專利名稱：一種高效制備天然脫落酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)制備天然脫落酸(Abscisic Acid, ABA)的新方法。
背景技術(shù)：
脫落酸(ABA)是目前世界上已發(fā)現(xiàn)的五大植物激素之一。天然型的脫落酸由于對農(nóng)作物的生長發(fā)育具有很強(qiáng)的調(diào)節(jié)活性，能促進(jìn)果實類、谷類、豆類的成熟發(fā)育，能大幅度提高其產(chǎn)量和質(zhì)量，又能大大增強(qiáng)其耐寒、抗旱和抗鹽堿能力，因而具有廣闊的應(yīng)用前景。 目前，脫落酸在基礎(chǔ)領(lǐng)域的研究已深入到植物細(xì)胞與基因工程水平。然而，由于存在于植物體內(nèi)的天然脫落酸的光學(xué)構(gòu)型僅為(s)-(+)-脫落酸，單純的(s)-(+)-脫落酸的生產(chǎn)成本極高，售價昂貴，而人工合成的脫落酸是外消旋體，活性遠(yuǎn)小于天然型的脫落酸。因此，脫落酸應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)幾乎是空談。為了解決和滿足脫落酸應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需要，近二十年來，國內(nèi)外(中國、日本等)一直在研究利用微生物發(fā)酵法來生產(chǎn)天然脫落酸。例如，已知可用真菌灰葡萄孢 (Botrytis cinerea)來生產(chǎn)天然脫落酸，并公開了例如采用纖維素泡沫作載體的液體發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)量有所提高，最高的產(chǎn)量達(dá)300毫克/升發(fā)酵量(參見，例如JP-A-6-247927、 JP-A-6-197775、 JP-A-6-133786、 JP-A-6-7180、 JP-A-2-10988、 JP-A-2-60590、 JP-A-63-296696, JP-A-58-51895)；另外，CN1182798A公開了一種通過真菌發(fā)酵生產(chǎn)天然脫落酸的方法，該方法采用三級發(fā)酵，在第三級發(fā)酵中采用連續(xù)流加補(bǔ)料出料以及菌種固定化，并添加關(guān)鍵底物，使產(chǎn)酸量穩(wěn)定，脫落酸的最高產(chǎn)量達(dá)到1. 2克/升發(fā)酵液。專利 ZL00132024. 6公開了制備天然脫落酸的方法，該方法是通過采用真菌批次液體培養(yǎng)基流加補(bǔ)料工藝來制備天然脫落酸的方法。專利2007100(^609. 2公開了一種新的制備天然脫落酸方法，該方法通過在發(fā)酵過程中流加肌醇解除葡萄糖阻遏的工藝來提高脫落酸的產(chǎn)量。但現(xiàn)有技術(shù)菌種的底物轉(zhuǎn)化率低，合成脫落酸的前體物質(zhì)供應(yīng)速率低，脫落酸產(chǎn)量受到局限；且發(fā)酵工藝(固體發(fā)酵、液體批次發(fā)酵和連續(xù)流加補(bǔ)料出料工藝、批次液體培養(yǎng)基流加補(bǔ)料工藝等)由于油脂類副產(chǎn)物較多，造成發(fā)酵液溶氧不均，導(dǎo)致溶氧利用率較低，能耗較大，成本居高不下。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)中已知的用微生物發(fā)酵生產(chǎn)天然脫落酸工藝中所存在的菌種發(fā)酵產(chǎn)量較低，能耗較大，生產(chǎn)成本高等的不足，本發(fā)明者進(jìn)行了深入的研究，尋找更為有效的提高脫落酸產(chǎn)量的方法，以及生產(chǎn)成本更低的改進(jìn)工藝。研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖等碳源氧化后會生成乙酰輔酶A (Acetyl Coenzyme Α)進(jìn)入三羧酸循環(huán)，同時，乙酰輔酶A也是真菌生物合成脫落酸的甲羥戊酸(Mevalonic acid, MVA)途徑的重要前體，因此，一定程度增加發(fā)酵體系中乙酰輔酶A的濃度，有利于脫落酸的合成。吐溫-20(聚氧乙烯失水山梨醇單月桂酸酯，Tween-20)，分子式與分子量
3C58H114(^6，1227. 5，非離子表面活性劑，對發(fā)酵液中某些成份尤其油脂成份，具有乳化、擴(kuò)散、增溶、穩(wěn)定等作用，能較好改善發(fā)酵液溶氧狀況，提高菌體對溶氧的利用率，從而提高脫落酸產(chǎn)量，降低能耗和成本。本發(fā)明人還利用微生物分子遺傳學(xué)技術(shù)，如基因組改組(重排)技術(shù)、基因定向誘變技術(shù)等，對天然脫落酸產(chǎn)生菌株灰葡萄孢霉菌(Botrytis cinerea) TB_3_A3 (譚紅等，利用原生質(zhì)體誘變技術(shù)篩選脫落酸高產(chǎn)菌株，應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報1998,4(3) =281-285)進(jìn)行遺傳改良，經(jīng)過大量的菌種選育工作，獲得一株能較好利用乙酰輔酶A、天然脫落酸產(chǎn)量提高幅度較大的菌株TBC-20。本發(fā)明人利用葡萄孢霉屬(Botrytis)菌株，(例如，灰葡萄孢霉Botrytis cinerea)，尤其是灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)遺傳改良菌株TBC-20，發(fā)酵生產(chǎn)脫落酸，在發(fā)酵工藝中將乙酰輔酶A和吐溫-20分別作為前體物質(zhì)和表面活性劑加入發(fā)酵體系， 發(fā)現(xiàn)能有效提高脫落酸的產(chǎn)量，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明的目的是提供一種通過流加乙酰輔酶A(Acetyl Coenzyme A)作為菌株合成脫落酸的前體物質(zhì)，同時，添加表面活性劑吐溫-20改善發(fā)酵液溶氧狀況，發(fā)酵生產(chǎn)脫落酸的方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種用于產(chǎn)生天然脫落酸的新菌株。更具體地說，本發(fā)明提供一種發(fā)酵制備天然脫落酸的新方法，它包含如下步驟將能夠產(chǎn)生天然脫落酸的真菌在一級液體培養(yǎng)基(例如，下文所述的培養(yǎng)基A) 中培養(yǎng)，制得第一級種子液，所述的真菌選自葡萄孢霉屬(Botrytis)(例如，灰葡萄孢霉 Botrytis cinerea)及上述菌株的遺傳改良菌等；將在上述第一級液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)好的第一級種子液接種到第二級液體培養(yǎng)基 (例如，下文所述的培養(yǎng)基B)中培養(yǎng)，制得第二級種子液；將在上述第二級液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的第二級種子液接種到第三級液體培養(yǎng)基(例如，下文中所述的培養(yǎng)基C)中培養(yǎng)12-72小時后，加入表面活性劑吐溫-20以改善發(fā)酵液溶氧狀況，并開始進(jìn)行第三級液體培養(yǎng)基流加補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)，同時流加乙酰輔酶A作為菌株合成脫落酸的前體物質(zhì)，提高脫落酸的產(chǎn)量。從上述發(fā)酵培養(yǎng)液中收集所得的脫落酸。本發(fā)明的具體實施方案是，采用產(chǎn)生天然脫落酸的葡萄孢霉屬菌株或其遺傳改良菌，在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行三級發(fā)酵培養(yǎng)，在每級發(fā)酵階段選用不同的培養(yǎng)基。在第三級發(fā)酵中，以適合于第三級發(fā)酵的液體培養(yǎng)基，例如下文中描述的培養(yǎng)基C，作為發(fā)酵培養(yǎng)基， 230C 溫度下培養(yǎng)12-72小時后，加入生物表面活性劑吐溫_20，開始液體培養(yǎng)基流加補(bǔ)料，并同時流加乙酰輔酶A。第三級液體培養(yǎng)基(例如培養(yǎng)基C)流加補(bǔ)料方式可以采用連續(xù)(勻速或非勻速) 流加和/或間歇式流加方式，間歇流加方式是優(yōu)選的。乙酰輔酶A流加方式可以采用連續(xù)(勻速或非勻速)流加和/或間歇式流加方式， 連續(xù)(勻速或非勻速)流加方式是優(yōu)選的。所述的連續(xù)(勻速或非勻速)流加方式，是以(XOl-IOmgA^h(勻速或非勻速) 將濃度100U/mg-500U/mg的乙酰輔酶A，連續(xù)流加入第三級發(fā)酵罐，直至停止發(fā)酵(下罐) 前例如大約50小時。
所述的間歇式流加方式，是以間隔一段時間加一次料的方式，間歇式將100U/ mg-500U/mg濃度的乙酰輔酶A，流加入第三級發(fā)酵罐。間歇時間優(yōu)選為每隔2_30小時補(bǔ)料 1-5次，更優(yōu)選為大約間隔5小時補(bǔ)料1次。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可根據(jù)需要，采用其它的適合時間間隔補(bǔ)料流加。發(fā)酵條件溫度23°C -29°C，pH :4_7發(fā)酵時間8-11天。采用本發(fā)明工藝，通過流加一定濃度的乙酰輔酶A，作為菌株合成脫落酸的前體物質(zhì)，同時，添加生物表面活性劑吐溫-20改善發(fā)酵液溶氧狀況，提高菌株對氧的利用效率和產(chǎn)酸率，降低能耗，從而降低生產(chǎn)成本。發(fā)酵培養(yǎng)液中的脫落酸用常規(guī)方式回收，例如采用有機(jī)溶劑萃取法、薄膜過濾法、離子交換樹脂法、大孔吸附樹脂法、硅膠柱層析法及活性碳吸附法等提取后，即得白色或淡黃色結(jié)晶脫落酸；按照下述文獻(xiàn)中提供的脫落酸立體化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定方法，確定為天然脫落酸譚紅等，利用原生質(zhì)體誘變技術(shù)篩選脫落酸高產(chǎn)菌株，應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報1998，4 (3) :281-285。在優(yōu)選的具體實施方案中，本發(fā)明還采用例如新菌株等技術(shù)方案來進(jìn)一步提高天然落脫酸的產(chǎn)量。本發(fā)明方法可以采用已知的產(chǎn)生天然脫落酸的菌株，例如，已知的、或由微生物遺傳工程方法獲得的產(chǎn)生天然脫落酸的葡萄孢霉屬菌株(例如，灰葡萄孢霉Botrytis cinerea)或其遺傳改良菌。在優(yōu)選的本發(fā)明方法中，使用已知的產(chǎn)生脫落酸的高產(chǎn)菌種， 例如 Botrytiscinerea ΤΒ-3_Η8、ΤΒΙ_9 (CGMCC No. 0500,已在專利 ZL00132024. 6 中公開)、 TBC-10 (CGMCC No. 1889，已在專利 2007100(^609. 2 中公開)、Ferm Ρ-6156，B. C. FD338 等。 在最優(yōu)選的本發(fā)明方法中使用新菌株脫落酸高產(chǎn)菌株灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea) TBC-20，其已在2011年3月9日保藏于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中國科學(xué)院微生物研究所(郵編610041)中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為 CGMCC No. 4645，該菌株是將灰葡萄孢霉菌(Botrytis cinerea) TB-3-A3采用微生物分子遺傳學(xué)技術(shù)，如基因組改組(重排)技術(shù)、基因定向誘變技術(shù)等，獲得的遺傳改良菌株。本發(fā)明工藝過程采用三級發(fā)酵技術(shù)，采用三級發(fā)酵來制備脫落酸是已知的(參見，例如，CN1182798A, ZL00132024. 6)。根據(jù)三級發(fā)酵的不同要求，分別選擇三種不同的培養(yǎng)基來進(jìn)行發(fā)酵，這些培養(yǎng)基可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適合于此目的的培養(yǎng)基或是發(fā)明專利ZL00132024. 6中公開的培養(yǎng)基。使用發(fā)明專利ZL00132024. 6中公開培養(yǎng)基是優(yōu)選的。發(fā)明專利ZL001320M.6中公開了培養(yǎng)基A、B、C，其具體組成如下培養(yǎng)基A
權(quán)利要求
1.一種高效制備天然脫落酸的方法，其特征是采用灰葡萄孢霉菌(Botrytis cinerea) TBC-20, CGMCC No. 4645 作為發(fā)酵菌種。
2.一種高效制備天然脫落酸的方法，其特征是發(fā)酵過程中添加乙酰輔酶A。
3.一種高效制備天然脫落酸的方法，其特征是發(fā)酵過程中添加吐溫-20。
4.一種高效制備天然脫落酸的方法，其特征是采用灰葡萄孢霉菌(Botrytis cinerea) TBC-20, CGMCC No. 4645，在第一級液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將在第一級液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)好的第一級種子液接種到第二級液體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)；將在上述第二級液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的第二級種子液接種到第三級液體培養(yǎng)基中，在發(fā)酵培養(yǎng)12-72小時后，加入吐溫-20，開始進(jìn)行第三級液體培養(yǎng)基流加補(bǔ)料，并同時流加乙酰輔酶A發(fā)酵培養(yǎng)；從上述發(fā)酵培養(yǎng)液中收集所得的脫落酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的高效制備天然脫落酸的方法，其特征是所述的流加乙酰輔酶A流加補(bǔ)料為連續(xù)流加和/或間歇式流加方式；吐溫-20為一次性加入。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的高效制備天然脫落酸的方法，其特征是所述的連續(xù)流加為勻速或非勻速流加。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的高效制備天然脫落酸的方法，其特征是所述的連續(xù)流加方式是以0. 01-10mg/L · h的流加速率將濃度為100U/mg-500U/mg的乙酰輔酶A連續(xù)流加入第三級發(fā)酵罐，直至停止發(fā)酵前50小時。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的高效制備天然脫落酸的方法，其特征是所述的間歇式流加乙酰輔酶A方式，是每間歇2-30小時補(bǔ)料1-5次濃度為100U/mg-500U/mg的乙酰輔酶A。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的高效制備天然脫落酸的方法，其特征是所述的間歇式流加乙酰輔酶A方式是每間隔5小時補(bǔ)料1次濃度為100U/mg-500U/mg的乙酰輔酶A，每次補(bǔ)加量為0.01-10. Omg/L發(fā)酵液。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的高效制備天然脫落酸的方法，其特征是所述的吐溫-20添加方式采用一次性加入，加入量為發(fā)酵液體積的0. 01% -5. 0%。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種在發(fā)酵過程中流加乙酰輔酶A作為菌株合成脫落酸的前體物質(zhì)，同時，添加生物表面活性劑吐溫-20改善發(fā)酵液溶氧狀況來制備天然脫落酸的方法。該方法包括下列步驟將能夠產(chǎn)生天然脫落酸的真菌在第一級液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；將培養(yǎng)好的第一級種子液接種于第二級液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)；在第三級液體培養(yǎng)基中流加補(bǔ)料，并同時加入吐溫-20和流加乙酰輔酶A進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；以及從發(fā)酵培養(yǎng)液中收集所得的脫落酸。本發(fā)明方法可提高菌株對氧的利用效率和產(chǎn)酸率，使菌株以較高的底物轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物合成速率生產(chǎn)脫落酸，提高了產(chǎn)量和生產(chǎn)效率，降低能耗，從而降低生產(chǎn)成本。
文檔編號C12P7/42GK102399827SQ20111036994
公開日2012年4月4日 申請日期2011年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月18日
發(fā)明者周金燕, 楊杰, 肖亮, 譚紅, 鐘娟 申請人:中國科學(xué)院成都生物研究所