專利名稱：一種薊柄銹菌的離體保存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種薊柄銹菌的離體保存方法。
背景技術(shù)：
銹菌，菌絲有隔膜，初生菌絲單核，隨后雙核化，生長在寄主的細(xì)胞間隙，以吸器侵入細(xì)胞。吸器一般圍繞著細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)緊密地結(jié)合在一起。銹菌的細(xì)胞質(zhì)中含有核微粒、 線粒體、肉質(zhì)網(wǎng)、糖元顆粒和類脂體。菌絲隔膜的結(jié)構(gòu)與高等擔(dān)子菌不同，而與子囊菌近似， 向心生長，上下各有1層電子密集層，中間為1層電子稀薄層，從四周向中心逐漸變薄。中央有被填充物填塞的孔，上下無蓋狀結(jié)構(gòu)。銹菌不生子實體，只生孢子器和孢子。最典型的銹菌有5類孢子，即性孢子、銹孢子、夏孢子、冬孢子和擔(dān)孢子，其中夏孢子在生長季節(jié)中可連續(xù)產(chǎn)生多次，是多數(shù)植物銹病的主要孢子形態(tài)，在植物銹病的發(fā)生中起主導(dǎo)作用。銹菌易引發(fā)植物發(fā)生銹病，銹菌在自然條件下只能在活的寄主植物體上生長，寄主植物被銹病菌侵染后，在葉片、葉鞘或莖等植物器官組織上長出鐵銹狀的孢子堆。銹病是流行性很強(qiáng)的植物病害。2006年我們在山東青島地區(qū)發(fā)現(xiàn)了染銹菌的雜草小薊植株，患病植株輕者矮化， 或不能正常開花結(jié)籽，重者死亡。病葉背面長滿了銹色的孢子粉。申請人對小薊植株的銹菌進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)其屬于擔(dān)子菌亞門，冬孢菌綱，銹菌目，柄銹菌科，柄銹菌屬，薊柄銹菌 (Puccinia obtegens )。夏孢子近圓形，黃褐色至褐色，直徑為沈-27. 5 μ m，有微細(xì)小刺。冬孢子短橢圓形，雙細(xì)胞大小為32-39 X 21-27 μ m，褐色有微細(xì)小疣，橫隔處不縊所，柄很短， 無色透明。申請人對該銹菌進(jìn)行了詳細(xì)地研究，以期為雜草小薊的生物防治開辟新的資源。 并且，以此銹菌作為雜草小薊生物防治的新菌源。長期以來，雜草防除問題對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。McWhorter等和Parker 等統(tǒng)計結(jié)果表明，由雜草造成的全球農(nóng)作物平均產(chǎn)量損失大約為12%。20世紀(jì)50年代除草劑的銷量只占整個農(nóng)業(yè)化學(xué)劑總銷量的20%，而20世紀(jì)80年代上升為50%，此后上升為 60%。化學(xué)除草劑的大量應(yīng)用，已明顯暴露出諸多弊端，首先是除草劑霧滴飄移，藥液揮發(fā)， 選擇性不理想，降解產(chǎn)物危害作物，甚至造成作物藥害；其次是反復(fù)使用除草劑造成耐藥雜草種群的上升、抗除草劑雜草的出現(xiàn)和對環(huán)境污染的加重。由此可見，尋求更為安全有效的除草劑已成為除草劑產(chǎn)業(yè)今后的發(fā)展方向。生物除草劑有利于環(huán)境保護(hù)，并對雜草防除有效。尤其是植物病原物除草劑越來越突現(xiàn)出優(yōu)點，在一定程度上激發(fā)人們對其產(chǎn)生濃厚的興趣。小薊又稱刺兒菜[C印halanoplos segetum (Bunge) Kitam.]，是我國農(nóng)田(包括煙田) 的主要雜草之一，發(fā)生十分廣泛。小薊與其它農(nóng)田雜草一樣與作物競爭水、肥和空間，直接影響作物的產(chǎn)量和質(zhì)量。目前農(nóng)田雜草的防除主要依靠人工除草和化學(xué)除草劑防除，大量化學(xué)農(nóng)藥的使用也是無公害煙葉生產(chǎn)的主要障礙。為此，針對小薊病原銹菌進(jìn)行研究，以期為小薊等雜草的生物防治開辟新的途徑。通常銹菌只能在活體植株上保存，即，銹菌不能在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)。因此，迫切需要研制一種保存簡單，操作方便，夏孢子萌發(fā)率高，并能夠達(dá)到研制生防制劑目的離體保存方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點，發(fā)明一種新的保存簡單，操作方便，夏孢子萌發(fā)率高，并能夠達(dá)到研制生防制劑目的薊柄銹菌離體保存方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種薊柄銹菌離體保存方法，其中，按照下述步驟操作a、制備夏孢子粉，b、取一種固體顆粒，并在其表面噴灑一層羧甲基纖維素鈉水溶液，然后滾上一層夏孢子粉，c、A粉包衣10 15層，形成以固體顆粒為核心的顆粒，d、B粉包衣次外層，e、滑石粉包衣最外層，f、晾干并貯藏。步驟a為從田間人工采集感染了薊柄銹菌的小薊植株，然后在室內(nèi)進(jìn)行單孢純化，人工接種小薊，使小薊感染薊柄銹菌。然后用手術(shù)刀從發(fā)病的小薊葉片上刮取成熟的夏孢子，將刮取的夏孢子與其3 5倍重量分?jǐn)?shù)的A粉混合制成夏孢子粉。步驟b為用天平稱取與夏孢子粉等重量的固體顆粒，然后在顆粒表面噴灑質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為羧甲基纖維素鈉水溶液，充分?jǐn)嚢枋刽燃谆w維素鈉水溶液均勻地分布在顆粒表面；將顆粒與夏孢子粉混合，并滾動顆粒，直至所有的夏孢子粉全部均勻滾粘在顆粒的表面。步驟c為再次在顆粒表面噴灑質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為羧甲基纖維素鈉水溶液，噴后在顆粒表面再滾粘上A粉1層；上述操作重復(fù)10 15次，直至粘有A粉的顆粒，能夠通過8目 10目的篩孔為準(zhǔn)，粘有A粉的顆粒要求大小均勻。步驟d為在步驟c所得的顆粒的表面噴灑質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為羧甲基纖維素鈉水溶液，再均勻滾粘上B粉1層。步驟e為在步驟d所得的顆粒的表面噴灑質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為羧甲基纖維素鈉水溶液，再均勻的滾粘上滑石粉，使顆粒表面形成了滑石粉層。步驟f為過篩，選取通過了 8目 10目的顆粒，并在室內(nèi)室溫下晾干20 觀小時；將晾干的顆粒裝入離心管中并封閉離心管，于4°C和-20°C冰箱保存。所述A粉的成分為金葉牌煙草包衣劑型號A，其由六和農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所生產(chǎn)。所述B粉的成分為金葉牌煙草包衣劑型號B，其由六和農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所生產(chǎn)。薊柄銹菌夏孢子經(jīng)本發(fā)明保存方法保存120天時，其萌發(fā)率高于80%。所述固體顆粒的大小為40 50目，所述固體顆粒為滅活的煙草種子、油菜種子、 大白菜種子或硅膠顆粒中的任一種。步驟c中重復(fù)操作10 15次的具體操作為“在固體顆粒表面噴灑質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為羧甲基纖維素鈉水溶液，噴后在固體顆粒表面再滾粘上A粉1層。
本發(fā)明的優(yōu)點在于，方法簡單，操作方便，易于保存，保存效果好，夏孢子萌發(fā)率高，能夠達(dá)到研制生防制劑目的的離體保存。具體為通常植物病原銹菌只能在活體植株上保存，S卩，銹菌不能在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)，而本發(fā)明采用離體保存方式，創(chuàng)新了保存方法，又能保證經(jīng)此保存的銹菌具有高萌發(fā)率。利用煙草包衣劑的A粉和B粉對夏孢子進(jìn)行包衣，A粉包衣夏孢子10 15層，B 粉包衣次外層，滑石粉包衣最外層，這種保存方法簡單，不僅使銹菌變得易于保存，而且保存效果好。本發(fā)明的保存方法，可以有力的支撐薊柄銹菌的研究，以期為小薊等雜草的生物防治開辟新的途徑。


圖1為本發(fā)明保存方法的示意流程圖。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖，對發(fā)明進(jìn)行說明。如圖1所示，圖1為本發(fā)明保存方法的示意流程圖。本發(fā)明提供了一種薊柄銹菌的離體保存方法，其中，按照下述步驟操作a、制備夏孢子粉，b、取一種固體顆粒，并在其表面噴灑一層羧甲基纖維素鈉水溶液，然后滾上一層夏孢子粉，c、A粉包衣10 15層，形成以固體顆粒為核心的顆粒，d、B粉包衣次外層，e、滑石粉包衣最外層，f、晾干并貯藏。步驟a為從田間人工采集感染了薊柄銹菌的小薊植株，然后在室內(nèi)進(jìn)行單孢純化，人工接種小薊，使小薊感染薊柄銹菌。然后用手術(shù)刀從發(fā)病的小薊葉片上刮取成熟的夏孢子，將刮取的夏孢子與其3 5倍重量分?jǐn)?shù)的A粉混合制成夏孢子粉。步驟b為用天平稱取與夏孢子粉等重量的固體顆粒，然后在顆粒表面噴灑質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為羧甲基纖維素鈉水溶液，充分?jǐn)嚢枋刽燃谆w維素鈉水溶液均勻地分布在顆粒表面；將顆粒與夏孢子粉混合，并滾動顆粒，直至所有的夏孢子粉全部均勻滾粘在顆粒的表面。步驟c為再次在顆粒表面噴灑質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為羧甲基纖維素鈉水溶液，噴后在顆粒表面再滾粘上A粉1層；；上述操作重復(fù)10 15次，直至粘有A粉的顆粒，能夠通過 8目 10目的篩孔為準(zhǔn)，粘有A粉的顆粒要求大小均勻。步驟d為在步驟c所得的顆粒的表面噴灑質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為羧甲基纖維素鈉水溶液，再均勻滾粘上B粉1層。步驟e為在步驟d所得的顆粒的表面噴灑質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為羧甲基纖維素鈉水溶液，再均勻的滾粘上滑石粉，使顆粒表面形成了滑石粉層。
5
步驟f為過篩，選取通過了 8目 10目的顆粒，并在室內(nèi)室溫下晾干20 觀小時；將晾干的顆粒裝入離心管中并封閉離心管，于4°C和-20°C冰箱保存。A粉的成分為金葉牌煙草包衣劑型號A，其由六和農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所生產(chǎn)。B粉的成分為金葉牌煙草包衣劑型號B，其由六和農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所生產(chǎn)。薊柄銹菌夏孢子經(jīng)本發(fā)明保存方法保存120天時， 其萌發(fā)率達(dá)80%以上。固體顆粒的大小為40 50目，所述固體顆粒為滅活的煙草種子、油菜種子、大白菜種子或硅膠顆粒中的任一種。例 1首先從田間人工采集感染薊柄銹菌的小薊植株，然后在室內(nèi)進(jìn)行單孢純化，人工接種小薊，使小薊感染薊柄銹菌。然后用手術(shù)刀從發(fā)病的小薊葉片上刮取夏孢子，將刮取的夏孢子與其3 5倍體積的A粉混合制成夏孢子粉；然后稱取夏孢子粉等重量的、滅活的煙草種子，煙草種子大小選用40 45目，并在煙草種子表面噴灑羧甲基纖維素鈉水溶液；然后在煙草種子表面滾上夏孢子粉；再在煙草種子表面噴灑羧甲基纖維素鈉水溶液，滾上A粉；重復(fù)噴灑1 %羧甲基纖維素鈉水溶液，并滾上A粉10 15次，直至顆粒直徑能通過8目 10目的篩孔；噴灑羧甲基纖維素鈉水溶液，再滾上B粉1層；噴灑羧甲基纖維素鈉水溶液，滾上滑石粉1層；過篩，并在室內(nèi)晾干20 ^h ；將顆粒封閉在離心管中，于4°C和-20°C條件下保存。保存120天時夏孢子萌發(fā)率高于80%。(萌發(fā)結(jié)果如下表)保存的夏孢子萌發(fā)結(jié)果
保存時間萌發(fā)率(%) VC-20Γ48h86. 9698. 297d80. 0086. 5014d26. 1962. 5021d72. 5037. 5035d64. 7085. 4265d53. 7564. 1795d80. 0086. 50120d81. 0083. 20127d67. 0079. 83例 2a、制備夏孢子粉，b、取油菜種子，并在其表面噴灑一層羧甲基纖維素鈉水溶液，然后滾上一層夏孢子粉，c、A粉包衣10 15層，形成以油菜種子為核心的顆粒，d、B粉包衣次外層，
e、滑石粉包衣最外層，f、晾干并貯藏。步驟a為從田間人工采集感染了薊柄銹菌的小薊植株，然后在室內(nèi)進(jìn)行單孢純化，人工接種小薊，使小薊感染薊柄銹菌。然后用手術(shù)刀從發(fā)病的小薊葉片上刮取成熟的夏孢子，將刮取的夏孢子與其3 5倍重量分?jǐn)?shù)的A粉混合制成夏孢子粉。步驟b為用天平稱取與夏孢子粉等重量的固體顆粒，固體顆粒為滅火的油菜種子，大小為48 50目，然后在油菜種子表面噴灑質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為1 %羧甲基纖維素鈉水溶液， 充分?jǐn)嚢枋刽燃谆w維素鈉水溶液均勻地分布在油菜種子表面；將粘有羧甲基纖維素鈉水溶液的油菜種子與夏孢子粉混合，并滾動油菜種子，直至所有的夏孢子粉全部均勻滾粘在油菜種子的表面。步驟c為再次在油菜種子表面噴灑質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為羧甲基纖維素鈉水溶液，噴后在油菜種子表面再滾粘上A粉1層；上述操作重復(fù)10 15次，直至粘有A粉的油菜種子形成的顆粒能夠通過8目 10目的篩孔為準(zhǔn)，粘有A粉的顆粒要求大小均勻。步驟d為在步驟c所得的顆粒的表面噴灑質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為羧甲基纖維素鈉水溶液，再均勻滾粘上B粉1層。步驟e為在步驟d所得的顆粒的表面噴灑質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為羧甲基纖維素鈉水溶液，再均勻的滾粘上滑石粉，使顆粒表面形成了滑石粉層。步驟f為過篩，選取通過了 8目 10目的顆粒，并在室內(nèi)室溫下晾干20 觀小時；將晾干的顆粒裝入離心管中并封閉離心管，于4°C和-20°C冰箱保存。A粉的成分為金葉牌煙草包衣劑型號A，其由六和農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所生產(chǎn)。B粉的成分為金葉牌煙草包衣劑型號B，其由六和農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所生產(chǎn)。薊柄銹菌夏孢子經(jīng)本發(fā)明保存方法保存120天時， 其萌發(fā)率高于80%。(萌發(fā)結(jié)果如下表)保存的夏孢子萌發(fā)結(jié)果
保存時間萌發(fā)率(%) 4 0C-2 O0C48h95. 5389. 277d48.4854. 1714d77. 8362. 5021d45. 0077. 5035d58. 0085. 4265d85. 7185. 7195d80. 0082. 50120d81. 9080. 60127d68. 0276. 90
例 3a、制備夏孢子粉，b、取大白菜種子，并在其表面噴灑一層羧甲基纖維素鈉水溶液，然后滾上一層夏孢子粉，c、A粉包衣10 15層，形成以大白菜種子為核心的顆粒，d、B粉包衣次外層，e、滑石粉包衣最外層，f、晾干并貯藏。步驟a為從田間人工采集感染了薊柄銹菌的小薊植株，然后在室內(nèi)進(jìn)行單孢純化，人工接種小薊，使小薊感染薊柄銹菌。然后用手術(shù)刀從發(fā)病的小薊葉片上刮取成熟的夏孢子，將刮取的夏孢子與其3 5倍重量分?jǐn)?shù)的A粉混合制成夏孢子粉。步驟b為用天平稱取與夏孢子粉等重量的固體顆粒，固體顆粒為滅活的大白菜種子，大小為48 50目，然后在大白菜種子表面噴灑質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為羧甲基纖維素鈉水溶液，充分?jǐn)嚢枋刽燃谆w維素鈉水溶液均勻地分布在大白菜種子表面；將粘有羧甲基纖維素鈉水溶液的大白菜種子與夏孢子粉混合，并滾動大白菜種子，直至所有的夏孢子粉全部均勻滾粘在大白菜種子的表面。步驟c為再次在大白菜種子表面噴灑質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為羧甲基纖維素鈉水溶液， 噴后在顆粒表面再滾粘上A粉1層；上述操作重復(fù)10 15次，直至粘有A粉的大白菜種子形成的顆粒，能夠通過8目 10目的篩孔為準(zhǔn)，粘有A粉的顆粒要求大小均勻。步驟d為在步驟c所得顆粒的表面噴灑質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為羧甲基纖維素鈉水溶液，再均勻滾粘上B粉1層。步驟e為在步驟d所得的顆粒的表面噴灑質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為羧甲基纖維素鈉水溶液，再均勻的滾粘上滑石粉，使顆粒表面形成了滑石粉層。步驟f為過篩，選取通過了 8目 10目的顆粒，并在室內(nèi)室溫下晾干20 觀小時；將晾干的顆粒裝入離心管中并封閉離心管，于4°C和-20°C冰箱保存。A粉的成分為金葉牌煙草包衣劑型號A，其由六和農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所生產(chǎn)。B粉的成分為金葉牌煙草包衣劑型號B，其由六和農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所生產(chǎn)。薊柄銹菌夏孢子經(jīng)本發(fā)明保存方法保存120天時， 其萌發(fā)率高于80%。(萌發(fā)結(jié)果如下表)保存的夏孢子萌發(fā)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種薊柄銹菌的離體保存方法，其特征在于，按照下述步驟操作a、制備夏孢子粉，b、取一種固體顆粒，并在其表面噴灑一層羧甲基纖維素鈉水溶液，然后滾上一層夏孢子粉c、A粉包衣10 15層，形成以固體顆粒為核心的顆粒，d、B粉包衣次外層，e、滑石粉包衣最外層，f、晾干并貯藏。步驟a為從田間人工采集感染了薊柄銹菌的小薊植株，然后在室內(nèi)進(jìn)行單孢純化，人工接種小薊，使小薊感染薊柄銹菌。然后用手術(shù)刀從發(fā)病的小薊葉片上刮取成熟的夏孢子， 將刮取的夏孢子與其3 5倍重量分?jǐn)?shù)的A粉混合制成夏孢子粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述薊柄銹菌的保存方法，其特征在于，步驟b為用天平稱取與夏孢子粉等重量的固體顆粒，然后在顆粒表面噴灑質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為羧甲基纖維素鈉水溶液，充分?jǐn)嚢枋刽燃谆w維素鈉水溶液均勻地分布在顆粒表面；將顆粒與夏孢子粉混合，并滾動顆粒，直至所有的夏孢子粉全部均勻滾粘在顆粒的表面。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述薊柄銹菌的保存方法，其特征在于，步驟c為再次在顆粒表面噴灑質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為羧甲基纖維素鈉水溶液，噴后在顆粒表面再滾粘上A粉1層；上述操作重復(fù)10 15次，直至粘有A粉的顆粒，能夠通過8目 10目的篩孔為準(zhǔn)，粘有A粉的顆粒要求大小均勻。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述薊柄銹菌的保存方法，其特征在于，步驟d為在步驟c所得顆粒表面噴灑質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為1 %羧甲基纖維素鈉水溶液，再均勻滾粘上B 粉1層。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述薊柄銹菌的保存方法，其特征在于，步驟e為在步驟d所得顆粒表面噴灑質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為羧甲基纖維素鈉水溶液，再均勻的滾粘上滑石粉，使顆粒表面形成滑石粉層。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述薊柄銹菌的保存方法，其特征在于，步驟f為過篩，選取通過了 8目 10目的顆粒，并在室內(nèi)室溫下晾干20 觀小時；將晾干的顆粒裝入離心管中并封閉離心管，于4°C和-20°C冰箱保存。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述薊柄銹菌的保存方法，其特征在于，所述A粉的成分為金葉牌煙草包衣劑型號A，其由六和農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所生產(chǎn)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述薊柄銹菌的保存方法，其特征在于，所述B粉的成分為金葉牌煙草包衣劑型號B，其由六和農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所生產(chǎn)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述薊柄銹菌的保存方法，其特征在于，薊柄銹菌夏孢子經(jīng)本發(fā)明保存方法保存120天時，其萌發(fā)率高于80%。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述薊柄銹菌的保存方法，其特征在于，所述固體顆粒的大小為 40 50目，所述固體顆粒為滅活的煙草種子、油菜種子、大白菜種子或硅膠顆粒中的任一種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種薊柄銹菌的離體保存方法，其特征在于，按照下述步驟操作a、制備夏孢子粉，b、取一種固體顆粒，并在其表面噴灑一層1％羧甲基纖維素鈉水溶液，然后滾上一層夏孢子粉，c、A粉包衣10～15層，形成以固體顆粒為核心的顆粒，d、B粉包衣次外層，e、滑石粉包衣最外層，f、晾干并貯藏。A粉的成分為金葉牌煙草包衣劑型號A，其由六和農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所生產(chǎn)。B粉的成分為金葉牌煙草包衣劑型號B，其由六和農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所生產(chǎn)。本發(fā)明方法簡單，操作方便，易于保存，并且在離體保存條件下，夏孢子萌發(fā)率高，保存效果好，能夠達(dá)到研制生防制劑的目的。
文檔編號C12R1/645GK102391952SQ201110369158
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月11日
發(fā)明者劉少云, 張峻銓, 徐宜民, 時焦 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所