GGAGGGGCTACAATACGAGA-3’ ；
FIP 為 5，-CGGGAAGAAGAGCGACACTGAT-AAGTCTCAACGCATACTGCA-3，， BIP 為 5，-TGCTTTGTATCCCGCTTGGACT-ATACGCCTGCCTTCACAAG-3，； LF 為 5，-ACAAAGAGGAAAGATCCCCTTTG-3，， LB 為 5，-TCGGAGATAGTTCGTTATGTGCG-3，。所述的擴增引物加入反應試劑后共同組成LAMP檢測液體系，所述的反應試劑包括反應緩沖液Bst DNA polymerase bufferr、鏈置換DNA聚合酶、鎂離子、甜菜堿、脫氧核糖核苷三磷酸dNTPs、顏色指示劑。所述的顏色指示劑為鈣黃綠素和氯化錳，或是STOR Green0 SYBR Green是高靈敏的DNA熒光染料，應用于DNA和RNA的檢測，這些試劑可以在市場上購買得到。所述的LAMP檢測液體系中的各組分濃度分別為F3 0. 1 μ mol/L 2 μ mol/L, B3 0. 1 μ mol/L 2 μ mol/L, FIP 0. 8 μ mol/L 16 μ mol/L, BIP 0. 8 μ mol/L 16 μ mol/L, LF 0· 4 μ mol/L 8 μ mol/L, LB 0· 4 μ mol/L 8 μ mol/L,反應緩沖液Bst DNA polymerase buffer IX、鏈置換DNA聚合酶IU 40U、鎂離子0. 6 mmol/L 7 mmol/L、甜菜堿0. 1 mmol/L 2 mmol/L、脫氧核糖核苷三磷酸dNTPs 0.2 mmol/L 2 mmol/L、鈣黃綠素 6 μ mol/L 70 μ mol/L 和氯化猛 0. 05 mmol/L 1 mmol/L，或 1 X 10 X SYBR Green 代替鈣黃綠素6 μ mol/L 70 μ mol/L和氯化猛0. 05 mmol/L 1 mmol/L。所述的LAMP檢測液體系中的各組分濃度分別為F3 0. 6 μ mol/L, B3 0. 6 μ mol/ L，F(xiàn)IP 4. 8 μ mol/L, BIP 4. 8 μ mol/L, LF 2. 4 μ mol/L, LB 2. 4 μ mol/L，反應緩沖液 Bst DNA polymerase bufferl X (即1倍濃縮液)、鏈置換DNA聚合酶8U (即8單位)、鎂離子4mmol/ L、甜菜堿0. 2mmol/L、脫氧核糖核苷三磷酸dNTPs 0. 8mmol/L、鈣黃綠素25 μ mol/L和氯化錳 0. 25mmol/L，或用 4 X SYBR Green 代替鈣黃綠素 25 μ mol/L 和氯化錳 0. 25mmol/L。一種用上述的貝類奧爾森派琴蟲可視化環(huán)介導等溫擴增檢測試劑的檢測方法的檢測步驟包括
(1)提取待檢樣品的基因組DNA；
(2)配制LAMP檢測液體系；
(3)在LAMP檢測液體系中加入步驟(1)提取的待檢樣品基因組DNA；
(4)將步驟(3)配制的反應體系混合均勻；
(5)將步驟(4)的反應體系置于恒溫設備(可以是恒溫水浴鍋、恒溫干式加熱器、PCR儀或基因擴增儀等任選其一)；
(6)按反應程序進行擴增反應，反應程序依次為55°C 70°C30min 120 min， 80°C 100°C 5min,10°C 5min ；(7)反應結束后，根據(jù)顏色反應判斷檢測結果，判斷標準為肉眼直接觀察或在紫外光下觀察，呈現(xiàn)黃綠色熒光的樣品判斷為奧爾森派琴蟲感染陽性樣品，反之為陰性樣品。所述的配制LAMP檢測液體系為設計6條特異性LAMP擴增引物，其中包括兩條外引物F3和B3、兩條內引物FIP和BIP、兩條環(huán)引物LF和LB，所述的F3為 5，-GCAGAATTCCGTGAACCAGT-3，，所述的 B3 為 5，-GGAGGGGCTACAATACGAGA-3，，所述的 FIP 為 5，-CGGGAAGAAGAGCGACACTGAT-AAGTCTCAACGCATACTGCA-3，，所述的 BIP 為 5，-TGCTTTGTATCC CGCTTGGACT-ATACGCCTGCCTTCACAAG-3，，所述的 LF 為 5，-ACAAAGAGGAAAGATCCCCTTTG-3，，所述的LB為5’ -TCGGAGATAGTTCGTTATGTGCG-3’，然后在LAMP擴增引物中加入反應試劑。所述的反應試劑為反應緩沖液Bst DNA polymerase buffer IX、鏈置換DNA聚合酶IU 40U、鎂離子0. 6 mmol/L 7 mmol/L、甜菜堿0. 1 mmol/L 2 mmol/L、脫氧核糖核苷三磷酸dNIPs 0. 2 mmol/L 2 mmol/L、鈣黃綠素6 μ mol/L 70 μ mol/L和氯化錳 0. 05 mmol/L 1 mmol/L，或 1 X 10 X SYBR Green 代替鈣黃綠素 6 μ mol/L 70 μ mol/ L 和氯化錳 0. 05 mmol/L 1 mmol/L。所述的反應試劑為反應緩沖液Bst DNA polymerase buffer IX、鏈置換DNA聚合酶8U、鎂離子4mmol/L、甜菜堿0. 2mmol/L、脫氧核糖核苷三磷酸dNIPs 0. 8mmol/L、鈣黃綠素25 μ mol/L和氯化錳0. 25mmol/L,或4 X STOR Green代替鈣黃綠素25 μ mol/L和氯化錳 0.25mmol/L。
上述的反應程序依次優(yōu)選為60°C 60min,80°C 5min, 10°C 5min。在上述檢測方法中，如果使用鈣黃綠素和氯化錳作為顏色指示劑，則鈣黃綠素和氯化錳作為反應試劑中的一種，與其他反應試劑同時加入反應；如果使用STOR Green作為顏色指示劑，則是在樣品與其他反應試劑反應結束后，再加入STOR Green，進行顏色反應標識。即若使用鈣黃綠素和氯化錳作為顏色指示劑，在反應結束后，直接根據(jù)顏色反應判斷檢測結果；若使用STOR Green代替鈣黃綠素和氯化錳，則在反應結束后，在擴增產(chǎn)物中加入 SYBR Green，再根據(jù)顏色反應判斷檢測結果。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點
1.檢測操作簡單方便，成本低，適用于更多的基層單位。本發(fā)明的檢測方法，不需要專門的技術人員全程操作，而且使用的儀器簡單，如干式恒溫儀、水浴鍋等就可以了，也可以在基因擴增儀上進行基因擴增，通過肉眼直接觀察顏色或熒光就可對結果進行判斷。2.敏感性高，特異性強。


圖1是可視化LAMP敏感性試驗結果圖
1-1.IOng ； 1-2. Ing ； 1-3. IOOpg ； 1-4. IOpg ； 1-5. Ipg ； 1-6. IOOfg ； 1-7. IOfg ； 1-8.陰性對照。圖2是可視化LAMP特異性試驗結果圖
2-1，2-2，2-3.奧爾森派派琴蟲陽性樣品；2-4.其它亞種派琴蟲；2-5.單孢子蟲；2-6. 馬爾太蟲；2-7.正常貝類組織；2-8.陰性對照；
圖3是本發(fā)明一實施例的肉眼直接觀察結果圖圖中3-1 3-6為奧爾森派琴蟲陽性樣品，呈黃綠色；3-7為陰性樣品；
圖4是本發(fā)明一實施例的紫外線下觀察結果圖
圖中 4_6為奧爾森派琴蟲陽性樣品，呈黃綠色；4-7為陰性樣品。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發(fā)明進一步說明。實施例1
(1)樣品DNA提取取待檢貝類腮組織25g，按海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒 (TIANGEN, DP324-02)說明提取基因組總DNA，_20°C保存?zhèn)溆谩?2 ) LAMP檢測液體系配制
①針對奧爾森派琴蟲的5. 8S核糖體RNA與內轉錄2間隔區(qū)序列，設計6條特異性 LAMP擴增引物
F3 為 5，-GCAGAATTCCGTGAACCAGT-3，， B3 為 5，-GGAGGGGCTACAATACGAGA-3’ ；
FIP 為 5，-CGGGAAGAAGAGCGACACTGAT-AAGTCTCAACGCATACTGCA-3，， BIP 為 5，-TGCTTTGTATCCCGCTTGGACT-ATACGCCTGCCTTCACAAG-3，； LF 為 5，-ACAAAGAGGAAAGATCCCCTTTG-3，， LB 為 5，-TCGGAGATAGTTCGTTATGTGCG-3，；
反應試劑反應緩沖液Bst DNA polymerase bufferr、鏈置換DNA聚合酶、鎂離子、甜菜堿、脫氧核糖核苷三磷酸dNTPs、鈣黃綠素和氯化錳。②在PCR管中，依次加入上述奧爾森派琴蟲LAMP檢測液體系所需的各種試劑，試劑的加入量和濃度分別如下
1. 5 μ L 10 μ mol/L 的 F3 (終濃度 0. 6 μ mol/L), 1. 5 μ L 10 μ mol/L 的 Β3 (終濃度 0. 6 μ mol/L), L 5 μ L 80 μ mol/L 的 FIP(終濃度 4. 8 μ mol/L), L 5 μ L 80 μ mol/L 的 BIP (終濃度 4. 8 μ mol/L), 40 μ mol/L LF 1. 5 μ L (終濃度 2. 4 μ mol/L), 1. 5 μ L 40 μ mol/L 的 LB (終濃度 2· 4ymol/L)，2· 5μ L 10Χ 反應緩沖液 Bst DNA polymerase bufferr (終濃度1 X )，1 μ L 8U/ μ L的鏈置換DNA聚合酶(終濃度8U)，4 μ L 25 μ mol/L的鎂離子(終濃度4mmol/L)，lyL 5mmol/L 的甜菜堿(終濃度 0. 2mmol/L)，2 μ L 10 mmol/L 的脫氧核糖核苷三磷酸dNIPs (終濃度0. 8mmol/L), IyL 625 μ mol/L鈣黃綠素(終濃度25 μ mol/L) 和 0. 5 μ L 12. 5mmol/L 氯化錳(終濃度 0. 25mmol/L), 2 μ L 滅菌 dH20。(3)在LAMP檢測液體系加入提取的待檢樣品DNA 2 μ L。試驗同時設立空白對照， 以dH20代替DNA作為模板。將上述配制好的含LAMP反應體系的PCR反應管置于恒溫水浴鍋，設定反應程序進行擴增反應，反應程序為60°C 60min,80°C 5min, 10°C 5min。(4)結果判定
反應結束后，根據(jù)反應管顏色判定結果
①直接用肉眼觀察反應液的顏色變化，反應液呈現(xiàn)黃綠色顏色則待檢樣品為奧爾森派琴蟲陽性，反之為陰性；
②在紫外光下用肉眼觀察反應液的顏色變化，反應液出現(xiàn)黃綠色熒光則待檢樣品為奧爾森派琴蟲陽性，反之為陰性。實施例2
(1)樣品DNA提取取待檢貝類消化腺組織25g，按海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN，DP324-02)說明提取基因組總DNA，_20°C保存?zhèn)溆谩?2 ) LAMP檢測液體系配制
①針對奧爾森派琴蟲的5. 8S核糖體RNA與內轉錄2間隔區(qū)序列，設計6條特異性 LAMP擴增引物
F3 為 5，-GCAGAATTCCGTGAACCAGT-3，， B3 為 5，-GGAGGGGCTACAATACGAGA-3’ ；
FIP 為 5，-CGGGAAGAAGAGCGACACTGAT-AAGTCTCAACGCATACTGCA-3，， BIP 為 5，-TGCTTTGTATCCCGCTTGGACT-ATACGCCTGCCTTCACAAG-3，； LF 為 5，-ACAAAGAGGAAAGATCCCCTTTG-3，， LB 為 5，-TCGGAGATAGTTCGTTATGTGCG-3，；
反應試劑反應緩沖液Bst DNA polymerase bufferr、鏈置換DNA聚合酶、鎂離子、甜菜堿、脫氧核糖核苷三磷酸dNTPs、鈣黃綠素和氯化錳。②在PCR管中，依次加入上述奧爾森派琴蟲LAMP檢測液體系所需的各種試劑，試劑的加入量和濃度分別如下
0. 5 μ L 10 μ mol/L 的 F3 (終濃度 0. 1 μ mol/L)，0. 5 μ L 10 μ mol/L 的 B3 (終濃度 0. 1μ θ1/υ，0· 5μ L 80 μ mol/L ^ FIP (^ ^ 0. 8 μ mol/L), 0. 5 μ L 80 μ mol/ L 的 BIP (終濃度 0· 8 μ mol/L), 0. 5 μ L 40 μ mol/L 的 LF (終濃度 0. 4 μ mol/L), 0. 5 μ L 40 μ mol/L 的 LB (終濃度 0· 4 μ mol/L)，2· 5 μ L 10Χ 反應緩沖液 Bst DNA polymerase ^1 6燈(終濃度1\)，14 1^ 8U/yL的鏈置換DNA聚合酶(終濃度8U)，0. 6yL 25 μ mol/ L的鎂離子(終濃度0. 6mmol/L),0. 5 μ L 5 mmol/L的甜菜堿(終濃度0. lmmol/L)，0. 5 μ L 10 mmol/L的脫氧核糖核苷三磷酸dNIPs (終濃度0. 2mmol/L)，0. M μ L 625 μ mol/L的鈣黃綠素(終濃度6 μ mol/L)和0. 1 μ L 12. 5mmol/L的氯化錳(終濃度0. 05mmol/L), 14. 56 μ L 滅菌 dH20。(3)在LAMP檢測液體系加入提取的待檢樣品DNA 2 μ L。試驗同時設立空白對照， 以dH20代替DNA作為模板。將上述配制好的含LAMP反應體系的PCR反應管置于基因擴增儀，設定反應程序進行擴增反應，反應程序為70°C 30min,80°C 5min, 10°C 5min。(4)結果判定
反應結束后，根據(jù)反應管顏色判定結果
①直接用肉眼觀察反應液的顏色變化，反應液呈現(xiàn)黃綠色顏色則待檢樣品為奧爾森派琴蟲陽性，反之為陰性；
②在紫外光下用肉眼觀察反應液的顏色變化，反應液出現(xiàn)黃綠色熒光則待檢樣品為奧爾森派琴蟲陽性，反之為陰性。實施例3
(1)樣品DNA提取取待檢奧爾森派琴蟲培養(yǎng)物25g，按海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN，DP324-02)說明提取基因組總DNA，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> (2 ) LAMP檢測液體系配制
①針對奧爾森派琴蟲的5. 8S核糖體RNA與內轉錄2間隔區(qū)序列，設計6條特異性 LAMP擴增引物
F3 為 5，-GCAGAATTCCGTGAACCAGT-3，， B3 為 5，-GGAGGGGCTACAATACGAGA-3’ ；
FIP 為 5，-CGGGAAGAAGAGCGACACTGAT-AAGTCTCAACGCATACTGCA-3，， BIP 為 5，-TGCTTTGTATCCCGCTTGGACT-ATACGCCTGCCTTCACAAG-3，； LF 為 5，-ACAAAGAGGAAAGATCCCCTTTG-3，， LB 為 5，-TCGGAGATAGTTCGTTATGTGCG-3，；
反應試劑反應緩沖液Bst DNA polymerase bufferr、鏈置換DNA聚合酶、鎂離子、甜菜堿、脫氧核糖核苷三磷酸dNTPs、鈣黃綠素和氯化錳。②配制LAMP擴增弓I物混合液
按以下使用量將6條LAMP引物混合成配制成引物混合液100ymOl/L&F3 0. 5 μ L, lOOymol/L 的 Β3 0· 5μ L，200ymol/L 的 FIP 2 μ L，200 μ mol/L 的 BIP 2μ L, 200ymol/L&F3 1 μ L，200 μ mol/L 的 Β3 lyL，滅菌 dH20 3 μ L，混合均勻，-20°C保存③配制鈣黃綠素和氯化錳混合液
按以下使用量配制鈣黃綠素和氯化錳混合液625 μ mol/L的鈣黃綠素10 μ L (終濃度 25 μ mol/L)和12. 5mmol/L的氯化錳5 μ L，混合均勻備用，4°C避光保存?zhèn)溆谩＂茉赑CR管中，依次加入上述奧爾森派琴蟲LAMP檢測液體系所需的各種試劑，試劑的加入量和濃度分別如下
3 μ L步驟②配制的擴增引物混合液(終濃度分別為F3 0.6 μ mol/L、B3 0. 6 μ mol/ L、FIP 4. 8ymol/L、BIP 4. 8ymol/L>LF 2. 4ymol/L>LB 2. 4 μ mol/L), 2. 5 μ L 10X 反應緩沖液Bst DNA polymerase bufferr (終濃度1 X )，1 μ L 8U/μ L的鏈置換DNA聚合酶(終濃度8U)，4yL 25ymol/L的鎂離子(終濃度4mmol/L)，lyL 5mmol/L的甜菜堿 (終濃度0. 2mmol/L)，2yL 10 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸dNIPs (終濃度0. 8mmol/L)， 1. 5 μ L步驟③配制的鈣黃綠素和氯化錳混合液(終濃度分別為25 μ mol/L和0. 25mmol/L), 9μ L 滅菌 dH20。(3)在LAMP檢測液體系加入提取的待檢樣品DNA IyL0試驗同時設立空白對照， 以dH20代替DNA作為模板。將上述配制好的含LAMP反應體系的PCR反應管置于恒溫干式加熱器，設定反應程序進行擴增反應，反應程序為55°C 120min, IOO0C 5min, 10°C 5min。(4)結果判定
反應結束后，根據(jù)反應管顏色判定結果
①直接用肉眼觀察反應液的顏色變化，反應液呈現(xiàn)黃綠色顏色則待檢樣品為奧爾森派琴蟲陽性，反之為陰性；
②在紫外光下用肉眼觀察反應液的顏色變化，反應液出現(xiàn)黃綠色熒光則待檢樣品為奧爾森派琴蟲陽性，反之為陰性。實施例4 (1)樣品DNA提取取待檢貝類腮組織25g，按海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒 (TIANGEN, DP324-02)說明提取基因組總DNA，_20°C保存?zhèn)溆谩?2 ) LAMP檢測液體系配制
①針對奧爾森派琴蟲的5. 8S核糖體RNA與內轉錄2間隔區(qū)序列，設計6條特異性 LAMP擴增引物
F3 為 5，-GCAGAATTCCGTGAACCAGT-3，， B3 為 5，-GGAGGGGCTACAATACGAGA-3’ ；
FIP 為 5，-CGGGAAGAAGAGCGACACTGAT-AAGTCTCAACGCATACTGCA-3，， BIP 為 5，-TGCTTTGTATCCCGCTTGGACT-ATACGCCTGCCTTCACAAG-3，； LF 為 5，-ACAAAGAGGAAAGATCCCCTTTG-3，， LB 為 5，-TCGGAGATAGTTCGTTATGTGCG-3，；
反應試劑反應緩沖液Bst DNA polymerase bufferr、鏈置換DNA聚合酶、鎂離子、甜菜堿、脫氧核糖核苷三磷酸dNTPs、SYBR Green0②配制LAMP擴增弓I物混合液
按以下使用量將6條LAMP引物混合成配制成引物混合液0. 5 μ L 100 μ mol/L的 F3,0. 5μ L 100 μ mol/L 的 Β3，2 μ L 200 μ mol/L 的 FIP，2 μ L 200 μ mol/L 的 ΒΙΡ，1 μ L 200 μ mol/L 的 F3，1 μ L 200 μ mol/L 的 Β3，3 μ L 滅菌 dH20,混合均勻，_20°C保存?zhèn)溆?。③配制SYBR Green工作液
按廈門百維信生物科技有限公司提供的STOR Green試劑使用說明書，將STOR Green 試劑用滅菌dH20按1 :100倍稀釋成工作液，4°C避光保存?zhèn)溆?。④在PCR管中，依次加入上述奧爾森派琴蟲LAMP檢測液體系所需的各種試劑， 試劑的加入量和濃度分別如下3 μ L上述步驟②配制的擴增引物混合液(終濃度分別為 F3 0.6 μ mol/L、Β3 0· 6 μ mol/L、FIP 4· 8 μ mol/L、BIP 4.8 μ mol/L、LF 2.4 μ mol/L、LB 2. 4 μ mol/L), 2. 5μ L 10Χ 反應緩 7 中液 Bst DNA polymerase bufferr (終濃度 1 X )，1 μ L 8U/yL的鏈置換DNA聚合酶(終濃度8U)，4yL 25 μ mol/L的鎂離子(終濃度4mmol/L)， IuL 5 mmol/L的甜菜堿(終濃度0. 2πιπι01/1)，2μ lOmmol/L的脫氧核糖核苷三磷酸 dNTPs (終濃度 0. 8mmol/L), 10. 5 μ L 滅菌 dH20。(3)在LAMP檢測液體系加入提取的待檢樣品DNA IyL0試驗同時設立空白對照， 以dH20代替DNA作為模板。將上述配制好的含LAMP反應體系的PCR反應管置于恒溫干式加熱器，設定反應程序進行擴增反應，反應程序為60°C 60min,90°C 5min, 10°C 5min。(4)結果判定
反應結束后取出反應管，加入1 μ L SYBR Green工作液，根據(jù)顏色判定結果
①直接用肉眼觀察反應液的顏色變化，反應液呈現(xiàn)黃綠色顏色則待檢樣品為奧爾森派琴蟲陽性，反之為陰性；
②在紫外光下用肉眼觀察反應液的顏色變化，反應液出現(xiàn)黃綠色熒光則待檢樣品為奧爾森派琴蟲陽性，反之為陰性。核苷酸序列表
<110>廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所<120>貝類奧爾森派琴蟲可視化環(huán)介導等溫擴增檢測試劑及檢測方法
<160>6
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<221>prim-bind
<222> (1) · · · (20)
<400>1
GCAGAATTCCGTGAACCAGT <210>2 <211>20 <212>DNA <213>人工序列 <221>prim-bind <222> (1) · · · (20) <400>2
GGAGGGGCTACAATACGAGA
<210>3
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<221>prim-bind
<222> (1) · · · (42)
<400>3
CGGGAAGAAGAGCGACACTGAT-AAGTCTCAACGCATACTGCA
<210>4
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<221>prim-bind
<222> (1) · · · (41)
<400>4
TGCTTTGTATCCCGCTTGGACT-ATACGCCTGCCTTCACAAG
<210>5
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<221>prim-bind<222> (1)··· (23) <400>5
ACAAAGAGGAAAGATCCCCTTTG <210>6 <211>23 <212>DNA <213>人工序列 <221>prim-bind <222> (1) · · · (23) <400>6
TCGGAGATAGTTCGTTATGTGCG
權利要求
1.奧爾森派琴蟲可視化環(huán)介導等溫擴增檢測試劑，其特征在于針對奧爾森派琴蟲的5. 8S核糖體RNA與內轉錄2間隔區(qū)序列，設計6條特異性LAMP擴增引物，其中包括兩條外引物F3和B3、兩條內引物FIP和BIP、兩條環(huán)引物LF和LB，所述的F3為 5，-GCAGAATTCCGTGAACCAGT-3，，所述的 B3 為 5，-GGAGGGGCTACAATACGAGA-3，，所述的 FIP 為 5，-CGGGAAGAAGAGCGACACTGAT-AAGTCTCAACGCATACTGCA-3，，所述的 BIP 為 5，-TGCTTTGTATCC CGCTTGGACT-ATACGCCTGCCTTCACAAG-3，，所述的 LF 為 5，-ACAAAGAGGAAAGATCCCCTTTG-3，，所述的 LB 為 5' -TCGGAGATAGTTCGTTATGTGCG-3'。
2.根據(jù)權利要求1所述的奧爾森派琴蟲可視化環(huán)介導等溫擴增檢測試劑，其特征在于所述的擴增引物加入反應試劑后共同組成LAMP檢測液體系，所述的反應試劑包括反應緩沖液Bst DNA polymerase bufferr、鏈置換DNA聚合酶、鎂離子、甜菜堿、脫氧核糖核苷三磷酸dNTPs、顏色指示劑。
3.根據(jù)權利要求2所述的奧爾森派琴蟲可視化環(huán)介導等溫擴增檢測試劑，其特征在于所述的顏色指示劑為鈣黃綠素和氯化錳，或是STOR Green0
4.根據(jù)權利要求3所述的奧爾森派琴蟲可視化環(huán)介導等溫擴增檢測試劑，其特征在于所述的LAMP檢測液體系中的各組分濃度分別為F3 0. lymol/L 2μπι01/1，Β3 0. 1 μ mol/L 2 μ mol/L, FIP 0. 8 μ mol/L 16 μ mol/L, BIP 0. 8 μ mol/L 16 μ mol/L, LF 0. 4 μ mol/L ~ 8 μ mol/L, LB 0· 4 μ mol/L 8 μ mol/L,反應緩沖液 Bst DNA polymerase buffer IX、鏈置換DNA聚合酶IU 40U、鎂離子0. 6 mmol/L 7 mmol/L、甜菜堿0. 1 mmol/L 2 mmol/L、脫氧核糖核苷三磷酸dNTPs 0.2 mmol/L 2 mmol/L、鈣黃綠素 6 μ mol/L 70 μ mol/L 和氯化猛 0. 05 mmol/L 1 mmol/L，或 1 X 10 X SYBR Green 代替鈣黃綠素6 μ mol/L 70 μ mol/L和氯化猛0. 05 mmol/L 1 mmol/L。
5.根據(jù)權利要求3所述的奧爾森派琴蟲可視化環(huán)介導等溫擴增檢測試劑，其特征在于所述的LAMP檢測液體系中的各組分濃度分別為F3 0.6 μ mol/L, B3 0.6 μ mol/L, FIP 4. 8 μ mol/L, BIP 4. 8 μ mol/L, LF 2. 4 μ mol/L, LB 2· 4 μ mol/L，反應緩沖液 Bst DNA polymerase buffer 1 X、鏈置換 DNA 聚合酶 8U、鎂離子 4mmol/L、甜菜堿 0. 2mmol/L、脫氧核糖核苷三磷酸dNIPs 0. 8mmol/L、鈣黃綠素25 μ mol/L和氯化錳0. 25mmol/L,或4X SYBR Green代替鈣黃綠素25 μ mol/L和氯化錳0. 25mmol/L。
6.一種用權利要求1 5任一所述的奧爾森派琴蟲可視化環(huán)介導等溫擴增檢測試劑的檢測方法，其特征在于所述檢測方法的檢測步驟包括(1)提取待檢樣品的基因組DNA；(2)配制LAMP檢測液體系；(3)在LAMP檢測液體系中加入步驟(1)提取的待檢樣品基因組DNA；(4)將步驟(3)配制的反應體系混合均勻；(5)將步驟(4)的反應體系置于恒溫設備；(6)按反應程序進行擴增反應，反應程序依次為55°C 70°C30min 120 min, 80°C 100°C 5min,10°C 5min ；(7)反應結束后，根據(jù)顏色反應判斷檢測結果，判斷標準為肉眼直接觀察或在紫外光下觀察，呈現(xiàn)黃綠色熒光的樣品判斷為奧爾森派琴蟲感染陽性樣品，反之為陰性樣品。
7.根據(jù)權利要求6所述的用奧爾森派琴蟲可視化環(huán)介導等溫擴增檢測試劑的檢測方法，其特征在于所述的配制LAMP檢測液體系為設計6條特異性LAMP擴增引物，其中包括兩條外引物F3和B3、兩條內引物FIP和BIP、兩條環(huán)引物LF和LB，所述的F3為 5，-GCAGAATTCCGTGAACCAGT-3，，所述的 B3 為 5，-GGAGGGGCTACAATACGAGA-3，，所述的 FIP 為 5，-CGGGAAGAAGAGCGACACTGAT-AAGTCTCAACGCATACTGCA-3，，所述的 BIP 為 5，-TGCTTTGTATCC CGCTTGGACT-ATACGCCTGCCTTCACAAG-3，，所述的 LF 為 5，-ACAAAGAGGAAAGATCCCCTTTG-3，，所述的LB為5’ -TCGGAGATAGTTCGTTATGTGCG-3’，然后在LAMP擴增引物中加入反應試劑。
8.根據(jù)權利要求7所述的用奧爾森派琴蟲可視化環(huán)介導等溫擴增檢測試劑的檢測方法，其特征在于所述的反應試劑為反應緩沖液Bst DNA polymerase buffer IX、鏈置換 DNA 聚合酶 IU 40U、鎂離子 0. 6 mmol/L 7 mmol/L、甜菜堿 0. 1 mmol/L 2 mmol/L、 脫氧核糖核苷三磷酸dNTPs 0. 2 mmol/L 2 mmol/L、鈣黃綠素6 μ mol/L 70 μ mol/L和氯化猛0· 05 mmol/L 1 mmol/L，或1 X 10 X SYBR Green代替鈣黃綠素6 μ mol/L 70 μ mol/L 和氯化錳 0. 05 mmol/L 1 mmol/L。
9.根據(jù)權利要求8所述的用奧爾森派琴蟲可視化環(huán)介導等溫擴增檢測試劑的檢測方法，其特征在于所述的反應試劑為反應緩沖液Bst DNA polymerase buffer IX、鏈置換 DNA聚合酶8U、鎂離子4mmol/L、甜菜堿0. 2mmol/L、脫氧核糖核苷三磷酸dNIPs 0. 8mmol/L、 鈣黃綠素25 μ mol/L和氯化錳0. 25mmol/L,或4 X SYBR Green代替鈣黃綠素25 μ mol/L和氯化猛 0. 25mmol/L。
10.根據(jù)權利要求6所述的用奧爾森派琴蟲可視化環(huán)介導等溫擴增檢測試劑的檢測方法，其特征在于所述的反應程序依次為60°C 60min,80°C 5min, 10°C 5min。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種奧爾森派琴蟲可視化環(huán)介導等溫擴增檢測試劑及檢測方法，針對奧爾森派琴蟲的5.8S核糖體RNA與內轉錄2間隔區(qū)序列，設計6條特異性LAMP擴增引物，其中包括兩條外引物F3和B3、兩條內引物FIP和BIP、兩條環(huán)引物LF和LB，擴增引物和反應試劑共同組成LAMP檢測液體系，反應試劑包括反應緩沖液BstDNApolymerasebufferr、鏈置換DNA聚合酶、鎂離子、甜菜堿、脫氧核糖核苷三磷酸dNTPs、顏色指示劑；本發(fā)明的檢測方法在敏感性高、特異性強的前提下使用的儀器簡單，成本低，適用于更多的基層單位。
文檔編號C12Q1/68GK102363812SQ201110362400
公開日2012年2月29日 申請日期2011年11月16日 優(yōu)先權日2011年11月16日
發(fā)明者劉加波, 龐耀珊, 范晴, 謝麗基, 謝志勤, 謝芝勛, 鄧顯文 申請人:廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所