專利名稱：根特異啟動子驅動水通道蛋白基因 ZMPIP2a表達載體及構建方法
技術領域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領域，特別涉及一種根特異啟動子驅動水通道蛋白基因 ZMPIP2a表達載體及構建方法。
背景技術：
啟動子是基因表達調控因子中最重要的因子，基本決定一個基因是否表達、何時表達和何處表達。按作用方式和功能，啟動子大體可以分為組成型啟動子、特異性啟動子和誘導型啟動子三大類。目前，組織特異性啟動子的調控機制己進入深入研究階段，該類啟動子除具有基本結構外，通常還有一些調控特異表達的序列，這些序列為轉錄因子提供了結合位點，通過與蛋白質的相互作用來調節(jié)基因表達。在組織特異性啟動子的驅動下，基因的表達通常只發(fā)生在特定的組織或器官，并往往表現(xiàn)出發(fā)育調節(jié)的特性。根是植物吸收水分和營養(yǎng)物質的重要器官，根特異表達系統(tǒng)可用于研究植物的高滲脅迫耐受、植物修復和根際分泌等。擬南芥的磷酸轉移酶基因啟動子與^依融合， 在農桿菌介導下轉化擬南芥和擬南芥，組織化學分析顯示蛋白只在擬南芥和擬南芥的根毛及根表皮表達，說明該啟動子是根特異的。Borisjuk等用根特異啟動子mas2、GFP和煙草鈣網蛋白基因(calreticulin)構建融合表達載體，轉基因煙草水培研究結果表明，根細胞不僅能高效產生某些目的蛋白質，而且可將目的蛋白質分泌到液體培養(yǎng)基中。水通道蛋白是一種水的分子通道，植物細胞吸水必須要通過水通道蛋白的功能實現(xiàn)。爪蟾卵母細胞中的研究顯示，水通道蛋白ZmPIP2a能夠使爪蟾母卵細胞細胞膜透水性提高至原來的8倍，大大增加了細胞吸水能力。玉米水通道蛋白家族有14個質膜水通道蛋白(plasma membrane intrinsic proteins, PIPs)，其中包含PIPl與PIP2。其中玉米水通道蛋白ZmPIP2_5(即ZmPIP2a)的運輸活性已經得到檢驗其表現(xiàn)出高度水分運輸活性。人工模擬的水分虧缺條件下，ZmPIP2a 基因表達量有增加的趨勢。其表達量的高低有可能與根系吸水能力的強弱以及作物抗旱性的強弱有關。植物的根系在植物抗旱中起著重要的作用，根系吸水力的提升和根系形態(tài)的建成，無疑對提高植物的吸水力，增強其抗旱性具有重要的意義。多數(shù)的植物功能基因如激素合成、代謝相關基因，植物生長、發(fā)育調控基因在植物的地上部分和地下部分均有表達，通過簡單的轉基因或者基因沉默的方式只能從整體上調節(jié)基因在植物體的表達，不能特異性的實現(xiàn)對植物根系功能和發(fā)育的調控。為了解決上述問題，需要利用植物根系特異性表達的啟動子驅動水通道蛋白功能基因的表達，以達到既能提高植物吸水性、增加植物根系長度和數(shù)量，又不影響植物地上部生長、不損害植物營養(yǎng)生長的目的，由此通過轉基因的手段能夠獲得相應的抗旱植株。目前的研究中需要構建一種根特異啟動子驅動水通道蛋白基因表達載體。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供一種根特異啟動子驅動水通道蛋白基因ZMPIP2a表達載體，所述的根特異啟動子驅動水通道蛋白基因ZMPIP2a表達載體的出發(fā)載體為PGreen0229質粒載體， 并包含有水稻根特異性啟動子基因々和水通道蛋白基因Z#/Y/^a。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的
一種根特異啟動子驅動水通道蛋白基因刀^/戶為表達載體，所述的根特異啟動子驅動水通道蛋白基因ZMPIP2a表達載體的出發(fā)載體為PGreen0229質粒載體，所述的根特異啟動子驅動水通道蛋白基因ZMPIP2a表達載體的啟動子是水稻根特異性啟動子基因從所述的水稻根特異性啟動子基因々的下游包含有水通道蛋白基因 ZMPIP2a 。所述的水稻根特異性啟動子基因々的序列為序列表中的SEQ ID No :4 ；所述的水通道蛋白基因刀TZT^a的序列為序列表中的SEQ ID No :5。所述的根特異啟動子驅動水通道蛋白基因ZMPIP2a表達載體的構建方法包括以下步驟
I、UBQI-Nos-35Sbar -PGreen0229 質粒載體構建
A、將基因35Sbar連接到PGreen0229質粒載體，得到35Sbar-PGreen0229質粒載體；
B、將基因Nos連接到所述的35Sbar_PGreen0229質粒載體，得到Nos- 35Sbar -PGreen0229質粒載體；
C、將基因UBQI連接到所述的Nos-35Sbar-PGreen0229質粒載體，得到UBQI-Nos-35Sbar -PGreen0229 質粒載體；
II、EXP18-D"ZMPIP2a-PGM"0229 質粒載體構建；
A、將所述的UBQI-Nos-35Sbar _PGreen0229質粒載體進行酶切反應，切除基因UBQI， 得到 Nos- 35Sbar -PGreen0229 質粒載體 B
B、克隆水稻根特異性啟動子基因E)(P18-D，并連接到PMD18-Tsimple質粒載體，得到 EXP18-D-T質粒載體；
C、用所述的EXP18-D-T質粒載體和Nos-35Sbar _PGreen0229質粒載體B構建 EXP18-D-PGM-0229 質粒載體；
D、克隆水通道蛋白基因ZMPIP2a，并連接到PMD18-Tsimple質粒載體，得到ZMPIP2a_T 質粒載體；
E、用所述的ZMPIP2a-T質粒載體和EXP18-D-PGM-0229質粒載體構建EXP18-D-ZMPIP2a-PGM-0229質粒載體，即為所述的啟動子驅動水通道蛋白基因ZMPIP2ei表達載體。所述的基因35Sbar的序列包含在序列表中的SEQ ID No :1中；所述的基因Nos的序列包含在序列表中的SEQ ID No :2中。圖1為所述的啟動子驅動水通道蛋白基因ZMPIP2a表達載體的簡圖。本發(fā)明的有益效果為
因為本發(fā)明的表達載體采用水稻根特異性啟動子基因i^/^s-iM故為啟動子，驅動水通道蛋白基因ZiTTT^3的表達，所以該表達載體具有特定地改變植物的根部形態(tài)、獲得相應的抗旱植株潛力轉入該啟動子的植株，在同等干旱條件下，存活率比相比對照組的野生型植株高60-70%。


圖ι 本發(fā)明所述的圖1為所述的啟動子驅動水通道蛋白基因ZMPIP2a表達載體的簡
圖2 實施例1中，UBQI-Nos- 35Sbar _PGreen0229質粒載體菌液PCR反應擴增產物電泳圖3 實施例1中，UBQI-Nos- 35Sbar -PGreen0229質粒載體酶切產物電泳圖； 圖4 實施例1中，UBQI-Nos- 35Sbar -PGreen0229質粒載體的圖譜； 圖5 實施例1中，UBQI-Nos- 35Sbar -PGreen0229質粒載體酶切產物電泳圖； 圖6 實施例1中，大片段G連接產物電泳圖7 實施例1中，水稻啟動子基因EXP18-D的PCR反應擴增產物電泳圖
圖8 實施例1中，EXP18-D-T質粒載體菌液PCR反應擴增產物電泳圖9 實施例1中，EXP18-D-T質粒載體酶切產物電泳圖10 實施例1中，Nos- 35Sbar -PGreen0229質粒載體B酶切產物電泳圖11 實施例1中，EXP18-D-PGM-0229質粒載體菌液PCR反應擴增產物電泳圖12 實施例1中，EXP18-D-PGM-0229質粒載體酶切產物電泳圖13 實施例1中，水通道蛋白基因ZMPIP2a的PCR反應擴增產物電泳圖14 實施例1中，ZMPIP2a-T質粒載體菌液PCR反應擴增產物電泳圖15 實施例1中，ZMPIP2a-T質粒載體酶切產物電泳圖16 實施例1中，EXP18-D-PGM-0229質粒載體酶切產物電泳圖17 實施例1中，EXP18-D- ZMPIP2a-PGM-0229質粒載體菌液PCR反應擴增產物電泳
圖18 實施例1中，EXP18-D- ZMPIP2a-PGM-0229質粒載體酶切產物電泳圖； 圖19 實施例1中，培養(yǎng)10天時的各種擬南芥植株根長的對比圖； 圖20 實施例1中，培養(yǎng)20天時的各種擬南芥植株根長的對比圖； 圖21 實施例1中，干旱處理后各種擬南芥植株生長狀態(tài)的對比圖。
具體實施例方式
實施例1
一種根特異啟動子驅動水通道蛋白基因ZMPIP23表達載體，出發(fā)載體為PGreen0229 質粒載體，所述的根特異啟動子驅動水通道蛋白基因ZMPIP2a表達載體的啟動子是水稻根特異性啟動子基因i^WS-々，所述的水稻根特異性啟動子基因々的下游包含有水通道蛋白基因Zi^/Z^a。所述的根特異啟動子驅動水通道蛋白基因ZMPIP2a表達載體的構建方法包括以下步驟
I、UBQI-Nos- 35Sbar -PGreen0229 質粒載體構建
A、將基因35Sbar連接到PGreen0229質粒載體，得到35Sbar- PGreen0229質粒載體； a.將puc57-35Sbar質粒用SacI內切酶進行酶切反應，得到帶有SacI酶切位點的基因 35Sbar ；所述的帶有SacI酶切位點的基因35Sbar的序列為序列表中SEQ ID No :1 ；所述的基因35Sbar由生工生物有限公司合成并連接在puc57質粒上，以puc57-35Sbar質粒的形式購買得到；
所述的酶切反應中，酶切體系為
IOXbuffer 2μ 1 ；SacI :2μ 1，質粒:10μ 1，ddH20 ；6 μ 1 ；于 37°C 反應 3 小時；
b.將PGreen0229質粒載體用SacI內切酶進行酶切反應，得到大小約為4451bp的片段B;
所述的酶切反應中，酶切體系為
IOXbuffer :2μ 1 ；SacI :2μ 1，質粒:10μ 1，ddH20 ；6 μ 1 ；于 37°C反應 3 小時；
c.對上述帶有SacI酶切位點的基因35Sbar、大小約為4451bp的片段B進行回收處理，再進行連接反應，得到35Sbar -PGreen0229質粒載體；
上述連接反應中，連接體系為10Xbuffer :1 μ 1，片段A :7 μ 1，片段B :1 μ 1，
T4DNA連接酶1μ 1 ； 16 °C連接過夜；
B、將基因Nos連接到所述的35Sbar-PGreen0229質粒載體，得到Nos- 35Sbar -PGreen0229質粒載體；
a.將puc57-Nos質粒用HindIII、cspl內切酶進行酶切反應，得到帶有HindII、cspl 酶切位點的基因Nos ；
所述的帶有HindIILcspI酶切位點基因Nos的序列為序列表中SEQ ID No 2 ；所述的基因Nos由生工生物有限公司合成并連接在puc57質粒上，以puc57-NOS質粒的形式購買得到；
所述的酶切反應中，酶切體系為
IOXbuffer 2μ 1 ； Hind III :1 μ 1，cspl :1 μ 1，質粒10 μ 1，ddH20 ;6 μ 1 ；于 37°C反應3小時；
b.將所述的35Sbar-PGreen0229質粒載體用Hind III、cspl內切酶進行酶切反應，得到大小約為5804bp的大片段C和70bp左右的小片段D ；
所述的酶切反應中，酶切體系為
IOXbuffer 2μ 1 ； Hind III :1 μ 1，cspl :1 μ 1，質粒10 μ 1，ddH20 ;6 μ 1 ；于 37°C反應3小時；
c.對大小約為5804bp的大片段C進行回收處理，再與所述的帶有Hindll、cspl酶切位點的基因Nos進行連接反應，得到所述的Nos-35Sbar -PGreen0229質粒載體；
上述連接反應中，連接體系為10Xbuffer :1 μ 1，所述的帶有Hindll、cspl酶切位點的基因Nos 7 μ 1，大片段C :1 μ 1，T4DNA連接酶1 μ 1 ； 16°C連接過夜；
C、將基因UBQI連接到所述的Nos-35Sbar-PGreen0229質粒載體，得到UBQI-Nos-35Sbar -PGreen0229 質粒載體；
a.將puc57-UBQI質粒用HindIII內切酶進行酶切反應，得到帶有HindIII酶切位點的基因UBQI，即大小約為2000bp的片段E ；
所述的酶切反應中，酶切體系為
IOXbuffer 2μ 1 ； Hind III :2 μ 1，質粒10 μ 1，ddH20 ;6 μ 1 ；于 37°C反應 3 小時;
所述的帶有HindIII酶切位點的基因UBQI的序列為序列表中SEQ ID No 3 ；所述的基因UBQI由生工生物有限公司合成并連接在puc57質粒上，以UBQI- puc57質粒的形式購買得到；
b.將所述的35Sbar-PGreen0229質粒載體用HindIII內切酶進行酶切反應，得到大小約為5695bp的大片段F ；
所述的酶切反應中，酶切體系為
IOXbuffer 2μ 1 ； Hind III :2 μ 1，質粒10 μ 1，ddH20 ;6 μ 1 ；于 37°C反應 3 小時;
c.對大小約為5695bp的大片段F進行回收處理，再與所述的帶有HindIII酶切位點的基因UBQI進行連接反應，得到所述的UBQI-Nos- 35Sbar -PGreen0229質粒載體；
d.將所述UBQI-Nos-35Sbar -PGreen0229質粒載體通過熱激法轉化至所述的大腸桿菌E. coli DH5a感受態(tài)細胞中，再進行振蕩培養(yǎng)處理、再進行涂板處理，得到PGM_0229_1 轉化平板；再將所述的UBQI-Nos- 35Sbar _PGreen0229轉化平板中的單菌落進行菌液PCR 反應檢測并制備得到含有UBQI-Nos- 35Sbar -PGreen0229質粒載體的甘油菌，置于_20°C 凍存。具體的操作為
取IOOul的E. coli感受態(tài)細胞置于冰上自然融化；將6μ 1的UBQI-Nos- 35Sbar -PGreen0229質粒載體分別加入感受態(tài)細胞中，輕輕混勻后，冰浴靜置30分鐘。于42°C水浴，90s熱激，再置于冰上放置1 2分鐘；得到轉化后的感受態(tài)細胞；無菌環(huán)境下，向轉化后的感受態(tài)細胞中，加入800 μ 1 LB液體培養(yǎng)基，37°C 150rpm振蕩培養(yǎng)lh，得到振蕩培養(yǎng)物；
取200ul上述振蕩培養(yǎng)物涂布于含有氨芐青霉素(100mg/L)的LB瓊脂平板上；涂布均勻，置于室溫直至液體被完全吸收，得到轉化平板；從上述轉化平板上挑取若干生長狀況良好的單菌落進行菌落PCR驗證，同時將挑取的單菌落于4ml含有Amp (100mg/L)的LB培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，經驗證正確的為陽性克隆菌落培養(yǎng)物，吸取Iml過夜培養(yǎng)物，加入0. 5ml 50%甘油于1. 5ml離心管中，作為含有UBQI-Nos- 35Sbar _PGreen0229質粒載體的甘油菌， 置于-20°C凍存。d.將含有UBQI-Nos- 35Sbar _PGreen0229質粒載體的甘油菌進行復蘇處理、振蕩培養(yǎng)處理，質粒提取處理，得到UBQI-Nos- 35Sbar -PGreen0229質粒載體；
具體的操作為
挑取所述的含有UBQI-Nos- 35Sbar _PGreen0229質粒載體的甘油菌，在含有氨芐青霉素(100mg/L)的LB瓊脂平板上劃線，于37°C過夜培養(yǎng)；再挑取生長狀況良好的單菌落，在含有氨芐青霉素(100mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C搖床培養(yǎng)過夜，得到含有UBQI-Nos-35Sbar _PGreen0229 質粒載體的菌液；再將含有 UBQI-Nos- 35Sbar _PGreen0229 質粒載體的菌液進行質粒提取處理，得到UBQI-Nos- 35Sbar -PGreen0229質粒載體；所述的質粒提取處理采用質粒DNA小量純化試劑盒，型號為DV801A，購自用寶生物工程(大連)有限公司；通過菌液PCR反應和酶切反應驗證所述的raQI-Nos- 35Sbar _PGreen0229質粒載體構建正確 先進行菌液PCR反應，設計引物為
upper CCCTGTTGTTTGGTGTTACT, lower :TGGGTGGGGGTCCATCT ；
欲擴增得到始于基因UBQI起始處的下游1957bp，終于基因35Sbar起始處的下游 370bp,長度為750左右的目的片段；圖2為上述菌液PCR反應檢測產物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖1中，泳道M中為 Takara DL5000 Marker bp，泳道1、2中為擴增產物，亮度最高的條帶為750左右的片段；
將菌液PCR呈陽性的菌液進行質粒提取處理，再采用EcoRI限制性內切酶對該質粒進行酶切反應檢測；
圖3為酶切產物的1 %瓊脂糖凝膠電泳圖；圖3中，泳道M中為Takara DL5000 Marker, 泳道1-2中為酶切產物，條帶由上至下分別為6765bp的片段和942bp的片段； II、EXP18-D" ZMPIP2a-PGM"0229 質粒載體構建
A、將所述的UBQI-Nos-35Sbar _PGreen0229質粒載體進行酶切反應，切除基因UBQI， 得到 Nos- 35Sbar -PGreen0229 質粒載體 B
a.將所述的UBQI-Nos-35Sbar _PGreen0229質粒載體進行酶切反應，切掉基因UBQI， 得到大小為8170bp左右的大片段G和2000bp左右的小片段H ；所述的酶切反應中，使用限制性內切酶Hind III ；
所述的酶切反應中，酶切體系為=IOXbuffer : 2μ 1 ； Hind III :2 μ 1，質粒10 μ 1， ddH20 ；6 μ 1 ；于 37°C反應 3 小時；
圖5為以上酶切反應產物的瓊脂糖凝膠電泳圖； 圖5中，泳道M中為DNA Mark II，泳道1和泳道2中為酶切產物，條帶由上至下分別為大小約為8170bp左右的大片段G和2000bp左右的小片段H ；
b.對上述大小約為8170bp左右的大片段G進行回收處理，再進行連接反應，得到Nos-35Sbar -PGreen0229 質粒載體 B ；
所述的回收處理中，所用試劑盒為寶生物工程(大連)有限公司的DNA凝膠回收試劑盒，型號為DV805A ；
上述連接反應中，連接體系為10 X buffer 1 μ 1，大片段G :8 μ 1， T4DNA連接酶1μ 1 ； 16 °C連接過夜；
圖6為連接產物1 %瓊脂糖凝膠電泳圖；圖6中，泳道M中為Wide Range DNA Marker, 泳道1和泳道2中為連接產物大小為8170bp左右的大片段G ；
B、克隆水稻根特異性啟動子基因^rWS-々，并連接并連接到PMD18-Tsimple質粒載體，得到EXP18-D-T質粒載體
a.從水稻植株中提取水稻基因組DNA，再進行PCR反應，并引入酶切位點Hind III、 Spe I，得到帶有酶切位點Hind III、Spe I的水稻根特異性啟動子基因；所述的水稻植株的品種為日本晴,粳亞種flrj^a sativa ssp. japonica ；
所述的水稻根特異性啟動子基因雙iPAi-i 的序列(未引入Hind IILSpe I酶切位點)為序列表中的SEQ ID No 4 ； 具體的操作為
取生長15天的水稻植株為材料，用CTAB法提取水稻基因組DNA，進行PCR反應，得到帶有酶切位點Hind III、Spe I的水稻啟動子基因EXP18-D ；
所述的 PCR 反應的引物為序列為Upper 5-AAGCTTCAAGGCATGTCAAAGTC-3, Lower 5-ACTAGTGTTCCCCATTTCCTCTTAG-3 ；上述 PCR 反應的體系為5Xbuffer :5μ 1，dNTP :2μ 1，弓 I 物2μ 1，水稻基因組 DNA 1 μ 1，PrimeSTAR 0. 25 μ 1，ddH20 14. 75 μ 1，上述PCR反應的程序為94°C預變性5 min ;98°C變性10 s，50°C退火15 s，72°C延伸2 min，共30個循環(huán)；72°C延伸IOmin ；4°C保存；
圖7為上述PCR反應產物的1 %瓊脂糖凝膠電泳圖；圖7中，泳道M中為DNA Marker III， 泳道1和泳道2中為擴增產物大小約為1957bp的片段；
b.將所述的帶有酶切位點HindIII、Spe I的水稻啟動子基因EXP18-D與PMD18-T simple質粒載體進行連接反應，得到EXP18-D-T質粒載體；
c.將所述的EXP18-D-T質粒載體通過熱激法轉化至所述的大腸桿菌E.coliDH5 α感受態(tài)細胞中，再進行振蕩培養(yǎng)處理、再進行涂板處理，得到EXP18-D-T轉化平板；再將所述的EXP18-D-T轉化平板中的單菌落進行菌液PCR反應檢測，并制備得到含有EXP18-D-T質粒載體的甘油菌，置于_20°C凍存。具體的操作為
取100 μ 1的E. coli DH5a感受態(tài)細胞置于冰上自然融化；將6 μ 1的EXP18-D-T質粒載體分別加入感受態(tài)細胞中，輕輕混勻后，冰浴靜置30分鐘。于42°C水浴，90s熱激，再置于冰上放置1 2分鐘；得到轉化后的感受態(tài)細胞；無菌環(huán)境下，向轉化后的感受態(tài)細胞中， 加入800 μ 1 LB液體培養(yǎng)基，370C 150rpm振蕩培養(yǎng)lh，得到振蕩培養(yǎng)物；取200 μ 1上述振蕩培養(yǎng)物涂布于含有氨芐青霉素(100mg/L)的LB瓊脂平板上；涂布均勻，置于室溫直至液體被完全吸收，得到轉化平板；從上述轉化平板上挑取若干生長狀況良好的單菌落進行菌落PCR驗證，同時將挑取的單菌落于4ml含有Amp (100mg/L)的LB培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，經驗證正確的為陽性克隆菌落培養(yǎng)物，吸取Iml過夜培養(yǎng)物，加入0. 5ml 50%甘油于1. 5ml離心管中，作為含有EXP18-D-T質粒載體的甘油菌，置于_20°C凍存。圖8為上述菌液PCR反應檢測產物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖8中，M泳道為 Marker III，泳道1和泳道2中亮度最高的條帶為大小為1957bp的片段；
d.將所述的含有EXP18-D-T質粒載體的甘油菌進行復蘇處理、振蕩培養(yǎng)處理，質粒提取處理，得到EXP18-D-T質粒載體；
具體的操作為
挑取所述的含有EXP18-D-T質粒載體的甘油菌，在含有氨芐青霉素(100mg/L)的LB 瓊脂平板上劃線，于37°C過夜培養(yǎng)；再挑取生長狀況良好的單菌落，在含有氨芐青霉素 (100mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C搖床培養(yǎng)過夜，得到含有EXP18-D-T質粒載體的菌液；再將含有EXP18-D-T質粒載體的菌液進行質粒提取處理，得到EXP18-D-T質粒載體；所述的質粒提取處理采用質粒DNA小量純化試劑盒，型號為DV801A，購自用寶生物工程(大連)有限公司；
C、用所述的EXP18-D-T質粒載體和Nos- 35Sbar _PGreen0229質粒載體B構建 EXP18-D-PGM-0229 質粒載體
a.將所述的EXP18-D-T質粒載體進行酶切反應，得到大小約為2500bp的大片段I和約為1957bp的小片段J ；所述的酶切反應中，使用限制性內切酶HindIILSpe I ；
所述的酶切反應中，酶切體系為IOXbuffer: 2μ 1 ； Hind III :1 μ 1，Spe I :1μ1， 質粒10μ 1，ddH20 ；6 μ 1 ；于 37°C反應 3 小時；
圖9為以上酶切反應產物的瓊脂糖凝膠電泳圖； 圖9中，泳道M中為DNA Marker III，泳道1中為酶切產物，條帶由上至下分別為大小約為2500bp的大片段I和大小約為1957bp的小片段J ；b.將所述的Nos-35Sbar -PGreen0229質粒載體B載體進行酶切反應，得到大小約為 8040bp的大片段K;所述的酶切反應中，使用限制性內切酶HindIILSpe I ；
所述的酶切反應中，酶切體系為=IOXbuffer : 2μ 1 ； HindIII :1 μ 1，Spe I :1μ1，質粒10 μ 1，ddH20 ；6 μ 1 ；于 37°C反應 3 小時；
圖10為以上酶切反應產物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖10中，泳道M中為Wide Range DNA Marker,泳道1中為酶切產物，條帶為大小約為8040bp的大片段K ；
c.將所述的大小約為8040bp的大片段K與約為1957bp的小片段J進行回收處理，再進行連接反應，得到EXP18-D-PGM-0229質粒載體；
所述的連接反應中，連接體系為10 X buffer 1 μ 1，大片段K 1 μ 1，小片段J :7 μ 1， T4DNA連接酶1μ 1 ； 16 °C連接過夜；
d.將所述的EXP18-D-PGM-0229質粒載體通過熱激法轉化至所述的大腸桿菌E.coli BL21 (DE3)感受態(tài)細胞中，再進行振蕩培養(yǎng)處理、再進行涂板處理，得到EXP18-D-PGM-0229 質粒載體轉化平板；再將所述的EXP18-D-PGM-0229質粒載體轉化平板中的單菌落進行菌液PCR反應檢測，并制備得到含有EXP18-D-PGM-0229質粒載體的甘油菌，置于_20°C凍存。 具體的操作參見步驟B-c。通過菌液PCR反應和酶切反應驗證所述的EXP18-D-PGM-0229質粒載體構建正確
圖11為上述菌液PCR反應檢測產物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖11中，泳道M中為 DNA Marker III，泳道1、2中為擴增產物，亮度最高的條帶為大小約為1957的片段；
上述菌液PCR呈陽性的菌液進行質粒提取處理，再采用Hind III、Spe I限制性內切酶對該質粒進行酶切反應檢測；
圖12為酶切產物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖12中，泳道M中為DNA Marker III，泳道 1、2、3中為擴增產物，最下面的條帶為大小約為1957的小片段J ；
e.將含有EXP18-D-PGM-0229質粒載體的甘油菌進行復蘇處理、振蕩培養(yǎng)處理，質粒提取處理，得到EXP18-D-PGM-0229質粒載體；具體的操作為具體的操作參見步驟B_d。D、克隆水通道蛋白基因ZMPIP2a，并連接到PMD18-T simple質粒載體，得到 ZMPIP2a-T質粒載體
a.從玉米植株中提取玉米基因組DNA，再進行PCR反應，并引入酶切位點Spe I， Not I，得到帶有酶切位點Spe I , Not I的水通道蛋白基因ZMPIP2a ；所述的玉米植株的品種為中農99 ；所述的水通道蛋白基因ZMPIP2a序列(未引入Spe I , Not I酶切位點)的序列為序列表中的SEQ ID No 5 ； 具體的操作為
取生長15天的玉米植株為材料，用CTAB法提取玉米基因組DNA，進行PCR反應，得到帶有酶切位點Spe I ,Not I的水通道蛋白基因ZMPIP2a ； 所述的PCR反應的引物為序列為 Upper 5—ACTAGT GCACAGCAAGTCTCACCAG—3， Lower 5—GCGGCCGC GGCAACCAACGACGACAGG—3 ；
上述PCR反應的體系為5Xbuffer :5μ 1，dNTP :2μ 1，引物2 μ 1，玉米基因組DNA 1 μ 1，PrimeSTAR 0. 25 μ 1, ddH20 14. 75 μ 1，上述PCR反應的程序為94°C預變性5 min;98°C變性10 s，50°C退火15 s，72°C延伸 lmin，共30個循環(huán)；72°C延伸IOmin ；4°C保存；
圖13為上述PCR反應產物的1 %瓊脂糖凝膠電泳圖；圖13中，泳道M中為DNA Marker II，泳道1中為擴增產物，大小約為999bp的片段；
b.將上述帶有酶切位點SpeI ,Not I的水通道蛋白基因ZMPIP2a與PMD18-T simple 質粒載體進行連接反應，得到ZMPIP2a-T質粒載體；
c.將所述的ZMPIP2a_T質粒載體通過熱激法轉化至所述的大腸桿菌E.coliDH5 α感受態(tài)細胞中，再進行振蕩培養(yǎng)處理、再進行涂板處理，得到EXP18-D-T轉化平板；再將所述的ZMPIP2a-T轉化平板中的單菌落進行菌液PCR反應檢測并制備得到含有ZMPIP2a_T質粒載體的甘油菌，置于_20°C凍存。具體的操作為
取IOOul的E. coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞置于冰上自然融化；將6ul的ZMPIP2a_T質粒載體分別加入感受態(tài)細胞中，輕輕混勻后，冰浴靜置30分鐘。于42°C水浴，90s熱激，再置于冰上放置1 2分鐘；得到轉化后的感受態(tài)細胞；無菌環(huán)境下，向轉化后的感受態(tài)細胞中，加入800ul LB液體培養(yǎng)基，370C IOOrpm振蕩培養(yǎng)lh，得到振蕩培養(yǎng)物；
取200ul上述振蕩培養(yǎng)物涂布于含有氨芐青霉素(100mg/L)的LB瓊脂平板上；涂布均勻，置于室溫直至液體被完全吸收，得到轉化平板；從上述轉化平板上挑取若干生長狀況良好的單菌落進行菌落PCR驗證，同時將挑取的單菌落于4ml含有Amp (100mg/L)的LB培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，經驗證正確的為陽性克隆菌落培養(yǎng)物，吸取Iml過夜培養(yǎng)物，加入0. 5ml 50%甘油于1. 5ml離心管中，作為含有ZMPIP2a-T質粒載體的甘油菌，置于_20°C凍存。圖14為上述菌液PCR反應檢測產物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖14中，M泳道為 Marker II，泳道1_3中亮度最高的條帶為大小約為999bp的片段；
d.將含有ZMPIP2a-T質粒載體的甘油菌進行復蘇處理、振蕩培養(yǎng)處理，質粒提取處理， 得到EXP18-D-T質粒載體；
具體的操作為
挑取所述的含有ZMPIP2a-T質粒載體的甘油菌，在含有氨芐青霉素(100mg/L)的LB 瓊脂平板上劃線，于37°C過夜培養(yǎng)；再挑取生長狀況良好的單菌落，在含有氨芐青霉素 (100mg/L)的LB液體培養(yǎng)基中，于37°C搖床培養(yǎng)過夜，得到含有ZMPIP2a_T質粒載體的菌液；再將含有ZMPIP2a-T質粒載體的菌液進行質粒提取處理，得到ZMPIP2a_T質粒載體；所述的質粒提取處理采用質粒DNA小量純化試劑盒，型號為DV801A，購自用寶生物工程(大連)有限公司；
E、用所述的ZMPIP2a-T質粒載體和EXP18-D-PGM-0229質粒載體構建EXP18-D-ZMPIP2a-PGM-0229質粒載體，即為所述的根特異啟動子驅動水通道蛋白基因ZMPIP2a表達載體
a.將所述的ZMPIP2a-T質粒載體進行酶切反應，得到大小約為2500bp的大片段L和約為999bp的小片段M ；所述的酶切反應中，使用限制性內切酶Spe I , Not I ；
所述的酶切反應中，酶切體系為IOXbuffer: 2μ 1 ； Not I :1μ l,Spe I :1μ1，質粒10 μ 1，ddH20 ；6 μ 1 ；于 37°C反應 3 小時；
圖15為以上酶切反應產物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖15中，泳道M中為DNAMarker III，泳道1_2中為酶切產物，條帶由上至下分別為大小約為2500bp的大片段L和約為999bp的小片段Μ;
b.將所述的EXP18-D-PGM-0229質粒載體進行酶切反應，得到大小約為IOOOObp的大片段N;所述的酶切反應中，使用限制性內切酶Spe I ,Not I ；
所述的酶切反應中，酶切體系為=IOXbuffer 2μ 1 ； Not I :1μ 1, Spe I :1μ1，質粒10 μ 1，ddH20 ；6 μ 1 ；于 37°C反應 3 小時；
圖16為以上酶切反應產物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖16中，泳道M中為Wide Range DNA Marker，泳道1_2中為酶切產物，條帶為大小約為IOOOObp的大片段N ；
c.將所述的大小約為999bp的小片段M與大小約為IOOOObp的大片段N進行回收處理，再進行連接反應，得到EXP18-D- ZMPIP2a-PGM-0229質粒載體；
所述的連接反應中，連接體系為10Xbuffer :1 μ 1，大片段N :1 μ 1 :小片段Μ:7μ 1， T4DNA連接酶1μ 1 ； 16 °C連接過夜；
d.將所述的EXP18-D-ZMPIP2a-PGM-0229質粒載體通過熱激法轉化至所述的大腸桿菌E. coli BL2KDE3)感受態(tài)細胞中，再進行振蕩培養(yǎng)處理、再進行涂板處理，得到質粒載體 EXP18-D-ZMPIP2a-PGM-0229 轉化平板；再將所述的 EXP18-D-ZMPIP2a-PGM_0229 質粒載體轉化平板中的單菌落進行菌液PCR反應檢測，并制備得到含有EXP18-D-ZMPIP2a-PGM-0229 質粒載體的甘油菌，置于_20°C凍存。具體的操作參見步驟B-c。通過菌液PCR反應和酶切反應驗證所述的EXP18-D-ZMPIP2a-PGM_0229質粒載體構建正確
圖17為上述菌液PCR反應檢測產物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖17中，泳道M中為 DNA Marker II，泳道1、2中為擴增產物，條帶為大小為999bp左右的片段；
上述菌液PCR呈陽性的菌液進行質粒提取處理，再采用Not I ,Spe I限制性內切酶對該質粒進行酶切反應檢測；
圖18為酶切產物的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖18中，泳道M中為Wide Range DNA Marker，泳道1_4中為酶切產物，條帶由上至下分別為大小約IOOOObp左右的大片段N和約為999bp的小片段Μ;
e.將含有EXP18-D-ZMPIP2a-PGM_0229質粒載體的甘油菌進行復蘇處理、振蕩培養(yǎng)處理，質粒提取處理，得到EXP18-D- ZMPIP2a-PGM-0229質粒載體，即為所述的根特異啟動子驅動水通道蛋白基因ZMPIP2a表達載體；
具體的操作為具體的操作參見步驟B-d。圖1 實施例1中，EXP18-D- ZMPIP2a_PGM_0229質粒載體的簡III、將所述的EXP18-D- ZMPIP2a-PGM-0229質粒載體轉入擬南芥，得到有抗旱性的擬南芥植株。A、通過農桿菌介導的花粉管通道法將所述的EXP18-D- ZMPIP2a-PGM_0229質粒載體轉染擬南芥；
試驗材料擬南芥(Arabidopsis thaliana)為Columbia-O野生型，菌株與質粒大腸桿菌(Esche-richia coli^DH^a 菌株、農桿菌(Agrobacterium turnefaciens)EHA105 (GV3101)菌株；
主要試劑70%消毒酒精、漂白消毒劑(50%家用漂白劑、50 %無菌水、0. 05%Tween-20)、Silwet L-77、蔗糖(試劑級)、葡萄糖(試劑級)、食用蔗糖、甘露醇等；
培養(yǎng)基
LB 培養(yǎng)基 1L:10 g 胰蛋白胨(Tryptone) ；5 g 酵母提取物(Yeast Extract) ；5 g NaCl ；
滲透培養(yǎng)基5% 蔗糖，0. 3%-0. 5% Silwet L-77，PH 5. 7 ； 篩選培養(yǎng)基1 / 2MS ;8 g / L 瓊脂；50 μ g Kan ；pH 5. 8。(a).擬南芥的培養(yǎng)與處理
將春化3 4 d的擬南芥種子播種于用PNS (Plant Nutrition Solution)培養(yǎng)液浸濕的人工土中(腐殖土 蛭石=1 :1)，并用保鮮膜罩上，置于人工培養(yǎng)室中光照培養(yǎng)，1個月后揭膜(培養(yǎng)室條件相對濕度70%，恒溫(23士2) °C，光照強度4 000 lx，光照周期為黑暗 8 h、光照16 h)；待植物培養(yǎng)至初生花序約5 15 cm、次生花序剛剛形成花芽狀時，去除初生花序，有益于次生花序的生長發(fā)育，便于滲透轉化；滲透轉化處理應在去除初生花序3 5 d內完成；并且在滲透轉化的前1 d植物需充分澆水，以便植物氣孔在轉化時充分張開；
(b).菌液的培養(yǎng)將制備好的已轉化了6種EXP18D啟動子缺失體GUS表達載體的農桿菌菌液10mL，在轉化前1 d晚上，轉入大瓶過夜培養(yǎng)；第2天取出使用時農桿菌液0D600 為約2. 0 ；于室溫離心處理(5000rpm，15 min),棄上清液，將農桿菌沉淀懸浮于約3倍體積的滲透培養(yǎng)液中，使0D600在0. 8左右；
(c).農桿菌侵染擬南芥花序將植物的地上部分浸入農桿菌懸浮液中侵染15秒；或用膠頭滴管吸取農桿菌懸浮液一滴一滴對每朵花進行侵染；再用保鮮膜將侵染過的植物 (TO代植物)罩起來以保持濕度，置人培養(yǎng)室中暗培養(yǎng)10 h，然后置于正常培養(yǎng)條件，2 3 d后可去掉保鮮膜；轉化后1周左右方可澆水，并定期繼續(xù)侵染幾次，繼續(xù)培養(yǎng)至植物成熟， 收種子(Tl代)放在干燥環(huán)境中1周左右，即可篩選到轉化子；
(d).擬南芥Tl代種子的篩選將Tl代種子先用70%的酒精浸泡消毒，再用漂白消毒劑溶液處理；消毒后的種子均勻地涂布在篩選培養(yǎng)基表面，于4°C放置2 3 d后，移至人工培養(yǎng)室中培養(yǎng)；然后將確定的轉化子轉入土壤中培養(yǎng)至成熟，收獲種子(T2代種子)；
(e).將上述T2代種子按照(d)中的方法進行篩選、培養(yǎng)，收獲T3代種子；
(f).將上述T3代種子經過兩次篩選得到T3代純合種子，消毒后在MS培養(yǎng)基培養(yǎng)，得到T3代擬南芥轉化體植株；
b.將所述的T3代擬南芥轉化體植株與野生型，及已證明具有抗旱作用的突變體eW 進行比較；
(a).將以上各種種子消毒后，在MS培養(yǎng)基培養(yǎng)10天時，觀察擬南芥植株根長；
圖19為培養(yǎng)10天時的擬南芥植株根長的對比圖；圖19中，通過比較可見，EXP18-D-ZMPIP2a-PGM-0229轉基因植株的根長明顯大于野生型植株。
(b).將以上各種種子消毒后，在蛭石與營養(yǎng)土為2:1的介質中種植30天時，觀察擬南芥植株根長；
圖20為培養(yǎng)30天時的擬南芥植株根長的對比圖；圖20中，通過比較可見， EXP18-D-ZMPIP2a-PGM-0229轉基因植株的根長明顯大于野生型植株。(c).以上各種種子在蛭石與營養(yǎng)土為2 1的介質中種植30天時進行干旱處理，方式為停止?jié)菜?；上述干旱處理進行15天時，觀察各種擬南芥植株表型。圖21為進行干旱處理后的擬南芥植株生長狀態(tài)的對比圖，分為上下兩部分，反映了同一盆野生型擬南芥植株和同一盆EXP18-D- ZMPIP2a-PGM-0229轉基因植株干旱處理之前和干旱處理第15天后的生長狀況；圖21中，通過比較可見，上述干旱處理15天后， EXP18-D- ZMPIP2a-PGM-0229轉基因植株均成活，野生型擬南芥植株均死亡。本實施例中，使用各種限制性內切酶、T4DNA連接酶均購自Takara公司；各種 Marker購自Takara公司；各種PCR反應試劑盒購自Takara公司；DNA純化試劑盒、PMD18-T 質粒載體試劑盒、PGreen0229質粒載體試劑盒均購自Promega公司；DNA凝膠回收試劑盒型號為DV805A，購自寶生物工程(大連)有限公司；CTAB等其他常規(guī)生化試劑和試劑盒購自北京經科宏達生物技術公司和北京欣經科生物技術公司。本實施例中，各種PCR引物合成和DNA測序工作均由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。本實施例中，各種PCR反應使用PTC-100 Peltier Thermal Cycler基因擴增儀， 購自MJ Research Inc公司；所述的瓊脂糖凝膠電泳使用UVP Gel Documentation凝膠分析系統(tǒng)，購自基因公司；所述的瓊脂糖凝膠電泳使用DYCP-31DN電泳儀，購自北京六一儀器公司。本實施例中，采用的DNA提取、PCR、酶切、連接、轉化等基因工程基本操作方法記載于各個試劑盒的說明書中；上述基本操作方法也可以參考《分子克隆實驗指南第三版》中 ((美〕J.薩姆布魯克等著，科學出版社，2002年出版)，和《植物基因工程原理與技術》中(王關林，方宏筠著，科學出版社，1998)。
權利要求
1.一種根特異啟動子驅動水通道蛋白基因ZiTTT^3表達載體，其特征在于所述的根特異啟動子驅動水通道蛋白基因ZMPIP23表達載體的出發(fā)載體為PGreen0229質粒載體， 所述的根特異啟動子驅動水通道蛋白基因ZMPIP2a表達載體的啟動子是水稻根特異性啟動子基因EXP18-D，所述的水稻根特異性啟動子基因i^WS-i 的下游包含有水通道蛋白基齒 ZMPIP2a。
2.根據權利要求1所述的根特異啟動子驅動水通道蛋白基因ZiTTT^3表達載體，其特征在于所述的水稻根特異性啟動子基因擬々的序列為序列表中的SEQ ID No:4。
3.根據權利要求1或2所述的根特異啟動子驅動水通道蛋白基因ZiTTT^3表達載體， 其特征在于所述的水通道蛋白基因ZMY/^a的序列為序列表中的SEQ ID No :5。
4.一種根特異啟動子驅動水通道蛋白基因ZiTTT^3表達載體的構建方法，其特征在于所述的根特異啟動子驅動水通道蛋白基因ZiTTT^3表達載體的出發(fā)載體為 PGreen0229質粒載體，所述的根特異啟動子驅動水通道蛋白基因ZiTTT^3表達載體的啟動子是水稻根特異性啟動子基因AXWS-々，所述的水稻根特異性啟動子基因i^iPM-i 的下游包含有水通道蛋白基因ZMPIP2ei ；所述的根特異啟動子驅動水通道蛋白基因ZMPIP2a表達載體的構建方法包括以下步驟I、UBQI-Nos- 35Sbar -PGreen0229 質粒載體構建A、將基因35Sbar連接到PGreen0229質粒載體，得到35Sbar-PGreen0229質粒載體；B、將基因Nos連接到所述的35Sbar-PGreen0229質粒載體，得到Nos- 35Sbar -PGreen0229質粒載體；C、將基因UBQI連接到所述的Nos-35Sbar-PGreen0229質粒載體，得到UBQI-Nos-35Sbar -PGreen0229 質粒載體；IKEXP18-D- ZMPIP2a-PGM-0229 質粒載體構建；A、將所述的UBQI-Nos-35Sbar _PGreen0229質粒載體進行酶切反應，切除基因UBQI， 得到 Nos- 35Sbar -PGreen0229 質粒載體 B B、克隆水稻根特異性啟動子基因E)(P18-D，并連接到PMD18-Tsimple質粒載體，得到 EXP18-D-T質粒載體；C、用所述的EXP18-D-T質粒載體和Nos-35Sbar _PGreen0229質粒載體B構建 EXP18-D-PGM-0229 質粒載體；D、克隆水通道蛋白基因ZMPIP2a，并連接到PMD18-Tsimple質粒載體，得到ZMPIP2a_T 質粒載體；E、用所述的ZMPIP2a-T質粒載體和EXP18-D-PGM-0229質粒載體構建EXP18-D-ZMPIP2a-PGM-0229質粒載體，即為所述的啟動子驅動水通道蛋白基因ZMPIP2ei表達載體。
5.據權利要求4所述的根特異啟動子驅動水通道蛋白基因ZiTTT^3表達載體的構建方法，其特征在于所述的基因35Sbar的序列包含在序列表中的SEQ ID No :1中。
6.據權利要求4或5所述的根特異啟動子驅動水通道蛋白基因ZiTTT^3表達載體的構建方法，其特征在于所述的基因Nos的序列包含在序列表中的SEQ ID No :2中。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物基因工程領域，特別涉及一種根特異啟動子驅動水通道蛋白基因ZMPIP2a表達載體及構建方法。所述的根特異啟動子驅動水通道蛋白基因ZMPIP2a表達載體的出發(fā)載體為PGreen0229質粒載體，并包含有水稻根特異性啟動子基因EXP18-D和水通道蛋白基因ZMPIP2a。因為本發(fā)明的表達載體采用水稻根特異性啟動子基因EXP18-D做為啟動子，驅動水通道蛋白基因ZMPIP2a的表達，所以該表達載體具有特定地改變植物的根部形態(tài)、獲得相應的抗旱植株潛力轉入該啟動子的植株，在同等干旱條件下，存活率比相比對照組的野生型植株高60-70％。
文檔編號C12N15/66GK102433355SQ20111037312
公開日2012年5月2日 申請日期2011年11月22日 優(yōu)先權日2011年11月22日
發(fā)明者李冰冰, 李自超, 李金杰, 梁莉艷, 賈文鎖, 趙艷俠 申請人:中國農業(yè)大學