專利名稱：甘蔗細胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶基因及其編碼蛋白序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種甘蔗細胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶(SoCWI)基因及其編碼蛋白序列。
技術(shù)背景
細胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶(Cell Wall Invertase)(以下簡稱CWI)是高等植物體內(nèi)控制蔗糖卸載的關(guān)鍵酶，不可逆的催化蔗糖裂解形成葡萄糖和果糖。通過在源與庫之間形成蔗糖梯度，調(diào)節(jié)蔗糖從韌皮部卸出，并且控制蔗糖吸收速度，主要參與韌皮部蔗糖的卸載和庫器官的建立，在光合產(chǎn)物的運輸上起著重要作用。同時與單糖轉(zhuǎn)運蛋白互作控制細胞分裂和生長，調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和器官建成；作為一個HUpathogenesis-related)蛋白，參與病原防治；與植物抗衰老、花粉粒的發(fā)育有關(guān)。
自1990年Murm首先從胡蘿卜中分離出了 CWI基因，隨后在馬鈴薯、擬南芥、煙草、番茄、葡萄、玉米、水稻等植物中也分離到編碼該酶的全長或部分的核苷酸序列。在水稻穎果發(fā)育過程中，CWI基因表達增強，可以促進胞外蔗糖水解，從而有利于籽粒灌漿。以質(zhì)外體卸載為主的貯藏器官中，庫強主要決定于CWI。玉米MnI編碼胚胎特異表達的CWI同工酶，對玉米天然MnI基因缺失的突變體，其籽粒大小只有正常的1/5，說明CWI活性與庫強大小密切相關(guān)。胡桃CWI在果皮發(fā)育過程中有表達，說明果皮發(fā)育和韌皮部卸載通路相關(guān)。這種機制有利于長距離的吸收運輸，為維持異養(yǎng)生長提供基礎(chǔ)物質(zhì)，并且產(chǎn)生出多種參與原初代謝和防衛(wèi)反應(yīng)的代謝信號。
對水稻灌漿過程研究發(fā)現(xiàn)，在開花后1-4天CWI活性最高，而這一期間內(nèi)穎殼長度的增長也是最快的。原位雜交結(jié)果表明，CWI主要在背脈維管束的薄壁細胞、珠被及其周圍細胞表達，在珠心突起和珠心表皮也有微弱表達。這些結(jié)果表明在穎殼發(fā)育早期，CWI對子代組織的發(fā)育有著十分重要的意義，通過卸載質(zhì)外體的蔗糖為子代組織提供碳源。而在 CffI活性降低的轉(zhuǎn)基因胡蘿卜中，表型的改變發(fā)生在發(fā)育的早期，轉(zhuǎn)化酶可能通過控制糖分的組成和代謝流向而影響早期的發(fā)育。當把CWI反義基因?qū)敕?，大多?shù)植物育性降低。 在研究時發(fā)現(xiàn)當一種花粉囊特有的細胞壁轉(zhuǎn)化酶同工酶被反義抑制時，植物會產(chǎn)生雄性不育現(xiàn)象，說明胞外蔗糖轉(zhuǎn)化酶為庫器官提供碳水化合物。Sherson認為，CWI決定從胞外為細胞提供的是蔗糖還是己糖，胞外己糖的進入可能作為一種信號調(diào)控細胞的分裂和分化。 在煙草的研究中發(fā)現(xiàn)，CWI對于延緩細胞分裂素介導(dǎo)的細胞衰老具有非常重要的作用。同時由于細胞周期的重要調(diào)節(jié)因子細胞周期蛋白D能夠響應(yīng)碳水化合物信號，因此CWI可能除了滿足植物對糖的需要之外，還調(diào)節(jié)細胞周期。
高等植物組織中存在著多種轉(zhuǎn)化酶的同工酶形式。根據(jù)最適PH可以分為兩大類酸性轉(zhuǎn)化酶和中性/堿性轉(zhuǎn)化酶；根據(jù)其在細胞所處的位置可以分為三類細胞壁轉(zhuǎn)化酶、液泡轉(zhuǎn)化酶和細胞質(zhì)轉(zhuǎn)化酶。細胞壁轉(zhuǎn)化酶和液泡轉(zhuǎn)化酶由于最適PH都偏向酸性，因此合在一起歸于酸性轉(zhuǎn)化酶類。所有酸性轉(zhuǎn)化酶都是糖基化的，它們不僅可以催化蔗糖的水解，而且可以催化一些寡聚糖(例如棉子糖和水蘇糖)的水解。糖基水解酶(glycosyl hydrolase familie)分為四個基因家族GH32，GH43，GH62，GH68。本發(fā)明的甘蔗細胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶(SoCWI)基因?qū)儆贕H32家族。甘蔗到目前為止，只克隆出了一個CWI cDNA序列片段(AY302084)，且沒有進一步研究的報道。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為進一步研究甘蔗細胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶(SoCWI)基因的功能及應(yīng)用甘蔗細胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶(SoCWI)基因改良作物品種，提供一種甘蔗細胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶基因及其編碼蛋白序列。
本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下
甘蔗細胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶基因及其編碼蛋白序列，是在對所有植物細胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶基因全長序列進行進化分析的基礎(chǔ)上，比對同一家族的細胞壁結(jié)核轉(zhuǎn)化酶基因cDNA序列，并設(shè)計擴增SoCWI基因核心片段的引物，從甘蔗幼嫩葉片提取總RNA，并經(jīng)反轉(zhuǎn)錄，用常規(guī)PCR法擴增SoCWI基因核心片段，然后在核心片段序列5'端設(shè)計兩個特異引物，在核心片段序列3'端設(shè)計兩個特異引物和兩個錨定引物，通過RACE PCR技術(shù)分別擴增到 SoCWI基因核心區(qū)的5'端和3'端序列；三個序列經(jīng)過拼接，獲得甘蔗細胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶 (SoCffI)基因全長cDNA序列，總長1906bp，經(jīng)VectorNTI軟件分析，該基因的ORF為17!Mbp， 編碼577個氨基酸；起始密碼子(ATG)位于轉(zhuǎn)錄起始位點后62bp處，終止密碼子(TAG)后還有一段11 Ibp的非編碼序列，并帶有真核生物典型的polyA尾巴。
本發(fā)明所獲得的甘蔗細胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶(SoCWI)基因核心區(qū)序列，是用以下核苷酸序列為引物擴增獲得
SoCffIZJFl (5 ‘ -gccgccaatgaactggatcaacga-3 ‘)；
SoCffIZJRl (5' _cggtttcttcatctcccaggcagt_3‘)。
本發(fā)明所獲得的甘蔗細胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶(SoCWI)基因5'端序列，是用以下核苷酸序列為引物，鳥巢式擴增獲得
CffISY Rl (5' -acggagtgtgcccagacgatgt-3‘)；
CffISYOl (5' -tgaagtcccggctccggtacac-3‘)。
本發(fā)明所獲得的甘蔗細胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶(SoCWI)基因3'端的序列，是用以下GZS 核苷酸序列為反轉(zhuǎn)錄引物，用以下CWIXY f 1和CWIXYR1對第一次擴增，CWIXY f2和CWIXYR1對第二次擴增獲得
CffIXY f1 (5 ‘ -gagagcttcggcgcgggaggca-3‘)；
CffIXY f2 (5‘ -tgcatcctgtcacgggtctacc-3‘)；
CffIXYRl (5 ‘ -ggccacgcgtcgactagtac-3‘)；
GZS (5' -ggccacgcgtcgactagtactttttttttttttttttt-3')。
以上所述的甘蔗細胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶(SoCWI)基因，其特征在于它具有序列表中 SEQID NO. 1的DNA序列，且它的編碼區(qū)從第62位核苷酸到1792位核苷酸。
以下是本發(fā)明所獲得的甘蔗細胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶(SoCWI)基因的全長cDNA序列
gaaaaccatccatcgtccaaaaccgtccccctcttcctgctgccgcatcctcagaaacgca atg ggg actcggcagcgggtcctcgcgccatgggcggtgctgctgetcgcgctgcaggtcgccggtgcctcccatgtcatcca ccggagcctggaggccgaggcggcaccgccgtcggtgcctgcctccattgtcagccccctgctcaggacggggtacc atttccagccgccaatgaactggatcaacgaccccaacgctccgatgtactacaagggatggtatcacttgttctac5cagtacaaccccaagggcgcagtatggggcaacatcgtctgggcacactccgtgtcacgcgacctcatcaactggat cgcgctggatcccgccatctacccgagcatcccctccgatcagtacggctgctggtcgggctcggcgacgatgctga aagacggcacgccggcgatcctgtacacggggatcaaccgccccgacatcaactaccaggtgccggtgatcgcgttc ccgaagaacgcgtcggacccgctgctccgggagtgggagaagcccgcggcgtacaacccggtggcgacgccggtggg cggcatcaacgcgacgcagttccgcgacccgacgacggcgtggtacgcggacgggcactggcggatgctcgtgggca gcgtgcgggacacccggggcatggcgctcgtgtaccggagccgggacttcaagacgtggaggaaggccaagcacccg ctgcactcggcgctgacggggatgtgggagtgcccggacttcttcccggtgtccgggccggcgctcgaggacgggct cgacacctccgacgccggcgccaagtacgtgctcaagagcagcctggacctcacacggtatgactactacaccatcg ggtcgtacgacaagaggaaggaccggtactacccggataacccgaacggtgactaccaccggctgcggtacgactac ggcaacttctacgcgtccaagacgttctacgacccggcgaagcggcggcgggtgctgctcgggtgggctaacgagtc ggacagcgtgcccgacgacaaggccaagggctgggccggcatccatgcgatcccaaggaagatctggctcgacccca gcgggaagcagctgctgcagtggcccatcgaggaggttgagaagctcagaggaaagcccgtcagtgtgggcagcaag ctagtcaagcccggcgagcattttgaggtcacaggcgtcgcgacctaccaggctgatgtggaggtgaccttcgagat ctccagcttggagaaggcggaggcgttcgacccggcgtacgacaacgacgcgcagaagctgtgcggcgtcaagggtg cggacgtcaagggtcgggtggggcccttcggcctgtgggtgctggcctctgccgacctgcaggagaagacggccgtc ttcttcagagtcttcaaggacggatacggcaagcccaaggtgctcatgtgcaccgaccccacaaagtcctctcttag tccagatctgtacaagccaaccttcgcgggcttcgtcgacactgacatttcaagcgggaagattgctctt agaagc ttgatcgatcggtccgtggtggagagcttcggcgcgggaggcaagacgtgcatcctgtcacgggtctacccgtccat cgccattggaaaggacgcgcacctctacgttttcaacaacggtgaggtggacgtcaaagtgtcaagcctgaccgcct gggagatgaagaaaccgctcatgaacggcgcc |tag| aagcgtggatgactttattcgtttctcttcaacgattgct RccaRaaatactattRattattaattRttRaRRtccttcaRttttcRcccttcaaaaaaaaaaaaaaaaaa
甘蔗細胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶(SoCWI)基因編碼的蛋白，是具有序列表中SEQID NO. 2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQID NO. 2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個以上氨基酸殘基的取代和/或缺失或添加且具有與SEQID NO. 2的氨基酸殘基序列相同活性的衍生蛋白質(zhì)。
以下是本發(fā)明所獲得的甘蔗細胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶(SoCWI)基因所編碼蛋白的氨基酸序列
MGTRQRVLAPWAVLLLALQVAGASHVIHRSLEAEAAPPSVPASIVSPLLRTGYHFQPPMNWINDPNAPM YYKGffYHLFYQYNPKGAVffGNIVffAHSVSRDLINWIALDPAIYPSIPSDQYGCWSGSATMLKDGTPAILYTGINRPD INYQVPVIAFPKNASDPLLREWEKPAAYNPVATPVGGINATQFRDPTTAWYADGHWRMLVGSVRDTRGMALVYRSRD FKTWRKAKHPLHSALTGMWECPDFFPVSGPALEDGLDTSDAGAKYVLKSSLDLTRYDYYTIGSYDKRKDRYYPDNPN GDYHRLRYDYGNFYASKTFYDPAKRRRVLLGWANESDSVPDDKAKGWAGIHAIPRKIWLDPSGKQLLQffPIEEVEKL RGKPVSVGSKLVKPGEHFEVTGVATYQADVEVTFEISSLEKAEAFDPAYDNDAQKLCGVKGADVKGRVGPFGLWVLA SADLQEKTAVFFRVFKDGYGKPKVLMCTDPTKSSLSPDLYKPTFAGFVDTDISSGKIALRSLIDRSVVESFGAGGKT CILSRVYPSIAIGKDAHLYVFNNGEVDVKVSSLTAWEMKKPLMNGA
本發(fā)明公開了一種甘蔗細胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶(SoCWI)基因序列，不僅為研究甘蔗細胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶的轉(zhuǎn)錄和表達機制，進一步探討蔗糖的積累機理奠定基礎(chǔ)，而且通過氨基酸序列可以獲得具有生物活性的純化蛋白，為研究細胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶的生物學功能及利用該基因進行甘蔗品種改良提供基礎(chǔ)。


圖1 甘蔗細胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶(SoCWI)基因的全長cDNA序列； 圖2 甘蔗細胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶(SoCWI)基因所編碼蛋白的氨基酸序列。
具體實施方式
本發(fā)明的具體實施方式
如下
1、植物 CWI 基因進化分析用 “cell wall intervase”搜索 NCBI 網(wǎng)站(http// www. ncbi. nlm. nih. gov)非冗余氨基酸數(shù)據(jù)庫，獲得所有植物CWI序列。對所獲得的所有序列進行分析，除去重復(fù)的序列。共得到植物CWI序列43條，其中全長序列11條。用ClustalX 對所有全長CWI的氨基酸序列進行比對，并將比對結(jié)果保存為PHYLIP格式；然后用PHYLIP 軟件包的kqboot，Protdist, Neighbor和Consense程序進行進化分析，將植物所有全長 CffI基因分為相應(yīng)的家族。
2、設(shè)計擴增SoCWI基因核心片段的引物設(shè)計擴增SoCWI基因核心片段的引物，比對單子葉植物CWI基因的CDNA序列進行。在保守區(qū)設(shè)計一對用于擴增SoCWI部分片段的引物。
SoCffIZJFl (5 ‘ -gccgccaatgaactggatcaacga-3‘)；
SoCffIZJRl (5' _cggtttcttcatctcccaggcagt_3‘)。
3、甘蔗總RNA的提取
(1)取新鮮甘蔗相應(yīng)組織(如幼嫩葉鞘、葉片等)在液氮中充分研磨成粉末狀。稱取IOOmg研磨后的產(chǎn)物，放入用液氮預(yù)冷過的1. 5ml離心管中，加入Iml Trizol-A+提取液 (天根生化科技有限公司)；
(2)將樣品充分混勻，室溫下放置5min，使得核酸蛋白復(fù)合物完全分離；
(3)控制 4"C，14，OOOg,離心 IOmin ；
(4)吸取上清液于另一個1. 5ml離心管中，加入氯仿體積為上清液體積的1/5，充分振蕩混勻15sec，室溫放置2-aiiin ；
(5)控制 4"C，14，OOOg,離心 15min ；
(6)重復(fù)步驟4，5—次；
(7)吸取上層水相溶液于另一個1. 5ml離心管中，加入等體積預(yù)冷的異丙醇，混勻 lOmin，冰上放置25min ；
(8)控制4°C，14，OOOg，離心IOmin后，在管側(cè)和管底形成白色膠狀沉淀；
(9)去上清液，留沉淀。加入Iml 75%乙醇洗滌沉淀2遍(每次41，2，30(^，離心 3min)。
(10)倒出液體，室溫放置3-5min。加入30-50 μ 1 DEPC處理水，充分溶解后于-70°C保存；
(11)取1 μ 1 RNA樣品用1 %瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，另取1 μ 1 RNA樣品測濃度。
4、RT-PCR (反轉(zhuǎn)錄 PCR)
(1)準備一個0. 2ml的離心管，加入以下成分
甘蔗總RNA 0. 1-5 μ g ；
oligo(dT)18 引物(0. 5μ g/μ 1) 1μ 1 ；
力口人 DEPC-treated water 至Ij總體積12 μ 1 ；
(2)輕微混勻，簡短離心之后，65°C溫育5min，放置冰上冷卻；
(3)按要求加入以下成分
5 X Reaction Buffer 4μ 1 ；
RiboLock RNase Inhibitor(20U/μ 1)1μ 1 ；
IOmM dNTP Mix 2μ 1 ；
ReverAid M-MuLV Reverse Tranxcriptase 1μ 1 ；
總體積 20μ1;
(4)輕微混勻，簡短離心；
(5)42°C溫育 6Omin ；
(6)70°C溫育5min終止反應(yīng)，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> 5、SoCWI基因核心片段克隆
以2μ 1 RT-PCR產(chǎn)物為模板，用SoCWIZJFl和SoCWIZJRl引物進行常規(guī)PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后克隆到T載體并測序。測序結(jié)果表明，PCR產(chǎn)物長度1549bp。
6、SoCWI基因5' -RACE克隆根據(jù)上一步測序獲得的核心區(qū)序列，設(shè)計了 5' -RACE的基因特異引物
CffISY Rl (5' -acggagtgtgcccagacgatgt-3‘)；
CffISYOl (5' -tgaagtcccggctccggtacac-3‘)。
提取甘蔗幼嫩葉總RNA，按照5 ‘ -Full RACE Kit (TAKARA)操作手冊進行 5' -RACE。產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后克隆到T載體并測序。測序結(jié)果表明，5' -RACE產(chǎn)物長度 351bp。
7、SoCffI基因3 ‘ -RACE克隆根據(jù)上一步測序獲得的核心區(qū)序列，設(shè)計了 3' -RACE的兩個基因特異引物和錨定引物。
CffIXY f1 (5 ‘ -gagagcttcggcgcgggaggca-3‘)；
CffIXY f2 (5‘ _tgcatcctgtcacgggtctacc_3‘)；
CffIXYRl (5 ‘ -ggccacgcgtcgactagtac-3‘)；
GZS (5' -ggccacgcgtcgactagtactttttttttttttttttt-3')。
提取甘蔗幼嫩葉總RNA，按照上述RT-PCR方法逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，只是把 oligo (dT) 18引物換成錨定引物GZS0把CffIXY f 1和CffIXYRl的PCR產(chǎn)物稀釋50倍后，作為CWIXY f2和CWIXYR1的模板進行PCR擴增。產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后克隆到T載體并測序。 測序結(jié)果表明，產(chǎn)物長度252bp。
8、甘蔗SoCWI基因全長序列分析將所獲得的三個序列進行拼接，獲得了 SoCWI基因全長cDNA序列，總長1906bp。經(jīng)VectorNTI軟件分析，該序列的ORF為1731 bp,編碼 577個氨基酸。起始密碼子(ATG)位于轉(zhuǎn)錄起始位點后62bp處，終止密碼子(TAA)后還有一段Illbp的非編碼序列，并帶有真核生物典型的polyA尾巴。
甘蔗細胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶(SoCWI)基因序列表，詳見序列表頁。
序列表
<110>廣西大學<120>甘蔗細胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶基因及其編碼蛋白序列
<160>2
<210>1
<211>1906
<212>DNA
<213> 甘胃(Saccharum officinarum)
<220>
<221>CDS
<222>(62). . .(1795)
<220>
<221 >5，UTP
<222>(1)…(61)
<220>
<221>3， UTP
<222>(1796).. . (1906)
<400>1
GAAAACCATC CATCGTCCAA AACCGTCCCC CTCTTCCTGC TGCCGCATCC TCAGAAACGC A61
ATG GGG ACTCGG CAG CGG GTC CTC GCG CCATGG GCG GTG CTG CTG 106
Met Gly ThrArg Gln Arg ValLeu Ala ProTrp Ala Val Leu Leu
5 1015
CTC GCG CTGCAG GTC GCC GGTGCC TCC CATGTC ATC CAC CGG AGC 151
Leu Ala LeuGln Val Ala GlyAla Ser HisVal lie His Arg Ser
20 2530
CTG GAG GCCGAG GCG GCA CCG CCG TCG GTCCCG TCC TCC ATT GTC 196
Leu Glu AlaGlu Ala Ala ProPro Ser ValPro Ala Ser lie Val
35 4045
AGC CCC CTGCTC AGG ACG GGG TAC CAT TTCCAG CCG CCA ATG AAC 241
Ser Pro LeuLeu Arg Thr GlyTyr His PheGln Pro Pro Met Asn
50 5560
TGG ATC AACGAC CCC AAC GCTCCG ATG TACTAC AAG GGA TGG TAT 286
Trp lie AsnAsp Pro Asn Ala Pro Met TyrTyr Lys Gly Trp Tyr
65 7075
CAC TTG TTCTAC CAG TAC AAC CCC AAG GGCGCA GTA TGG GGC AAC 331
His Leu PheTyr Gln Tyr AsnPro Lys GlyAla Val Trp Gly Asn
80 8590
ATC GTC TGGGCA CAC TCC GTG TCA CGC GACCTC ATC AAC TGG ATC 376
lie Val TrpAla His Ser ValSer Arg AspLeu lie Asn Trp lie
95 100105
GCG CTG GATCCC GCC ATC TAC CCG AGC ATCCCC TCC GAT CAG TAC 421
Ala Leu AspPro Ala lie TyrPro Ser liePro Ser Asp Gln Tyr
110 115120
GGC TGC TGGTCG GGC TCG GCG ACG ATG CTGAAA GAC GGC ACG CCG 486
Gly Cys Trp SerGly Ser Ala Thr MetLeu Lys Asp Gly ThrPro
125130135
GCG ATC CTG TACACG GGG ATC AAC CGC CCC GAC ATC AAC TAC CAG 511
Ala lie Leu TyrThr Gly lie Asn Arg Pro Asp lie Asn TyrGln
140145150
GTG CCG GTG ATCGCG TTC CCG AAG AAC GCG TCG GAC CCG CTG CTC 556
Val Pro Val lieAla Phe Pro Lys AsnAla Ser Asp Pro LeuLeu
155160165
CGG GAG TGG GAGAAG CCC GCG GCG TAC AAC CCG GTG GCG ACG CCG 601
Arg Glu Trp GluLys Pro Ala Ala TyrAsn Pro Val Ala ThrPro
170175180
GTG GGC GGC ATCAAC GCG ACG CAG TTC CGC GAC CCG ACG ACG GCG 646
Val Gly Gly lieAsn Ala Thr Gln PheArg Asp Pro Thr ThrAla
185190195
TGG TAC GCG GACGGG CAC TGG CGG ATG CTC GTG GGC AGC GTG CGG 691
Trp Tyr Ala AspGly His Trp Arg MetLeu Val Gly Ser ValArg
200205210
GAC ACC CGG GGCATG GCG CTC GTG TAC CGG AGC CGG GAC TTC AAG 736
Asp Thr Arg GlyMet Ala Leu Val TyrArg Ser Arg Asp PheLys
215220225
ACG TGG AGG AAGGCC AAG CAC CCG CTG CAC TCG GCG CTG ACG GGG 781
Thr Trp Arg LysAla Lys His Pro LeuHis Ser AlA leu ThrGly
230235240
ATG TGG GAG TGCCCG GAC TTC TTC CCG GTG TCC GGG CCG GCG CTC 826
Met Trp Glu CysPro Asp Phe Phe ProVal Ser Gly Pro Ala Leu
245250255
GAG GAC GGG CTCGAC ACC TCC GAC GCC GGC GCC AAG TAC GTG CTC 871
Glu Asp Gly LeuAsp Thr Ser Asp Ala Gly Ala Lys Tyr ValLeu
260265270
AAG AGC AGC CTGGAC CTC ACA CGG TATGAC TAC TAC ACC ATC GGG 916
Lys Ser Ser LeuAsp Leu Thr Arg TyrAsp Tyr Tyr Thr lieGly
275280285
TCG TAC GAC AAGAGG AAG GAC CGG TAC TAC CCG GAT AAC CCG AAC 961
Ser Tyr Asp LysArq Lys Asp Arg TyrTyr Pro Asp Asn ProAsn
290295300
GGT GAC TAC CACCGG CTG CGG TAC GAC TAC GGC AAC TTC TAC GCG 1006
Gly Asp Tyr HisArg Leu Arg Tyr AspTyr Gly Asn Phe TyrAla
305310315
TCC AAG ACG TTCTAC GAC CCG GCG AAG CGG CGG CGG GTG CTG CTC 1051
Ser Lys Thr PheTyr Asp Pro Ala LysArg Arg Arg ValLeuLeu320325330GGG TGG GCT AACGAG TCG GAC AGC GTG CCC GAC GAC AAGGCC AAG 1096Gly Trp Ala AsnGlu Ser Asp Ser ValPro Asp Asp LysAla Lys335340345GGC TGG GCC GGCATC CAT GCG ATC CCA AGG AAG ATC TGGCTC GAC 1141GlyTrp Ala Glylie His Ala lie ProArq Lys lie TrpLeuAsp350355360CCC AGC GGG AAGCAG CTG CTG CAG TGG CCC ATC GAG GAGGTTGAG 1186Pro Ser Gly LysGln Leu Leu Gln TrpPro lie Glu GluValGlu365370375AAG CTC AGA GGAAAG CCC GTC AGT GTG GGC AGC AAG CTAGTC AAG 1231Lys Leu Arg GlyLys Pro Val Ser ValGly Ser Lys LeuValLys380385390CCC GGC GAG CATTTT GAG GTC ACA GGC GTC GCG ACC TACCAG GCT 1276Pro Gly Glu HisPhe Glu Val Thr GlyVal Ala Thr TyrGlnAla395400405GAT GTG GAG GTGACC TTC GAG ATC TCC AGC TTG GAG AAGGCG GAG 1321Asp Val Glu ValThr Phe Glu lie SerSer Leu Glu LysAla Glu410415420GCG TTC GAC CCGGCG TAC GAC AAC GAC GCG CAG AAG CTGTGC GGC 1366Ala Phe Asp ProAla Tyr Asp Asn AspAla Gln Lys LeuCysGly425430435GTC AAG GGT GCGGAC GTC AAG GGT CGG GTG GGG CCC TTCGGC CTG 1411Val Lys Gly AlaAsp Val Lys Gly Arg Val Gly Pro PheGlyLeu440445450TGGGTG CTG GCCTCT GCC GAC CTG CAG GAG AAG ACG GCCGTC TTC 1456Trp Val Leu AlaSer Ala Asp Leu GlnGlu Lys Thr AlaValPhe455460465TTC AGA GTC TTCAAG GAC GGA TAC GGC AAG CCC AAG GTGCTC ATG 1501Phe Arg Val PheLys Asp Gly Tyr GlyLys Pro Lys ValLeuMet470475480TGC ACC GAC CCCACA AAG TCC TCT CTTAGT CCA GAT CTGTAC AAG 1546Cys Thr Asp ProThr Lys Ser Ser LeuSer Pro Asp LeuTyrLys485490495CCA ACC TTC GCGGGC TTC GTC GAC ACTGAC ATT TCA AGCGGG AAG 1591Pro Thr Phe AlaGly Phe Val Asp ThrAsp lie Ser SerGlyIys500505510ATT GCT CTT AGAAGC TTG ATC GAT CGG TCC GTG GTG GAGAGC RRC 16360194]lie AlaLeuArgSerLeulieAspArgSerValValGluSerPhe0195]5155205250196]GGC GCGGGAGGCAAGACGTGCATCCTGTCACGGGTCTACCCGTCC16810197]Gly AlaGlyGlyLysThrCyslieLeuSerArgValTyrProSer0198]5305355400199]ATC GCCATTGGAAAGGACGCGCACCTCTACGTTTTCAACAACGGT17260200]lie AlalieGlyLysAspAlaHisLeuTyrValPheAsnAsnGly0201]5455505550202]GAG GTGGACGTCAAAGTGTCAAGCCTGACCGCCTGGGAGATGAAG17710203]Glu ValAspValLysValSerSerLeuThrAlaTrpGluMetLys0204]5605655700205]AAA CCGCTCATGAACGGCGCC17920206]Lys ProLeuMetAsnGlyAla0207]5755770208]TAGMGCGTG GATGACTTTA TTCGTTTCTCTTCMCGATT GCTGCCAGAM ATACTATTGA 18520209]TTATTMTTG TTGAGGTCCT TCAGTTTTCGCCCTTCAAM AAAAAAAAM AAM19060210]<210>20211]<211>5770212]<212>PRT0213]<213> (Saccharum officinarum)0214]<400>20215]Met GlyThrArgGlnArgValLeuAlaProTrpAlaValLeuLeu0216]510150217]Leu AlaLeuGlnValAlaGlyAlaSerHisVallieHisArgSer0218]2025300219]Leu GluAlaGluAlaAlaProProSerValProAlaSerlieVal0220]3540450221]Ser ProLeuLeuArgThrGlyTyrHisPheGlnProProMetAsn0222]5055600223]Trp lieAsnAspProAsnAlaProMetTyrTyrLysGlyTrpTyr0224]6570750225]His LeuPheTyrGlnTyrAsnProLysGlyAlaValTrpGlyAsn0226]8085900227]lie ValTrpAlaHisSerValSerArgAspLeulieAsnTrplie0228]951001050229]Ala LeuAspProAlalieTyrProSerlieProSerAspGlnTyr0230]1101151200231]Gly CysTrpSerGlySerAlaThrMetLeuLysAspGlyThrPro0232]125130135


Ala Val Arg Val Trp Asp Thr Met Glu Lys Ser Gly Ser Gly Gly Pro Lys Pro Asp Alalie Pro Glu Gly Tyr Thr Trp Trp Asp Ser Tyr Asp Lys Trp Trp Ser Leu Gly Val PheLeu Val Trp Gly Ala Arg Arg Glu Gly Ser Asp Tyr Thr Ala Ala Gly Arg Glu Glu AspTyr lie Glu lie Asp Gly Lys Cys Leu Leu Lys His Phe Asn Gly Lys Gly His Val ProThr 140 Ala 155 Lys 170 Asn 185 Gly 200 Met 215 Ala 230 Pro 245 Asp 260 Asp 275 Arq 290 Arg 305 Tyr 320 Glu 335 lie 350 Gln 365 Lys 380 Phe 395 Thr 410 AlaGly Phe Pro Ala His Ala Lys Asp Thr Leu Lys Leu Asp Ser His Leu Pro Glu Phe Tyrlie Pro Ala Thr Trp Leu His Phe Ser Thr Asp Arg Pro Asp Ala Leu Val Val Glu AspAsn Lys Ala Gln Arg Val Pro Phe Asp Arg Arg Tyr Ala Ser lie Gln Ser Thr lie AsnArg Asn Tyr Phe Met Tyr Leu Pro Ala Tyr Tyr Asp Lys Val Pro Trp Val Gly Ser AspPro 145 Ala 160 Asn 175 Arg 190 Leu 205 Arg 220 His 235 Val 250 Gly 265 Asp 280 Tyr 295 Tyr 310 Arg 325 Pro 340 Arq 355 Pro 370 Gly 385 Val 400 Ser 415 AlaAsp Ser Pro Asp Val Ser Ser Ser Ala Tyr Pro Gly Arg Asp Lys lie Ser Ala Leu Glnlie Asp Val Pro Gly Arg AlA Gly Lys Tyr Asp Asn Arg Asp lie Glu Lys Thr Glu LysAsn Pro Ala Thr Ser Asp leu Pro Tyr Thr Asn Phe Val Lys Trp Glu Leu Tyr Lys LeuTyr Leu Thr Thr Val Phe Thr Ala Val lie Pro Tyr Leu Ala Leu Val Val Gln Ala CysGln 150 Leu 165 Pro 180 Ala 195 Arg 210 Lys 225 Gly 240 Leu 255 Leu 270 Gly 285 Asn 300 Ala 315 Leu 330 Lys 345 Asp 360 Glu 375 Lys 390 Ala 405 Glu 420 GlyVal Trp Phe Cys Pro Ile Gly Ile Glu LysLys Val Arg Thr Thr Ala Ala Ala ValGly Ala Leu Ala Val Phe Asp Pro Phe Ala Arg Gly Gly ValLeu Gly lie AspPro Leu425 Asp 440 Ser 455 Lys 470 Thr 485 Gly 500 Ser 515 Lys 530 Lys 545 Lys 560 Met Asn 575430Val Lys Gly Arg Val 445Ala Asp Leu Gln Glu 460Asp Gly Glr Gly Lys 475Lys Ser Ser Leu Ser 490Phe Val Asp Thr Asp 505Leu lie Asp Arg Ser 520Thr Cys lie Leu Ser 535Asp Ala His Leu Tyr 550Val Ser Ser Leu Thr 565Gly Ala 577Gly Pro Phe Gly Lys Thr Ala Val Pro Lys Val Leu Pro Asp Leu Tyr lie Ser Ser Gly Val Val Glu Ser Arg Val Tyr Pro Val Phe Asn Asn Ala Trp Glu Met435 Leu 450 Phe 465 Met 480 Lys 495 Iys 510 Phe 525 Ser 540 Gly 555 Lys 570
權(quán)利要求
1.甘蔗細胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶基因及其編碼蛋白序列，其特征在于a.甘蔗細胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶(SoCWI)基因，它具有序列表中SEQIDNO. 1的DNA序列，且它的編碼區(qū)從第62位核苷酸到1792位核苷酸；甘蔗kCWI基因的全長cDNA序列g(shù)aaaaccatccatcgtccaaaaccgtccccctcttcctgctgccgcatcctcagaaacgca atg gggactcg gcagcgggtcctcgcgccatgggcggtgctgctgctcgcgctgcaggtcgccggtgcctcccatgtcatccaccgga gcctggaggccgaggcggcaccgccgtcggtgcctgcctccattgtcagccccctgctcaggacggggtaccatttc cagccgccaatgaactggatcaacgaccccaacgctccgatgtactacaagggatggtatcacttgttctaccagta caaccccaagggcgcagtatggggcaacatcgtctgggcacactccgtgtcacgcgacctcatcaactggatcgcgc tggatcccgccatctacccgagcatcccctccgatcagtacggctgctggtcgggctcggcgacgatgctgaaagac ggcacgccggcgatcctgtacacggggatcaaccgccccgacatcaactaccaggtgccggtgatcgcgttcccgaa gaacgcgtcggacccgctgetccgggagtgggagaagcccgcggcgtacaacccggtggcgacgccggtgggcggca tcaacgcgacgcagttccgcgacccgacgacggcgtggtacgcggacgggcactggcggatgctcgtgggcagcgtg cgggacacccggggcatggcgctcgtgtaccggagccgggacttcaagacgtggaggaaggccaagcacccgctgca ctcggcgctgacggggatgtgggagtgcccggacttcttcccggtgtccgggccggcgctcgaggacgggctcgaca cctccgacgccggcgccaagtacgtgctcaagagcagcctggacctcacacggtatgactactacaccatcgggtcg tacgacaagaggaaggaccggtactacccggataacccgaacggtgactaccaccggctgcggtacgactacggcaa cttctacgcgtccaagacgttctacgacccggcgaagcggcggcgggtgctgctcgggtgggctaacgagtcggaca gcgtgcccgacgacaaggccaagggctgggccggcatccatgcgatcccaaggaagatctggctcgaccccagcggg aagcagctgctgcagtggcccatcgaggaggttgagaagctcagaggaaagcccgtcagtgtgggcagcaagctagt caagcccggcgagcattttgaggtcacaggcgtcgcgacctaccaggctgatgtggaggtgaccttcgagatctcca gcttggagaaggcggaggcgttcgacccggcgtacgacaacgacgcgcagaagctgtgcggcgtcaagggtgcggac gtcaagggtcgggtggggcccttcggcctgtgggtgctggcctctgccgacctgcaggagaagacggccgtcttctt cagagtcttcaaggacggatacggcaagcccaaggtgctcatgtgcaccgaccccacaaagtcctctcttagtccag atctgtacaagccaaccttcgcgggcttcgtcgacactgacatttcaagcgggaagattgctcttagaagcttgatc gatcggtccgtggtggagagcttcggcgcgggaggcaagacgtgcatcctgtcacgggtctacccgtccatcgccat tggaaaggacgcgcacctctacgttttcaacaacggtgaggtggacgtcaaagtgtcaagcctgaccgcctgggaga tgaagaaaccgctcatgaacggcgcc[ta^aagcgtggatgactttattcgtttctcttcaacgattgctgccagaaa tactattgattattaattgttgaggtccttcagttttcgcccttcaaaaaaaaaaaaaaaaaa ；b.SoCffI編碼的蛋白，是具有序列表中SEQID NO. 2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQID NO. 2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個以上氨基酸殘基的取代和/或缺失或添加且具有與SEQID NO. 2的氨基酸殘基序列相同活性的衍生蛋白質(zhì)；甘蔗SoCWI基因所編碼蛋白的氨基酸序列MGTRQRVLAPffAVLLLALQVAGASHVIHRSLEAEAAPPSVPASIVSPLLRTGYHFQPPMNWINDPNAPMYYK GffYHLFYQYNPKGAVffGNIVffAHSVSRDLINWIALDPAIYPSIPSDQYGCWSGSATMLKDGTPAILYTGINRPDINY QVPVIAFPKNASDPLLREWEKPAAYNPVATPVGGINATQFRDPTTAWYADGHWRMLVGSVRDTRGMALVYRSRDFKT WRKAKHPLHSALTGMWECPDFFPVSGPALEDGLDTSDAGAKYVLKSSLDLTRYDYYTIGSYDKRKDRYYPDNPNGDY HRLRYDYGNFYASKTFYDPAKRRRVLLGWANESDSVPDDKAKGWAGIHAIPRKIWLDPSGKQLLQffPIEEVEKLRGKPVSVGSKLVKPGEHFEVTGVATYQADVEVTFEISSLEKAEAFDPAYDNDAQKLCGVKGADVKGRVGPFGLWVLASAD LQEKTAVFFRVFKDGYGKPKVLMCTDPTKSSLSPDLYKPTFAGFVDTDISSGKIALRSLIDRSVVESFGAGGKTCIL SRVYPSIAIGKDAHLYVFNNGFVDVKVSSLTAWEMKKPLMNGA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘蔗細胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶基因及其編碼蛋白序列，其特征在于所述的甘蔗SoCWI基因的全長cDNA序列，是用以下核苷酸序列為引物擴增獲得a.用于擴增甘蔗細胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶(SoCWI)基因核心區(qū)引物對 SoCWIZJFl (5 ‘ -gccgccaatgaactggatcaacga-3‘)； SoCWIZJRl (5 ‘ -cggtttcttcatctcccaggcagt-3‘)；b.用于擴增甘蔗細胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶(SoCWI)基因5'端的引物對 CWISY Rl (5 ‘ -acggagtgtgcccagacgatgt-3‘)；CWISYOl (5 ‘ -tgaagtcccggctccggtacac-3‘)；C.用于擴增甘蔗細胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶(SoCWI)基因3'端的引物用于RNA反轉(zhuǎn)錄的引物GZS (5‘ -ggccacgcgtcgactagtactttttttttttttttttt-3 ‘)； 用于第一次擴增的引物對CWIXY f 1 :(5, -gagagcttcggcgcgggaggca-3‘)； CWIXYRl (5 ‘ -ggccacgcgtcgactagtac-3‘)； 用于第二次擴增的引物對CWIXY f2:(5' -tgcatcctgtcacgggtctacc-3‘)； CWIXYRl (5 ‘ -ggccacgcgtcgactagtac-3‘)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種甘蔗細胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶基因及其編碼蛋白序列，在對所有植物細胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶基因全長序列進行進化分析的基礎(chǔ)上，以同一家族的細胞壁結(jié)核轉(zhuǎn)化酶基因序列的保守區(qū)設(shè)計引物，從甘蔗幼嫩葉片提取總RNA，并經(jīng)反轉(zhuǎn)錄，用常規(guī)PCR法擴增，結(jié)合RACE技術(shù)克隆到甘蔗細胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶(SoCWI)基因的全長cDNA序列，不僅為研究甘蔗細胞壁結(jié)合轉(zhuǎn)化酶的轉(zhuǎn)錄和表達機制，進一步探討蔗糖的積累機理奠定基礎(chǔ)，而且通過氨基酸序列可以獲得具有生物活性的純化蛋白，解決了糖基水解酶(glycosyl hydrolase familie)四個基因家族GH32，GH43，GH62，GH68中甘蔗CWI基因的GH32家族目前只克隆出了一個CWI cDNA序列片段(AY302084)沒有解決的技術(shù)難點，為研究細胞壁結(jié)核轉(zhuǎn)化酶的生物學功能提供基礎(chǔ)。
文檔編號C12N9/24GK102533817SQ20111036466
公開日2012年7月4日 申請日期2011年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月17日 公開號201110364661.9
發(fā)明者劉銘, 李楊瑞, 楊麗濤, ?？∑? 王愛勤 申請人:廣西大學