專(zhuān)利名稱(chēng)：雞傳染性貧血病毒lamp檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及雞傳染性貧血病毒的生物學(xué)鑒定方法，特別涉及對(duì)雞傳染性貧血病毒特定基因片段具有特異性的引物組，還涉及將所述引物組用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法快速檢測(cè)雞傳染性貧血病毒的試劑盒。
背景技術(shù)：
雞傳染性貧血病毒(Chicken anemia virus,CAV)是雞傳染性貧血病(Chicken infectious anemia, CIA)的病原。CAV感染可引起雛雞骨髓造血組織和胸腺等淋巴組織萎縮，從而導(dǎo)致嚴(yán)重貧血和免疫抑制，引起繼發(fā)感染和疫苗免疫失敗。我國(guó)于1992年首次在黑龍江省分離到CAV，目前該病在我國(guó)流行范圍不斷擴(kuò)大、感染率增高的趨勢(shì)。雞貧血病毒是目前已知最小的動(dòng)物病毒之一，為單股環(huán)狀DNA，基因組長(zhǎng)度為 2.3 1Λ。CAV基因組單鏈有3個(gè)部分或完全重疊的開(kāi)放閱讀框(0RF)，分別編碼核衣殼蛋白VP1、相關(guān)蛋白VP2、細(xì)胞凋亡因子VP3 3種蛋白。至今發(fā)現(xiàn)的所有CAV毒株的抗原性都相同，均屬于同一個(gè)血清型。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(Loop mediated isothermal amplification，LAMP)是由 Notomi等于2000年開(kāi)發(fā)的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，其特點(diǎn)是針對(duì)靶序列的6個(gè)特異性區(qū)域設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase) 在等溫條件下(65 °C左右)保溫30 60 min，即可實(shí)現(xiàn)核酸的大量擴(kuò)增，并且伴有肉眼可見(jiàn)的副產(chǎn)物白色焦磷酸酶沉淀產(chǎn)生。此外，還可以向產(chǎn)物中加入DNA熒光染料的方法進(jìn)行判定。該項(xiàng)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于病毒、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)等病原檢測(cè)和胚胎性別的鑒定。對(duì)CAV的診斷有血清學(xué)和分子生物學(xué)等多種方法，其中LAMP法具有特異性高、操作簡(jiǎn)便、不需特殊設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)在臨診應(yīng)用上優(yōu)勢(shì)明顯。目前，已公開(kāi)的與本專(zhuān)利相關(guān)的針對(duì) CAV檢測(cè)的LAMP引物組如“一種快速檢測(cè)雞傳染性貧血病毒的方法及試劑盒”(專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮?00810223382. 9)，其引物組位于CAV基因序列的491bp 732bp位點(diǎn)之間。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種雞傳染性貧血病毒的檢測(cè)方法，要求具有特異性高、操作簡(jiǎn)便、不需特殊設(shè)備，在獸醫(yī)臨床診斷或檢疫中應(yīng)用強(qiáng)的特點(diǎn)。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明公開(kāi)一種通過(guò)環(huán)介導(dǎo)的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測(cè)雞傳染性貧血病毒基因的特異性引物組，并提供利用上述引物組快速、高效、特異性地檢測(cè)雞傳染性貧血病毒的方法，以及利用上述方法制備的快速檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明的上述內(nèi)容是通過(guò)以下方案實(shí)現(xiàn)
一、本發(fā)明的雞傳染性貧血病毒基因檢測(cè)用引物組，是基于基于環(huán)介導(dǎo)的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，根據(jù)Genebank上已公開(kāi)的雞傳染性貧血病毒基因組序列，經(jīng)比對(duì)后選取高度同源的基因組序列，以65個(gè)國(guó)內(nèi)外CAV毒株100%同源的基因序列532bp 729bp位的198個(gè)核苷酸序列為靶區(qū)域，設(shè)計(jì)特異性LAMP引物組，通過(guò)LAMP法特異性擴(kuò)增來(lái)鑒定雞傳染性貧血病毒基因。所述65個(gè)國(guó)內(nèi)外CAV毒株Genebank登錄號(hào)如附錄表2所示。所述特異性LAMP引物組包括以下6條引物 正向外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示； 反向外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示; 正向內(nèi)引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示； 反向內(nèi)引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示； 正向環(huán)引物L(fēng)F，其核苷酸序列如SEQ ID NO 5所示； 反向環(huán)引物L(fēng)B，其核苷酸序列如SEQ ID NO 6所示。二、本發(fā)明的雞傳染性貧血病毒快速檢測(cè)方法，是采用上述引物組對(duì)待測(cè)樣品的 DNA進(jìn)行環(huán)等溫?cái)U(kuò)增，反應(yīng)體系與條件為范圍值內(nèi)的變量；反應(yīng)產(chǎn)物是通過(guò)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，陽(yáng)性反應(yīng)呈現(xiàn)梯狀帶；或加入Mg2+，檢測(cè)副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀物的濁度；或加入顯色劑，根據(jù)顏色變化來(lái)判斷反應(yīng)結(jié)果。具體檢測(cè)方法為
(1)樣品處理和模板提取，樣品范圍適用于組織病料、細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清等病毒待檢樣品。取適量樣品(可適量加入堿液稀釋?zhuān)筆H 8. 3 9. 3)煮沸裂解后，離心取上清作為 LAMP模板。(2)雞傳染性貧血病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增取模板、擴(kuò)增反應(yīng)液和酶，最后加入雙蒸水至25PL，600C-
應(yīng)結(jié)束后置于90°C下5min滅活酶。反應(yīng)體系如下 所述25PL的LAMP擴(kuò)增體系中各組分的含量為 待檢測(cè)核酸模板(DNA)
66°C 保溫 30min 70min，反
正向外引物F3 反向外引物B3 正向內(nèi)引物FIP 反向內(nèi)引物BIP 正向環(huán)引物L(fēng)F 反向環(huán)引物L(fēng)B 舌甘菜堿betaine dNTP MgCl2
反應(yīng)緩沖液Buffer IOX Bst DNA Polymerase
1· 0 5· Ομ 0· 1 0· 8 μΜ 0· 1 0· 8 μΜ 0· 2 1· 4 μΜ 0· 2 1· 4 μΜ 0· 0 0· 5μΜ 0· 0 0· 5μΜ 0· 2 1· 4μΜ 0· 4 1. 6mM 1· 0 3. 5mM 1/10總反應(yīng)體積 0. 08 1· Ομ 加至25μ
種雞傳染性貧血病毒基因的快速檢測(cè)試劑盒，
(MH2O
三、依據(jù)上述檢測(cè)方法，本發(fā)明還提供該試劑盒包括
a.反應(yīng)液含雞傳染性貧血病毒基因檢測(cè)用引物組的混合液，同時(shí)包含除聚合酶以外的LAMP反應(yīng)體系中所有需要試劑及緩沖液；
引物組包括正向外引物F3，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示；反向外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO 2所示；正向內(nèi)引物FIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示；反向內(nèi)引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO 4所示；正向環(huán)引物L(fēng)F，其核苷酸序列如SEQ ID NO 5所示；反向環(huán)引物L(fēng)B，其核苷酸序列如SEQ ID NO 6所示。反應(yīng)液的試劑及緩沖液包括甜菜堿Betaine、dNTP、MgCl2、反應(yīng)緩沖液Buffer IOX。b.陰陽(yáng)性對(duì)照品陽(yáng)性對(duì)照品為攜帶雞傳染性貧血病毒靶基因克隆的質(zhì)粒DNA， 陰性對(duì)照品為ddH20。c. Bst DNA聚合酶或fei DNA聚合酶大片段。d.顯色劑SYBR Green I 或 EvaGreen，優(yōu)選 SYBR Green I。所述試劑盒25PL的LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系為 反應(yīng)液Ι5μ Bst DNA Polymerase 1. Ομ
待檢測(cè)模板(DNA)1.0 μ 5. Ομ
ddH20補(bǔ)至 25μ
所述試劑盒LAMP優(yōu)選擴(kuò)增條件為反應(yīng)溫度為65°C，反應(yīng)時(shí)間為60min。本發(fā)明采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，與其它檢測(cè)技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下特點(diǎn)
1.本發(fā)明設(shè)計(jì)的LAMP引物組的設(shè)計(jì)是其技術(shù)的關(guān)鍵，通過(guò)選擇目前GeneBank已公布的CAV基因序列進(jìn)行比對(duì)，選擇高度保守區(qū)域進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，同時(shí)只有在前4種特異引物完全識(shí)別靶基因的6個(gè)區(qū)域情況下才能順利擴(kuò)增，從而保證了其對(duì)傳染性貧血病毒基因擴(kuò)增的特異性和檢測(cè)的全面性；此外，還設(shè)計(jì)了一對(duì)環(huán)引物，以提高其擴(kuò)增效率；
2.本發(fā)明的快速檢測(cè)方法，其檢測(cè)靈酶度較普通PCR高，擴(kuò)增模板濃度僅需10個(gè)考貝或更小，檢測(cè)效率可達(dá)IO9 101°個(gè)數(shù)量級(jí)；
3.本發(fā)明采用LAMP技術(shù)，采用等溫?cái)U(kuò)增，不需特殊儀器或設(shè)備，只需放在一個(gè)60 66°C恒溫環(huán)境中，30 70min即可完成靶基因的高效擴(kuò)增；擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行顯色反應(yīng)，陰陽(yáng)性結(jié)果差異顯著，肉眼可直接進(jìn)行結(jié)果的判定；
4.本發(fā)明的雞傳染性貧血病毒基因快速檢測(cè)試劑盒具有操作簡(jiǎn)單、特異性高、不需特殊設(shè)備，成本低廉，結(jié)果易判定，適用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)、基層獸醫(yī)臨床診斷或疫病的監(jiān)測(cè)。


圖1 :CAV的LAMP引物設(shè)計(jì)示意圖
斜體加粗內(nèi)容分別為^i/和欲///限制性酶切位點(diǎn)。圖2 重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果
M =DNA Maker DL2000 ；1 :pMD18-CAV_2 重組質(zhì)粒；2 :pMD18-CAV_2 酶切鑒定結(jié)果。圖3 雞傳染性貧血病毒分離毒株LAMP檢測(cè)結(jié)果
M =DNA Maker DL2000 ；1 AH10-1 CAV分離株；2 重組質(zhì)粒pMD18_CAV LAMP檢測(cè)結(jié)果； 3 陰性對(duì)照結(jié)果。圖4 雞傳染性貧血病毒分離毒株LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物SuperGreen I熒光試劑染色白光觀察結(jié)果
1 有環(huán)引物的CAV LAMP擴(kuò)增；2 無(wú)環(huán)引物的CAV LAMP擴(kuò)增；3 陰性對(duì)照。圖5 雞傳染性貧血病毒LAMP反應(yīng)酶切鑒定結(jié)果M =DNA Maker DL2000 ；1 :/ ^/酶切鑒定結(jié)果(233bp和169bp)；妨TZ/酶切鑒定結(jié)果 (147bp 和 61bp)。圖6 雞傳染性貧血病毒不同Tm值LAMP反應(yīng)的結(jié)果
M =DNA Maker DL2000 ；1 7 :Tm 值分別為 60 °C、61°C、62 °C、63 °C、64 °C、65 °C、66 °C LAMP反應(yīng)結(jié)果。圖7 雞傳染性貧血病毒不同反應(yīng)時(shí)間LAMP反應(yīng)的結(jié)果
M =DNA Maker DL2000 ；1 7 Tm 值分別為 10min、20min、30min、40min、50min、60min、 70min LAMP反應(yīng)結(jié)果。圖8 雞傳染性貧血病毒不同Betaine濃度LAMP反應(yīng)的結(jié)果
M =DNA Maker DL2000 ；卜7 分別為 1. 0 μ L、2. 0 μ L、3. 0 μ L、4. 0 μ L、5. 0 μ L、6. 0 μ L、 7. 0 μ L Betaine LAMP 反應(yīng)結(jié)果。圖9 雞傳染性貧血病毒不同正反向外引物濃度LAMP反應(yīng)的結(jié)果
M =DNA Maker DL2000 ;1 7 分別為 0· 25 μ L、0. 5 μ L、0· 75 μ L、1· 0 μ L、1· 25 μ L、 1. 5 μ L、2. 0 μ L正反向外引物L(fēng)AMP反應(yīng)結(jié)果。圖10 雞傳染性貧血病毒不同正反向內(nèi)引物濃度LAMP反應(yīng)的結(jié)果
M =DNA Maker DL2000 ；卜 7 分別為 0. 5 μ L、1. 0 μ L、1. 5 μ L、2. 0 μ 1、2· 5μ L、3. 0μ 1、 3. 5 μ L正反向外引物L(fēng)AMP反應(yīng)結(jié)果。圖11 雞傳染性貧血病毒不同正反向環(huán)引物濃度LAMP反應(yīng)的結(jié)果
M :DNA Maker DL2000 ;1 7 分另Ij 為 O μ L、0. 25 μ L、0. 5 μ L、0. 75 μ L、1. O μ L、 1.25yLU.5yL正反向外引物L(fēng)AMP反應(yīng)結(jié)果。圖12 雞傳染性貧血病毒不同Mg2 +濃度LAMP反應(yīng)的結(jié)果
M =DNA Maker DL2000 ；卜 7 分別為 0. 5 μ L、1. O μ L、1. 5 μ L、2. O μ L、2. 5 μ L、3. O μ L、
3.5 μ L 25mM 的 MgCl2 LAMP 反應(yīng)結(jié)果。圖13 雞傳染性貧血病毒不同dNTP濃度LAMP反應(yīng)的結(jié)果
M =DNA Maker DL2000 ；卜7 分別為 1. O μ L、1. 5 μ L、2. O μ L、2. 5 μ L、3. O μ L、3. 5 μ L、
4.O μ L IOmM dNTP 的 LAMP 反應(yīng)結(jié)果。圖14 雞傳染性貧血病毒不同濃度DNA聚合酶LAMP反應(yīng)的結(jié)果
M =DNA Maker DL2000 ； 1 7 :Bst DNAPolymerase 酶(8U/μ L)分另Ij 為 0. 25 μ L、 0. 5μ L、l. Ομ L、l. 5μ L、2. Ομ L、2. 5μ L、3. Ομ L 的 LAMP 反應(yīng)結(jié)果。圖15 雞傳染性貧血病毒LAMP反應(yīng)常見(jiàn)致病菌鑒別診斷的結(jié)果
M =DNA Maker DL2000 ；1 陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)結(jié)果；2 陰性對(duì)照反應(yīng)結(jié)果；3 6 分別大腸桿菌、葡萄球菌、糞腸球菌、巴氏桿菌的LAMP反應(yīng)結(jié)果。圖16 雞傳染性貧血病毒LAMP反應(yīng)常見(jiàn)動(dòng)物病毒鑒別診斷的結(jié)果
M =DNA Maker DL2000 ；1 陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)結(jié)果；2 陰性對(duì)照反應(yīng)結(jié)果；3 7 分別為 NDV, AIV、IBDV、MDV、ALV-J LAMP 檢測(cè)結(jié)果。圖17 感染雞傳染性貧血病毒病臨床樣品LAMP反應(yīng)的結(jié)果
M =DNA Maker DL2000 ；1 6 感染CAV陽(yáng)性雞血液、脾臟、骨髓、心臟、肝臟、腎臟病料樣品LAMP反應(yīng)結(jié)果7 陰性對(duì)照反應(yīng)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但所述具體實(shí)施例不以任何形式限定本發(fā)明。實(shí)施例一雞傳染性病毒(CAV) LAMP方法的建立與反應(yīng)條件的優(yōu)化 1. pMD18-CAV克隆及質(zhì)粒模板的構(gòu)建
1.1實(shí)驗(yàn)材料 1. 1. 1病毒毒株
CAV分離株AH10-1，由家禽疫病防控監(jiān)測(cè)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。1.1.2質(zhì)粒載體和受體菌株
質(zhì)粒載體pMD18-T Vector Kit購(gòu)自TaKaRa公司。受體菌株感受態(tài)大腸桿菌Dffia購(gòu)自南京天為時(shí)代生物科技有限公司。1.1. 3 培養(yǎng)基
LB液體培養(yǎng)基稱(chēng)取胰蛋白胨10g，酵母浸出物5g，氯化鈉10g，置于IL燒杯中，加入800mL去離子水，充拌溶解；滴加5mol/L NaOH (約0. 2mL)，調(diào)pH至7. 0 ；加去離子水定容至1L，高壓滅菌后，4°C冰箱保存?zhèn)溆?。LB固體培養(yǎng)基LB液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入1. 5%的優(yōu)質(zhì)瓊脂粉，高壓滅菌后，冷至約60°C時(shí)加入終濃度為160U/ml的氨芐青酶素鈉，混勻后倒入平皿中，4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?. 1. 4聚合酶及其它工具酶
ρ μ DNA聚合酶、普通Taq DNA聚合酶購(gòu)自hvitrogen公司。1.1.5 試劑盒
Gel Extraction Kit (50)及 Pasmid Mini Kit I (100)購(gòu)自 OMEGA Bio-tek 公司； PMD18-T Vector Kit (20)購(gòu)自 TaKaRa 公司。1. 1. 6緩沖液及其它試劑
50 X TAE (Tris-乙酸)24. 2 g Tris 堿，5. 71 g 冰乙酸，10 mL 500 mmol/L EDTA(pH8. 0),離子水定容至100 mL，工作液為IXTAE06 X上樣緩沖液0. 25%溴酚藍(lán)，40%(w/v)蔗糖水溶液。1. 0%瓊脂糖凝膠稱(chēng)取1. 0 g瓊脂糖溶于100 mL 1 X TAE電泳緩沖液，熔化稍冷加入1 μ L IOOOOx EB染色劑，混勻后制膠。TE Buffer :10 mmol/L Tris .Cl (ρΗ8· 0)，1 mmol/L EDTA (ρΗ8· 0)，121°C高壓滅菌 20 rnin。ITPG IPTG(20%，m/V,0. 8mol/L)，稱(chēng)取 IOg 異丙基硫代-B-D 半乳糖苷(IPTG)，加入40mL滅菌水，用蒸餾水定容至50mL，用0. 22 μ m過(guò)濾器過(guò)濾除菌，分裝成ImL小份，貯存于-20°C冰箱備用。X-gal =X-Gal (20mg/mL)，稱(chēng)取 Ig X-gal 置于 50mL 容量瓶中，加入 40mL DMF (二甲基酰胺)，充分混勻溶解后定容至50mL，用0. 22 μ m過(guò)濾器過(guò)濾除菌，小瓶分裝后于_20°C冰箱備用。氨芐青霉素Amp (100mg/mL)稱(chēng)取5g Amp置于50 mL容量瓶中，加入40 mL滅菌水，充分混合溶解后，定容至50mL，22 μ m過(guò)濾器過(guò)濾除菌，分裝成ImL小份，貯存于_20°C冰箱備用。其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。1. 2實(shí)驗(yàn)方法
1. 2. 1病毒DNA的提取
①將含毒組織剪碎、勻漿，一20°C充分反復(fù)凍融三次，5000Xg離心5min，取上清；
②取上清300μ 加入等體積的Tris平衡酚，充分混勻，12000rpm離心lOmin，取上清； 加入等體積的iTris平衡酚和氯仿(1:1)，充分混勻，12000rpm離心lOmin，取上清；加入等體積的氯仿，充分混勻，12000rpm離心lOmin，取上清；
③加入兩倍體積的冰凍無(wú)水乙醇，輕輕混勻，于-20 沉淀30min，然后12000rpm離心 5min,
倒液體，70%乙醇潤(rùn)洗兩次，傾去，自然涼干；
④用50μ TE溶解沉淀于4°C保存?zhèn)溆谩?. 2. 2 LAMP檢測(cè)用陽(yáng)性CAV模板的引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增引物序列如下
上游引物5' -GTA GCG CAA GGC ACA AAT AAG-3，
下游引物5' -CAG CCA CAC AGC GAT AGA G_3'，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1106bpo1. 2. 3目的基因的PCR擴(kuò)增按常規(guī)20μ 體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系如下模板DNA IOXBuffer ΙΟμΜ的上游引物 ΙΟμΜ的下游引物 IOmM 的 dNTP 5μ/μ 的 iTaq 酶 ddH20加至反應(yīng)條件如下 95 "C 94 0C 57 0C 72 0C 72 0C1. 2. 4 pMD18-CAV重組載體的構(gòu)建將擴(kuò)增產(chǎn)物純化后克隆到PMD18-T上，構(gòu)建重組載體。1. 2. 4. 1 PCR產(chǎn)物的純化與回收
按OMEGA Bio-tek公司膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)方法回收膠中的DNA，暫放4°C保存，步驟 (略)。1. 2. 4. 2 PCR產(chǎn)物連入T載體
將上述膠回收產(chǎn)物連接T載體pMD-18T中，連接的反應(yīng)體系(10μυ如下 T-Vector0. 5μ
5. Ομ 2. Ομ 1. Ομ 1. Ομ 0. 8μ 0. 5μ 20μ
5min 50 s 50 s
lmin, 30 cycles, 10min，4°C 保存。膠回收產(chǎn)物1. OML
Solution I5. OML
(MH2O3. 5ML
混勻后放置16°C保溫瓶中水浴30min。1. 2. 4. 3 轉(zhuǎn)化
從-70°C冰箱中取出1支100ML的Dffia感受態(tài)細(xì)胞，于冰水浴中4°C冰箱放置lOmin，將 上述連接產(chǎn)物IOML加入100ML感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻后冰水浴30min，42°C熱休克90s， 立即放于冰浴中3min，加入800ML LB液體培養(yǎng)基，于37°C振蕩培養(yǎng)箱孵育45min至lh， 5000rpm/min離心5min，棄去大部分上清，留100ML重懸培養(yǎng)物，均勻地涂布于含Amp+、 X-gal和ITPG的LB瓊脂平板(LB平板預(yù)先于37°C溫育IOmin)上。待吸收完全，置37°C培 養(yǎng)箱培養(yǎng)12 16h (內(nèi)置濕盒)，根據(jù)藍(lán)白斑挑選重組子。1.2.4.4陽(yáng)性克隆菌的篩選與鑒定
從平板上隨機(jī)挑取白色單個(gè)菌落，分別接種到含5ml的LB液體培基(含Amp 160U/ml) 的滅菌試管中，37°C振搖培養(yǎng)12 16h，對(duì)搖菌樣品進(jìn)行菌液PCR的鑒定，選擇鑒定陽(yáng)性菌 液進(jìn)行測(cè)序，質(zhì)粒命名為PMD18-CAV-2。1. 2. 5重組質(zhì)粒pMD18-CAV-2的提取及酶切鑒定
對(duì)測(cè)序正確的菌液進(jìn)行擴(kuò)增，37°C振搖培養(yǎng)12 IMi后，按OMEGA Bio-tek公司質(zhì)粒 小量提取試劑盒說(shuō)明書(shū)方法提取質(zhì)粒DNA，一 20°C保存，步驟(略)。重組質(zhì)粒進(jìn)行和 SalI雙酶切，其鑒定結(jié)果如圖2所示。2.雞傳染性病毒(CAV) LAMP檢測(cè)方法的建立 2. 1材料與試劑
2. 1. 1菌毒株
CAV分離株AH10-2和pMD18-CAV-2菌毒株由家禽疫病防控監(jiān)測(cè)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。2. 1. 2聚合酶及其它工具酶
Bst DNA聚合酶大片段，購(gòu)自New England Biolabs公司；限制性?xún)?nèi)切酶/ ^/和妨/// 購(gòu)自 MBI Fermaters 公司。2.2 方法
2. 2. 1雞傳染性貧血病毒LAMP引物的設(shè)計(jì)
對(duì)已登錄的GeneBank的CAV分離株，從中選擇同源較高的區(qū)域進(jìn)行LAMP引物組的設(shè) 計(jì)。通過(guò)同源性比對(duì)最終確定以目前GeneBank中65個(gè)分離株100%同源的
基因序列532bp 729bp位198bp核苷酸序列設(shè)計(jì)引物。引物設(shè)計(jì)是通過(guò)I^rimer Explorer V4軟件進(jìn)行在線設(shè)計(jì)的。首先設(shè)計(jì)四條LAMP引物，即一條正向正向外引物F3、一條反向外引物B3、一條正 向內(nèi)引物FIP、一條反向內(nèi)引物BIP，其中FIP由Fl和F2組成，BIP由Blc和B2c組成；然 后設(shè)計(jì)環(huán)引物(Loop I^rimer)，利用上一步生成的I^rimer Information File，再次輸入環(huán) 引物所需參數(shù)，選擇合適的環(huán)引物，即一條正向環(huán)引物L(fēng)F和一條反向環(huán)引物L(fēng)B。(注F1是 Flc的互補(bǔ)序列；Bl是Blc的互補(bǔ)序列；B3是B3c的互補(bǔ)序列；)
CAV的LAMP組引物序列和位置如圖1所示。用于設(shè)計(jì)引物的核苷酸序列及酶切位點(diǎn)已用實(shí)線和黑體標(biāo)出。引物合成由生物工程(上海)生物科技有限公司。
2. 2. 2雞傳染性貧血病毒LAMP的反應(yīng)體系及條件
以構(gòu)建的PMD18-CAV為模板，設(shè)計(jì)總體積為25μ 的反應(yīng)體系，具體內(nèi)容包括
反應(yīng)條件為65°C保溫30min，9(TC保溫5min終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)洲凝膠100V電泳40min，觀察結(jié)果，如圖3所示；反應(yīng)液中加入 SYBR Green I，紫外燈下觀察并拍照，如圖4所示。2. 2. 3雞傳染性貧血病毒LAMP產(chǎn)物的酶切鑒定
通過(guò)LAMP反應(yīng)產(chǎn)物的酶切鑒定可以進(jìn)一步確實(shí)所擴(kuò)增的靶基因。根據(jù)在正反向內(nèi)引物FIP和BIP上分別存在/ ^/和欲///酶切位點(diǎn)，預(yù)測(cè)/ ^/酶切產(chǎn)物分別為169bp 和233bp兩種片段，欲///酶切產(chǎn)物分別為61bp和147bp兩種片段。結(jié)果如圖5所示，與預(yù)期結(jié)果一致。J ；^ ιΙ Ι ；限制性?xún)?nèi)切酶PstI、Bg III反應(yīng)體系 (ιομυ如下
LAMP 產(chǎn)物5. ομ
BgIim PstI1. ομ
IOXBuffer R1. Ομ
ddH203. Ομ
37°C水浴2h，1%瓊脂糖凝膠電泳40min，觀察并記錄結(jié)果。2. 2. 4雞傳染性貧血病毒LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化
只選擇反應(yīng)體系中的一個(gè)/組條件進(jìn)行梯度變化，其它條件不變，進(jìn)行雞傳染性貧血病毒LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化。 ①雞傳染性貧血病毒LAMP不同Tm值條件的優(yōu)化
反應(yīng)混合液分別在60°C、61°C、62°C、63°C、64°C、65°C、66°C的溫度條件下保溫60min， 然后迅速加熱至90°C，反應(yīng)5min終止。反應(yīng)結(jié)束后取10μ 反應(yīng)產(chǎn)物與2μ 的6倍溴酚藍(lán)上樣緩沖液混合，加入含EB的凝膠電泳40min，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照，結(jié)果如圖6所示，根據(jù)電泳結(jié)果決定優(yōu)化條件；
待檢測(cè)核酸模板(DNA) 正向外引物F3 (10μΜ) 反向外引物Β3 (10μΜ) 正向內(nèi)引物FIP (ΙΟΟμΜ) 反向內(nèi)引物BIP (ΙΟΟμΜ) 正向環(huán)引物L(fēng)F (10μΜ) 反向環(huán)引物L(fēng)B (10μΜ) 甜菜堿 betaine (10μΜ) dNTP (IOmM)
0. 2μ 2.0 μ 2.0 μ 0.4 μ
0.4μ
1.Ομ
1.Ομ 5. Ομ 4. Ομ
2.5μ 2. 5μ 2. Ομ 2. Ομ
MgCl2 (25mM) 反應(yīng)緩沖液Buffer 10X Bst DNA Polymerase (8U/^L) (MH②雞傳染性貧血病毒LAMP不同反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化
反應(yīng)混合液在65°C溫度條件下分別保溫lOmin、20min、30min、40min、50min、60min、 70min，然后迅速加熱至90°C，反應(yīng)5min終止。電泳及觀察操作同2. 2. 3中的①，結(jié)果如圖 7所示，根據(jù)電泳結(jié)果決定優(yōu)化條件；
③感染雞傳染性貧血病毒LAMP不同Betaine的濃度優(yōu)化
25μ 反應(yīng)混合液中分別加入 1. O μ L、2. O μ L、3. O μ L、4. O μ L、5. O μ L、6. O μ L、7. O μ L 5 μ M的Betaine，在65°C溫度條件下分別保溫60min，然后迅速加熱至90°C，反應(yīng)5min終止。電泳及觀察操作同2. 2. 3中的①，結(jié)果如圖8所示，根據(jù)電泳結(jié)果決定優(yōu)化條件；
④雞傳染性貧血病毒LAMP不同正反向外引物濃度的優(yōu)化
25μ 反應(yīng)混合液中分別加入 0. 25μ L、0. 5μ L、0. 75 μ L、1. O μ L、1. 25μ L、l. 5μ L、
2.OyL 10 μ M的正反向外引物，在65°C溫度條件下分別保溫60min，然后迅速加熱至 90°C，反應(yīng)5min終止。電泳及觀察操作同2. 2. 3中的①，結(jié)果如圖9所示，根據(jù)電泳結(jié)果決定優(yōu)化條件；
⑤雞傳染性貧血病毒LAMP不同正反向內(nèi)引物濃度的優(yōu)化
25ML 反應(yīng)混合液中分別加入 0. 5 μ L、1. O μ L、1. 5 μ L、2. O μ 1、2. 5 μ L、3. O μ 1、
3.5yL 10 μ M的正反向內(nèi)引物，在65°C溫度條件下分別保溫60min，然后迅速加熱至 90°C，反應(yīng)5min終止。電泳及觀察操作同2. 2. 3中的①，結(jié)果如圖10所示，根據(jù)電泳結(jié)果決定優(yōu)化條件；
⑥雞傳染性貧血病毒LAMP不同正反向環(huán)引物濃度的優(yōu)化
25ML 反應(yīng)混合液中分別加入 Ομ L、0. 25μ L、0. 5μ L、0. 75 μ L、1· O μ L、1· 25 μ L、 1.5yL 10 μ M的正反向外引物，在65°C溫度條件下分別保溫60min，然后迅速加熱至 90°C，反應(yīng)5min終止。電泳及觀察操作同2. 2. 3中的①，結(jié)果如圖11所示，根據(jù)電泳結(jié)果決定優(yōu)化條件；
⑦雞傳染性貧血病毒LAMP不同不同的Mg2+濃度的濃度優(yōu)化
25μ 反應(yīng)混合液中分別加入 0. 5μ Λ. 0μ 、1. 5μ 、2. 0μ 、2. 5μ 、3. 0μ 、3. 5μ 25mM 的 MgCl2，在65°C溫度條件下分別保溫60min，然后迅速加熱至90°C，反應(yīng)5min終止。電泳及觀察操作同2. 2. 3中的①，結(jié)果如圖12所示，根據(jù)電泳結(jié)果決定優(yōu)化條件。⑧雞傳染性貧血病毒LAMP不同dNTP濃度的優(yōu)化
25μ 反應(yīng)混合液中分別加入 1. θμ 、1. 5μ 、2. 0μ 、2. 5μ 、3. 0μ 、3. 5μ Α. Ομ IOmM 的 dNTP,在65°C溫度條件下分別保溫60min，然后迅速加熱至90°C，反應(yīng)5min終止。電泳及觀察操作同2. 2. 3中的①，結(jié)果如圖13所示，根據(jù)電泳結(jié)果決定優(yōu)化條件。⑨雞傳染性貧血病毒LAMP不同DNA聚合酶的濃度優(yōu)化
25μ 反應(yīng)混合液中分別加入 0. 25μ 、0. 5μ Λ. 0μ 、1. 5μ 、2. 0μ 、2. 5μ 、3. Ομ 8U/ μ L的Bst DNAPolymerase酶，在65°C溫度條件下分別保溫60min，然后迅速加熱至90°C， 反應(yīng)5min終止。電泳及觀察操作同2. 2. 3中的①，結(jié)果如圖14所示，根據(jù)電泳結(jié)果決定優(yōu)化條件。實(shí)施例2雞傳染性貧血病毒LAMP在鑒別診斷中的應(yīng)用 1.材料與試劑
1. 1病毒(菌)株CAV分離株及含目的基因的CAV克隆菌株pMD18-CAV-2均由本實(shí)驗(yàn)室保存。1.2對(duì)照(菌)毒株
細(xì)菌對(duì)照組大腸桿菌、葡萄球菌、糞腸球菌、多殺性巴氏桿菌。病毒對(duì)照組雞新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、雞傳染性法氏囊病病毒 (IBDV)、雞馬立克氏病病毒(MDV-1)、J亞型禽白血病病毒(ALV-J)。1. 3 試劑
pfu DNA聚合酶、普通Taq DNA聚合酶購(gòu)自hvitrogen公司。Trizol、AMV反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司。2.實(shí)驗(yàn)方法
2. 1 DNA病毒樣品、細(xì)菌樣品DNA的制備
DNA病毒樣品、細(xì)菌樣品按實(shí)施例1中的1. 2. 1項(xiàng)進(jìn)行病毒DNA的提取。2. 2 RNA病毒樣品DNA的制備
參照TaKaRa公司Trizol說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA的提取，用clease-free water溶解RNA， 置-70°C保存。再參照TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. O的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA， 置-20°C保存。2.3使用優(yōu)化后的CAV的LAMP檢測(cè)反應(yīng)體系(25μ )
待檢測(cè)模板核酸模板(DNA)Ι.Ομ
反應(yīng)混合液正向外引物F3 (10μ Μ)1.0 μ
反向外引物Β3 (10 μ Μ)
1.0 μ 3.0 μ 3. Ομ 1. Ομ
1.Ομ 3. Ομ 3. Ομ
2.5μ 2. 5μ
正向內(nèi)引物FIP (10 μ Μ) 反向內(nèi)引物BIP (10 μ Μ) 正向環(huán)引物L(fēng)F (10 μ Μ) 反向環(huán)引物L(fēng)B (10 μ Μ) 甜菜堿 betaine (8 μ Μ) dNTP (10. OmM) MgCl2 (25. OmM) 反應(yīng)緩沖液Buffer 10Χ 鏈置換 DNA 聚合酶 Bst DNA Polymerase (8U/^L)1. Ομ
雙蒸水ddH202. Ομ
反應(yīng)條件為65°C保溫60min，9(TC保溫5min終止反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，在洲凝膠100V電泳40min，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)中觀察和記錄結(jié)果，如圖15,16所示。實(shí)施例3雞傳染性貧血病毒LAMP在臨床診斷中的應(yīng)用與驗(yàn)證 1.材料與試劑
1. 1病毒及樣本
CAV分離株AH10-1及其感染組織病料及血液等檢測(cè)陽(yáng)性樣品均由家禽疫病防控監(jiān)測(cè)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。1. 2 試齊[J
Bst DNA聚合酶大片段，購(gòu)自New England Biolabs公司；SYBR Green I染料購(gòu)自北京泛博生物化學(xué)有限公司。1. 3其它溶液
實(shí)驗(yàn)中所用的緩沖液同實(shí)施例1中的1. 2. 2
2.試驗(yàn)方法
2. 1臨床樣品的處理
樣品處理和模板提取，樣品范圍適用于組織病料、細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清等病毒待檢樣品。 取適量樣品(加入適量堿液稀釋?zhuān)筽H 8. 3 9. 3)煮沸裂解后，離心取上清作為L(zhǎng)AMP模板。2.2臨床樣品的LAMP反應(yīng)
臨床PCR檢測(cè)陽(yáng)性樣品有淋巴、脾臟、骨髓、心臟、肝臟、腎臟；LAMP反應(yīng)體系及條件，同實(shí)施例2中的2. 3項(xiàng)，并以組成的試劑盒形式進(jìn)行反應(yīng)，具體內(nèi)容如下 待檢測(cè)模板(DNA)1. 0 5. OPL
反應(yīng)混合液
鏈置換DNA聚合酶2. Ομ
雙蒸水(ddH20)補(bǔ)至25μ
LAMP擴(kuò)增條件為反應(yīng)溫度為63°C，反應(yīng)時(shí)間為60min。LAMP反應(yīng)結(jié)果的判定同實(shí)施例1中的2. 2. 2項(xiàng)，結(jié)果如圖17所示。附錄1 序列表 SEQ ID NO 1
正向外引物 F3 5 ‘ -TCAGGCCACCAACAAGTTC-3 ‘； SEQ ID NO 2
反向外引物 B3 5 ‘ -TGGGTTGATCGGTCCTCA-3 ‘； SEQ ID NO 3
正向內(nèi)引物 FIP:5' -CGCAGCCACACAGCGATAGAAACCCCTCACTGCAGAGAG-3 ‘； SEQ ID NO 4
反向內(nèi)引物 BIP 5 ‘ -GCTCCCACGCTAAGATCTGCAGTCCGGCACATTCTTGAAAC-3 ‘； SEQ ID NO 5
正向環(huán)引物 LF 5 ‘ -TTGTAATTCCAGCGATACCAATCCG-3 ‘； SEQ ID NO 6
反向環(huán)引物 LB 5 ‘ -ACTGCGGACAATTCAGAAAGCAC-3 ‘。附錄2 =CAV毒株Genebank登錄號(hào)
CAU65414、AY040632、M55918、D31965、L14767、AF199501、AB031296、AF242190、 AJ297682, AJ297686, AB046587、AB046588、AB046589、AB046590、AF313470、AF372658、 AY171617、AY999018、AF475908、AF520788、AF527037、AY150576、AY843527、AY839944、 DQ124936、AF311892、DQ141670、DQ141671、DQ141672、DQ141673、AF390038、AF390102、 AF285882、AY583755、AY583756、AY583758、DQ217400、DQ217401、AB248708、AB248709、 AB248710、AF311900、DQ991394、EF176599、EF189154、EF159944、EF159945、EF194840、 EF599955、EF673045、EF673046、EF683158、AM904730、EM424059、55FJ172347、FJ210680, 498868、FJ498869、FJ883784、FJ883786、FJ883790、GQ168483、GQ168482、GQ168484、 GQ421599、GQ253579、GQ253581、GQ253582、HM134240。
權(quán)利要求
1.雞傳染性貧血病毒LAMP檢測(cè)方法，其特征在于，包含特異性LAMP引物組，所述的引物組由一對(duì)外引物、一對(duì)內(nèi)引物組成，所述引物的核苷酸序列如下正向外引物F3，其核苷酸序列為5' -TCAGGCCACCAACAAGTTC-3‘；反向外引物B3，其核苷酸序列為5' -TGGGTTGATCGGTCCTCA-3‘；正向內(nèi)引物 FIP，其核苷酸序列為5' -CGCAGCCACACAGCGATAGAAACCCCTCACTGCAGAGA G-3'；反向內(nèi)引物 BIP，其核苷酸序列為5 ‘ -GCTCCCACGCTAAGATCTGCAGTCCGGCACATTCTTGAA AC-3'。
2.如權(quán)利要求1所述的雞傳染性貧血病毒LAMP檢測(cè)方法，其特征在于還包括一對(duì)環(huán)引物，所述環(huán)引物的核苷酸序列如下正向環(huán)引物L(fēng)F，其核苷酸序列為5' -TTGTAATTCCAGCGATACCAATCCG-3‘；反向環(huán)引物L(fēng)B，其核苷酸序列為5 ‘ -ACTGCGGACAATTCAGAAAGCAC-3 ‘。
3.如權(quán)利要求1或2所述雞傳染性貧血病毒LAMP檢測(cè)方法，其特征在于，所述引物組是以Genebank登錄的69個(gè)國(guó)內(nèi)外CAV毒株100%同源的基因序列532bp 729bp位的198 個(gè)核苷酸序列為靶區(qū)域設(shè)計(jì)特異性的LAMP引物組。
4.如權(quán)利要求3所述的雞傳染性貧血病毒LAMP檢測(cè)方法，其特征在于所述的69個(gè)國(guó)內(nèi)外CAV毒株Genebank登錄號(hào)如附錄表2所示。
5.如權(quán)利要求1或2所述的雞傳染性貧血病毒LAMP檢測(cè)方法，其特征在于，所述引物組通過(guò)等溫環(huán)介導(dǎo)擴(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增所述靶區(qū)域，確認(rèn)待測(cè)樣品中是否含有雞傳染性貧血病毒特定的基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的雞傳染性貧血病毒LAMP檢測(cè)方法，其特征在于，25μ 的LAMP 擴(kuò)增反應(yīng)體系為待檢測(cè)核酸模板(DNA)1. 0 5· Ομ 正向外引物F30. 1 0.8 μΜ反向外引物B30. 1 0.8 μΜ正向內(nèi)引物FIP0. 2 --1.4 μΜ反向內(nèi)引物BIP0. 2 --1.4 μΜ正向環(huán)引物L(fēng)F0. 0 0. 5μΜ反向環(huán)引物L(fēng)B0. 0 0. 5μΜ舌甘菜堿betaine0. 2 1. 4μΜdNTP0. 4 1. 6mMMgCl21. 0 3. 5mM1/10總反應(yīng)體積 0. 08 1. ΟμΜ 加至25μ 。 LAMP檢測(cè)方法，其LAMP擴(kuò)增條件為反反應(yīng)緩沖液Buffer IOX Bst DNA Polymerase (MH2O
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的雞傳染性貧血病應(yīng)溫度為60°C 66°C，反應(yīng)時(shí)間為30 70min。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的雞傳染性貧血病毒LAMP檢測(cè)方法，其特征在于靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物是通過(guò)產(chǎn)物染色瓊脂糖電泳，進(jìn)行判定來(lái)實(shí)現(xiàn)。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的雞傳染性貧血病毒LAMP檢測(cè)方法，其特征在于靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物是通過(guò)或加入Mg2+，檢測(cè)副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀的濁度，進(jìn)行判定來(lái)實(shí)現(xiàn)。
10.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的雞傳染性貧血病毒LAMP檢測(cè)方法，其特征在于靶基因擴(kuò)增產(chǎn)物是通過(guò)或加入STOR Green I，肉眼或紫外光線下觀察顏色變化的方法進(jìn)行判定來(lái)實(shí)現(xiàn)。
11.如權(quán)利要求1-10任一所述雞傳染性貧血病毒LAMP檢測(cè)方法設(shè)計(jì)的快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于該試劑盒包含所述特異性LAMP引物組。
12.如權(quán)利要求11所述的雞傳染性貧血病毒快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于包含a.反應(yīng)液含權(quán)利要求1所述雞傳染性貧血病毒基因檢測(cè)用引物組的混合液，包含除聚合酶以外的權(quán)利要求4所述LAMP反應(yīng)體系中所有需要試劑及緩沖液；b.陰陽(yáng)性對(duì)照品陽(yáng)性對(duì)照品為攜帶雞傳染性貧血病毒靶基因克隆的質(zhì)粒DNA，陰性對(duì)照品為ddH20 ；c.Bst DNA聚合酶或fei DNA聚合酶大片段；d.顯色劑SYBRGreen I 或 EvaGreen，優(yōu)選 STOR Green I。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述試劑盒，其特征在于，25PL的LAMP擴(kuò)增反應(yīng)體系為反應(yīng)混合液鏈置換DNA聚合酶待檢測(cè)模板(DNA) 雙蒸水(dcffi20)·2. Ομ 1. 0 5· Ομ 3. 0 7· Ομ ο
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種雞傳染性貧血病毒LAMP檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。選取雞傳染性貧血病毒基因序列532bp～729bp位的198個(gè)高度保守的核苷酸序列為靶區(qū)域，設(shè)計(jì)特異性LAMP引物組，包括正反向外引物F3、B3，正反向內(nèi)引物FIP、BIP，正反向環(huán)引物L(fēng)F、LB，其核苷酸序列為SEQNO1～6所示。用上述引物組在1小時(shí)內(nèi)可完成所述靶區(qū)域的高效擴(kuò)增，并根據(jù)條件通過(guò)產(chǎn)物染色瓊脂糖電泳/檢測(cè)副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀濁度/加入顯色劑后觀察顏色反應(yīng)進(jìn)行結(jié)果的判定。本發(fā)明形成的試劑盒具有方便、快速、價(jià)廉，特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，適用于雞傳染性貧血的臨床診斷與監(jiān)測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102344974SQ20111037239
公開(kāi)日2012年2月8日 申請(qǐng)日期2011年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月22日
發(fā)明者張訓(xùn)海, 汪小紅, 王軍, 王旋, 趙磊, 龔爭(zhēng) 申請(qǐng)人:張訓(xùn)海, 王旋