專利名稱：紅串紅球菌及其在微生物催化制備手性芳香醇中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一株新菌株-紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis) WZ010，及
其在選擇性氧化混旋芳香醇制備R-型芳香醇和不對稱還原芳香酮生成S-型芳香醇中的應用。
背景技術：
手性芳香醇是一類具有一個或多個苯環(huán)結(jié)構的手性醇，是20多種芳香醇胺類藥物的重要中間體。其中，比較典型的藥物有Isoproternol、Colterol, Phenylephrine, Bitolerol,還有最新的抗抑郁藥物Tomozetine, Fluoxetine和Nisoxetine等。手性芳香醇的兩種對映體都可以作為藥物合成的中間體，而且效果明顯不同，如R-氟西汀 (Fluoxetine)是抗抑郁藥，而S-異構體能預防偏頭痛，兩者功效不同；R-沙丁胺醇是治療喘息性支氣管炎癥，S-型異構體幾乎無治療支氣管哮喘的作用。因此，獲得單一對映體的手性醇是合成這類藥物的關鍵。化學法合成手性芳香醇，往往需要昂貴的過度金屬或手性配體，操作條件苛刻，有機溶劑用量大。相對地，利用生物法催化制備手性芳香醇具有反應條件溫和，立體選擇性高，環(huán)境友好，易于分離回收及生產(chǎn)成本低等優(yōu)點。目前生物法催化生成手性芳香醇方法主要有選擇性氧化、不對稱還原、脂肪酶不對稱酯化、氧化酶羥基化等。盡管相關研究報道較多，這些微生物催化劑還存在一定的局限性，發(fā)現(xiàn)新的生物催化劑仍十分必要與迫切。目前尚未見有關于利用紅串紅球菌微生物轉(zhuǎn)化生成手性芳香醇的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一株具有高立體選擇性和高酶活力的新菌株——紅串紅球菌WZOlO 及其在手性芳香醇合成中的應用。該菌株既可通過選擇性氧化混旋芳香醇得到R-型芳香醇，也可通過不對稱還原芳香酮生成S-型芳香醇，反應專一性強，轉(zhuǎn)化率高，反應不需要外加輔酶。本發(fā)明采用的技術方案是紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis) WZ010，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學，430072，保藏編號=CCTCC No =M 2011336，保藏日期:2011
年9月四日。本發(fā)明紅串紅球菌WZOlO的16S rDNA序列如下ATGCAGTCGAGCGGTAAGGCCTTTCGGGGTACACGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCT GCCCTGCACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACCTCCTATCGCATGGTGGGTGGTGGA AAGATTTATCGGTGCAGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGG TAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGA ATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTC AGCAGGGACGAAGCGCAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTGTCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGTTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCGTTTGTGAAAACCAG CAGCTCAACTGCTGGCTTGCAGGCGATACGGGCAGACTTGAGTACTGCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGG TGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCAGTAACTGACGCTGAGGAACGAAA GCGTGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCGCTAGGTGTGGGTTCCTTCCA CGGAATCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATT GACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTGACATA TACCGGAAAGCTGCAGAGATGTGGCCCCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCG TGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCTTATGTTGCCAGCACGTTATGGTGGGGACTCGTAA GAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACAC ATGCTACAATGGCCAGTACAGAGGGCTGCGAGACCGTGAGGTGGAGCGAATCCCTTAAAGCTGGTCTCAGTTCGGAT CGGGGTCTGCAACTCGACCCCGTGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCC CGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCTTAACCCCTTGTGGGAG GCAGCCGTCGAACGGG樣品采集篩選所用的土樣分別從山東、湖北、內(nèi)蒙古等地采集。本發(fā)明紅串紅球菌WZ010篩選自中國湖北省荊州市監(jiān)利縣的菜園土壤。平板初篩稱取0. 5g 土樣加入ImL的無菌水，搖勻，靜置，上清液用無菌水稀釋 1000倍，然后取其100 μ L涂布固體平板，放置3 5分鐘，吸取150 μ L混旋1-苯乙醇再次涂布上述平板，30°C倒置過夜培養(yǎng)。挑取長出的單菌落轉(zhuǎn)接于固體試管斜面，30°C過夜培養(yǎng)。固體培養(yǎng)基的組分蛋白胨1%，酵母浸膏0. 5%，NaCl 0. 5%，瓊脂2%，pH7.0 7. 2， 121°C滅菌20min。本發(fā)明的培養(yǎng)基組成均以質(zhì)量體積百分比(W/V)表示，如某組分濃度表示IOOmL培養(yǎng)基中含有Ig該組分。 將斜面菌株接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，其組分如下蛋白胨1 %，酵母浸膏0. 5 %，NaCl 0. 5%, pH7. 0 7. 2，121°C滅菌20min。30°C搖床轉(zhuǎn)速200rpm培養(yǎng)24 48小時，離心后得到菌體懸浮于緩沖液體系中。按照上述方法得到的濕菌體，懸浮在緩沖液體系中，加入混旋芳香醇或者芳香酮進行反應，反應1 72小時后，用手性氣相色譜分析底物和其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。芳香醇對映體過量值的氣相檢測條件檢測儀器=Shimadzu GC-2014氣相色譜儀手性氣相柱CP-ChirasilDEX CB檢測條件柱溫，140°C恒溫；檢測器和進樣器溫度，250°C ；進樣量，1 μ L ；分流比， 1 49 ；檢測器，F(xiàn)ID ；載氣，Ν2。本發(fā)明還涉及所述的紅串紅球菌WZ010在選擇性氧化混旋芳香醇制備R-型芳香醇中的應用。所述芳香醇為1-苯乙醇、1-苯丙醇或扁桃酸甲酯，初始濃度可為10 200mM。所述選擇性氧化在pH 8. 0 8. 8的Tris-HCl緩沖液或pH 8. 8 11. 0的甘氨酸-氫氧化鈉的緩沖液中進行。具體的，所述選擇性氧化反應為以40 200mM混旋芳香醇為底物，以紅串紅球菌 WZ010的濕菌體為催化劑，在PH8 11的緩沖液中，于4 50°C下反應1 48小時，反應結(jié)束后反應液經(jīng)乙酸乙酯萃取，離心得到有機相，無水硫酸鈉干燥后，對底物及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進行手性氣相色譜分析。本發(fā)明還涉及所述的紅串紅球菌WZ010在不對稱還原芳香酮生成S-型芳香醇中的應用。所述芳香酮為苯乙酮、苯丙酮、苯甲酰甲酸乙酯或?qū)β缺揭彝跏紳舛瓤蔀?10 200mM。所述不對稱還原在pH6. 0 7. 0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液或pH 7. 0 8. 5的Tris-HCl緩沖液中進行。所述不對稱還原在葡萄糖、甘油、異丙醇或乙醇作為共底物存在下進行。所述共底物初始濃度可為底物初始濃度的5 20倍。具體的，所述的不對稱還原反應為以10 IOOmM芳香酮為底物，以10倍底物濃度的葡萄糖為共底物，以紅串紅球菌WZ010的濕菌體為催化劑，在PH 6. 0 8. 5的緩沖液中，于4 50°C下反應1 72小時，反應結(jié)束后反應液經(jīng)乙酸乙酯萃取，離心得到有機相， 無水硫酸鈉干燥后，對底物及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進行手性氣相色譜分析。在上述的氧化和還原反應中，濕菌體相對于所述緩沖液的添加量為45 450g/L。 氧化和還原反應在4 50°C、搖床轉(zhuǎn)速0 200rpm下進行，反應時間2 72小時。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在提供了一株具有高立體選擇性、高酶活性的新菌株，通過該菌株菌體選擇性氧化和不對稱還原可同時得到R-芳香醇和S-芳香醇，該菌株的反應專一性強，催化活性高，大大降低了生產(chǎn)成本，并且對環(huán)境污染小，適合工業(yè)化生產(chǎn)。


圖1為溫度與紅串紅球菌催化活力的關系；圖2為pH與紅串紅球菌WZ010催化活力的關系；“ □”表示氧化反應；“▲”表示
還原反應；圖3為在不對稱還原反應中不同共底物與轉(zhuǎn)化率的關系。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此實施例1 紅串紅球菌WZ010(CCTCC NO =M 2011336)的發(fā)酵培養(yǎng)基組成蛋白胨1. 0%、酵母浸膏 0. 5%, NaCl 0. 5%，溶劑為水，pH7. 0 7. 2，121°C滅菌 20min。紅串紅球菌WZ010接種于50ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30°C、搖床轉(zhuǎn)速200rpm的條件下培養(yǎng)12 48小時。發(fā)酵液在6000rpm離心15min后，棄上清液，菌體用反應緩沖液洗滌一次，所得濕菌體即為生物催化劑。實施例2 在2mL氧化反應體系中，分別含有50mM甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH10. 5)、0. 18g 紅串紅球菌濕菌體、40mM混旋1-苯乙醇。在不同的溫度下反應4小時。反應后，反應液在 6000rpm離心15min，取ImL上清與ImL乙酸乙酯等體積混合，放入搖床在30°C和200rpm下萃取1 2小時。萃取液在6000rpm離心lOmin，取有機相400 μ L，加入過量無水Na2SO4干燥，對底物及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進行手性氣相色譜分析，結(jié)果見圖1。由圖1結(jié)果可知，紅串紅球菌WZ010對1-苯乙醇在4 60°C都具有催化活力，而在30°C下催化活力最高。實施例3 在2mL氧化反應體系中，分別含有pH 8. 0 8. 8的Tris-HCl緩沖液或pH 8. 8 11. 0的甘氨酸-氫氧化鈉的緩沖液(50mM)、0. 18g紅串紅球菌濕菌體、40mM混旋1_苯乙醇。 在30°C和不同pH下反應4小時。反應后，反應液在6000rpm離心15min，取ImL上清與ImL 乙酸乙酯等體積混合，放入搖床在30°C和200rpm下萃取1 2小時。萃取液在6000rpm離心lOmin，取有機相400 μ L，加入過量無水Na2SO4干燥，對底物及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進行手性氣相色譜分析，結(jié)果見圖2。由圖2結(jié)果可知，紅串紅球菌WZOlO在ρΗ8 11之間都有活力，并且其催化活力隨著PH的增加而增高。在2mL還原反應體系中，分別含有pH6. O 7. O的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液或pH 7. O 8. O 1Tris-HCl緩沖液(50mM)、10倍底物濃度的葡萄糖，0. 18g紅串紅球菌濕菌體、IOmM混旋苯乙酮，在30°C和不同pH下反應4小時。反應結(jié)束后，反應液在6000rpm離心15min，取ImL上清與ImL乙酸乙酯等體積混合，放入搖床在30°C和200rpm下萃取1 2小時。萃取液在6000rpm離心lOmin，取有機相400 μ L，加入過量無水Na2SO4干燥，對底物及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進行手性氣相色譜分析，結(jié)果見圖2。由圖2結(jié)果可知，紅串紅球菌WZOlO在pH6. O 8. 5之間都有活力，最適pH范圍在7. 5 8. O并且其催化活力隨著pH的增加而增高。實施例4 紅串紅球菌WZOlO選擇性氧化混旋1-苯乙醇在3mL氧化反應體系中，分別含有 PH 10. 5的甘氨酸-氫氧化鈉的緩沖液(50mM)、0. 9g紅串紅球菌濕菌體、40 160mM混旋 1-苯乙醇。在30°C和200rpm下反應10 48小時。紅串紅球菌WZOlO選擇性氧化混旋1-苯丙醇在3mL氧化反應體系中，分別含有 PH 10. 5的甘氨酸-氫氧化鈉的緩沖液(50mM)、0. 9g紅串紅球菌濕菌體、40 120mM混旋 1-苯丙醇。在30°C和200rpm下反應5 48小時。紅串紅球菌WZO10選擇性氧化混旋扁桃酸甲酯反應體系在:3mL氧化反應體系中， 分別含有PH 10. 5的甘氨酸-氫氧化鈉的緩沖液(50mM)、0. 9g紅串紅球菌濕菌體、60mM混旋扁桃酸甲酯。在30°C和200rpm下反應48小時。反應后，反應液在6000rpm離心15min，取ImL上清與ImL乙酸乙酯等體積混合， 放入搖床在30°C和200rpm下萃取1 2小時。萃取液在6000rpm離心lOmin，取有機相 400 μ L，加入過量無水Na2SO4干燥，對底物及其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進行手性氣相色譜分析，結(jié)果如表 1。表1 紅串紅球菌WZO10選擇性氧化混旋芳香醇
權利要求
1.紅串紅球菌(Rhodococcuserythropolis)WZ010，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心， 地址中國，武漢，武漢大學，430072，保藏編號CCTCC No =M 2011336，保藏日期2011年9月四日。
2.如權利要求1所述的紅串紅球菌WZOlO在選擇性氧化混旋芳香醇制備R-型芳香醇中的應用。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于所述芳香醇為1-苯乙醇、1-苯丙醇或扁桃酸甲酯。
4.如權利要求2所述的應用，其特征在于所述選擇性氧化在pH8. O 8. 8的Tris-HCl 緩沖液或pH 8. 8 11. O的甘氨酸-氫氧化鈉的緩沖液中進行。
5.如權利要求1所述的紅串紅球菌WZOlO在不對稱還原芳香酮生成S-型芳香醇中的應用。
6.如權利要求5所述的應用，其特征在于所述芳香酮為苯乙酮、苯丙酮、苯甲酰甲酸乙酯或?qū)β缺揭彝?br> 7.如權利要求5所述的應用，其特征在于所述不對稱還原在pH6.O 7. O的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液或pH 7. O 8. 5的Tris-HCl緩沖液中進行。
8.如權利要求5所述的應用，其特征在于所述不對稱還原在葡萄糖、甘油、異丙醇或乙醇存在下進行。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株新菌株——紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)WZ010，及其在選擇性氧化混旋芳香醇制備R-型芳香醇和不對稱還原芳香酮生成S-型芳香醇中的應用。該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學，430072，保藏編號CCTCC NoM 2011336，保藏日期2011年9月29日。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在提供了一株具有高立體選擇性、高酶活性的新菌株，通過該菌株菌體選擇性氧化和不對稱還原可同時得到R-芳香醇和S-芳香醇，該菌株的反應專一性強，催化活性高，大大降低了生產(chǎn)成本，并且對環(huán)境污染小，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12R1/01GK102417889SQ20111036408
公開日2012年4月18日 申請日期2011年11月16日 優(yōu)先權日2011年11月16日
發(fā)明者應向賢, 楊池, 汪釗, 熊斌 申請人:浙江工業(yè)大學