專利名稱：一種花粉管介導(dǎo)的玉米原位轉(zhuǎn)基因方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種玉米原位轉(zhuǎn)基因方法。
背景技術(shù)：
基因工程作物品種改良和功能基因組研究需要高效的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)(轉(zhuǎn)化技術(shù))。玉米是我國主要作物，也是世界的主要作物。應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行品種改良已取得許多成果。但現(xiàn)有轉(zhuǎn)化技術(shù)水平還需要改進(jìn)、創(chuàng)新和發(fā)展目前國際上常用的玉米轉(zhuǎn)基因方法主要是基因槍和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法比基因槍法拷貝數(shù)低，具有優(yōu)越性。然而，用這兩個技術(shù)的成功轉(zhuǎn)化須建立在受體稱之為II型胚性愈傷組織基礎(chǔ)之上。但是II型胚性愈傷組織的誘導(dǎo)明顯受到基因型的限制，能誘導(dǎo)較高頻率II型胚性愈傷組織的基因型目前現(xiàn)在世界上雖在A188等少數(shù)材料基礎(chǔ)上有所擴(kuò)展，但大多數(shù)材料還不能誘導(dǎo)出Π型胚性愈傷組織，或誘導(dǎo)率低，容易喪失胚性。另一方面，這種基于組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行的植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化，繼而通過轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生達(dá)到獲得轉(zhuǎn)基因植物的技術(shù)，要得到同一基因背景細(xì)胞形成的轉(zhuǎn)基因個體，必須在單細(xì)胞水平獲得轉(zhuǎn)化，然后通過克隆、分化以至產(chǎn)生植株。然而許多植物在組織培養(yǎng)水平是不容易保持完全的細(xì)胞一致性，也很難產(chǎn)生單細(xì)胞來源的體細(xì)胞克隆及背景一致的轉(zhuǎn)基因植株。以生殖系統(tǒng)的可遺傳單細(xì)胞為受體，是很多研究者正在關(guān)注的方法。高等植物的合子是體內(nèi)個體發(fā)育的第一個細(xì)胞，具有易分裂和形成胚的能力。子房注射法是用微玻針把外源DNA注射到子房或胚珠中，使其在受精前后或合子胚的旺盛分裂期進(jìn)入細(xì)胞，進(jìn)而整合到基因組中。王景雪等(2001)用子房注射方法成功地將幾丁質(zhì)酶基因?qū)氲接衩鬃越幌抵?。但這種方法操作具有盲目性，經(jīng)驗性很強(qiáng)，要一個一個子房操作，好多因素影響轉(zhuǎn)化效率，重復(fù)性差。直接以合子為受體的轉(zhuǎn)化，首先建立在合子的分離和體外培養(yǎng)基礎(chǔ)上，由于分離和培養(yǎng)技術(shù)需要實驗室條件及操作人員技能，這種依賴實驗室條件的合子轉(zhuǎn)化同樣受到限制。劉德璞(2005)發(fā)明了用農(nóng)桿菌侵染活體植株合子的合子原位轉(zhuǎn)化技術(shù)，大大提高了以合子為受體的轉(zhuǎn)基因頻率和成功率。通過轉(zhuǎn)化花粉，然后用轉(zhuǎn)化的花粉給受體植株授粉，得到轉(zhuǎn)基因種子，不同的種子即可以攜帶不同DNA背景，一次轉(zhuǎn)化操作可以得到多個不同的轉(zhuǎn)基因個體，更有優(yōu)越性。以花粉為受體的轉(zhuǎn)化，現(xiàn)使用較多的是，在體外通過各種物理手段向花粉注入外源DNA分子， 如基因槍轟擊花粉，超聲波處理花粉，再用轟擊和處理過的花粉給雌穗授粉。這種方法由于體外處理的影響，結(jié)實率低，轉(zhuǎn)化率也不高。再一種是農(nóng)桿菌浸花技術(shù)(Agrobacterium-mediated floral dipping method)。 最早幾年，在擬南芥、白菜、苜蓿、蘿卜上有成功報道(張廣輝等，1998 ;Cao等，2000 ；Trieu 等，2000 ； Curt is等，2001)，在作物上應(yīng)用的成功事例較少。近幾年，在黑麥和小麥的遺傳轉(zhuǎn)化上的研究結(jié)果證實，這種遺傳轉(zhuǎn)化方法在禾本科麥類作物是可行的。在擬南芥中的研究進(jìn)展，說明農(nóng)桿菌浸染的目的受體是胚珠，證實轉(zhuǎn)化時間發(fā)生在授粉前。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是公開一種由農(nóng)桿菌和花粉管共介導(dǎo)的玉米原位轉(zhuǎn)基因方法，即用農(nóng)桿菌原位侵染已長出的花粉管，實現(xiàn)花粉的遺傳轉(zhuǎn)化，再以轉(zhuǎn)化的花粉繼續(xù)實現(xiàn)自然的受精作用，從而獲得轉(zhuǎn)化子種子。本發(fā)明要解決的技術(shù)方案由以下步驟實現(xiàn)1、種植受體玉米，按正常管理至開花期；2、菌種準(zhǔn)備，平板菌種貯藏于4°C冰箱，每周活化一次，一個月后用YEP液體培養(yǎng)基于21°C培養(yǎng)三天至對數(shù)期，OD600 = 1，離心取出菌體，重懸至侵染培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)密度在 OD600 = 0 . 7-l，23-25°C搖床培養(yǎng)4_5小時，制成感染液，用來侵染；3、轉(zhuǎn)化操作，在20_25°C天氣溫度操作，用剪刀將距離雌穗頂端Icm的花絲剪平， 將感染液注入包葉內(nèi)，滴入量2-4ml，套上紙袋，經(jīng)過1. 5小時后人工授粉，授粉時，為使較多花粉授粉，將花絲分開，然后授粉，隨即套袋再次隔離，管理至結(jié)實成熟；4、收獲及篩選轉(zhuǎn)化子。待玉米成熟后收獲，篩選時，將種子用篩選劑溶液處理，然后播于蛭石介質(zhì)的盤中篩選，或待出苗后涂抹葉片，選出抗性苗，經(jīng)分子檢測獲得陽性株后，移栽至大花盆或直接進(jìn)入田間。本發(fā)明對于以往的技術(shù)，有四方面創(chuàng)新1、受體細(xì)胞的選擇一花粉管。受體是植物轉(zhuǎn)化成功可否的關(guān)鍵。目前玉米的轉(zhuǎn)化國際上通用的基因槍法和農(nóng)桿菌法都是以可產(chǎn)生胚性愈傷組織的1. 2-1. 5mm大小的幼胚做起始受體，或先實施轉(zhuǎn)化后誘導(dǎo)愈傷組織，或先誘導(dǎo)愈傷組織后實施轉(zhuǎn)化，最后誘導(dǎo)分化再生苗。長期在組織培養(yǎng)條件下細(xì)胞容易產(chǎn)生變異而難以保持一致性，這是以體細(xì)胞為受體、通過組織培養(yǎng)實施轉(zhuǎn)化的技術(shù)遇到的問題和困難。脫離組織培養(yǎng)、以單細(xì)胞的生殖細(xì)胞為受體，進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化無疑是可選的有利途徑?；ǚ凼桥渥蛹?xì)胞，是可以產(chǎn)生后代的單細(xì)胞，以它為受體，有其優(yōu)越性。本發(fā)明從受體對象出發(fā)，意義是明確的。所異之處，以往的直接受體是花粉壁包裹的未萌發(fā)花粉細(xì)胞，本發(fā)明是已生長著的花粉管?；ǚ勖劝l(fā)之前，有花粉壁在外保護(hù)著內(nèi)容物，輕微的物理方法不易進(jìn)入其內(nèi)，強(qiáng)而劇烈的力量要破壞它的生活力。然而當(dāng)萌發(fā)后，內(nèi)含遺傳物質(zhì)隨之進(jìn)入花粉管前端。 Franklin. Tong(1999)對花粉管的頂端結(jié)構(gòu)作了概括，認(rèn)為其基本特征是細(xì)胞質(zhì)集中在花粉管的頂端生長區(qū)域，線粒體、高爾基體以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器也包含在這個區(qū)域，在花粉管生長過程中，胼胝質(zhì)塞以規(guī)則的間距產(chǎn)生，將細(xì)胞質(zhì)和花粉管的其余部分隔開，而胼胝質(zhì)塞后面的部分空泡化，因此不論花粉管有多長，細(xì)胞質(zhì)依舊集中于花粉管的前端。很多研究也表明，胼胝質(zhì)位于花粉管細(xì)胞壁的內(nèi)層，它是花粉管壁的主要組成成分，也是花粉管壁有別于其他體細(xì)胞壁的一個明顯特征(Geitmann et al，1995 ;Rae，1985)。在被子植物中，頂端花粉管壁上有胼胝質(zhì)、酯化果膠的沉積，但花粉管極頂端沒有。由于花粉管的極性生長， 頂端實際是一個相對運動著的物質(zhì)區(qū)域，它的相對不穩(wěn)定性是有利于接受外源物質(zhì)如DNA 的，這為以花粉管作為受體，以溫和的手段實施轉(zhuǎn)化提供了細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。2、轉(zhuǎn)化的基本方法一農(nóng)桿菌法。如何以花粉為受體實施轉(zhuǎn)化，一些工作者都是以物理的方法(如基因槍、超聲波)，離體對花粉進(jìn)行轉(zhuǎn)化操作，之后以操作后的花粉人工授粉。這無疑要對離體的花粉做保持生命力的工作，創(chuàng)造有利花粉存活和生長的條件，但這樣的條條件是比較難以確定的，因此也就難免要損傷相當(dāng)數(shù)量的花粉，包括已轉(zhuǎn)化的和未轉(zhuǎn)化的，隨之影響最后的結(jié)實率和轉(zhuǎn)化率。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化是自然的、溫和的生物轉(zhuǎn)化， 在以體細(xì)胞為受體的轉(zhuǎn)化中，由于其拷貝數(shù)少等優(yōu)點，現(xiàn)已成為玉米轉(zhuǎn)化的主流方法。但用來侵染轉(zhuǎn)化花粉卻存在收集、培養(yǎng)方面的困難，同時花粉壁也是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的一大障礙，難以實行。本發(fā)明克服了這一難題，以萌發(fā)生長中的花粉管在通過適合花粉管生長同時也適合農(nóng)桿菌生長并有利其侵染轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)液途徑中，實現(xiàn)花粉的轉(zhuǎn)化。這就是花粉管的原位轉(zhuǎn)化。3、 不用組織培養(yǎng)一原位轉(zhuǎn)化要實現(xiàn)花粉管原位轉(zhuǎn)化，最基本的要明確兩點，并加以解決1)花粉管萌發(fā)生長。在自然條件下，只要溫度濕度適應(yīng)，落在柱頭上的花粉就可以萌發(fā)，無需施加外來營養(yǎng)或激素，我們在考慮培養(yǎng)基時，把此問題擱置在外。但有研究表明， Ca2在花粉管生長過程中起著重要作用，在正常生長的花粉管頂端普遍存在一個極陡的Ca2 濃度梯度(Franklin-Tong et al，1997 ；Pierson et al，1996)，在花粉管生長過程中，花粉管的生長速度受到Ca2的影響(Steer and Steer，1989)。此外，在花粉離體培養(yǎng)中，加入硼 (H3BO3)、錳(MnSO4)對花粉管生長是有利的。我們在培養(yǎng)基的設(shè)計上，考慮了這些因素，滿足了花絲、花粉和農(nóng)桿菌的需要。2)然后迫使花粉管粘附農(nóng)桿菌，并得以轉(zhuǎn)化。這個問題要從注入農(nóng)桿菌的時間、玉米授粉受精的時間上考慮解決。玉米花絲(雌蕊)較長，花粉管從萌發(fā)到抵達(dá)卵細(xì)胞進(jìn)行精卵結(jié)合需21-24小時，在如此長時間內(nèi)，農(nóng)桿菌侵染花粉頂端導(dǎo)致轉(zhuǎn)化大有實現(xiàn)的可能。 最終卵子被轉(zhuǎn)化有兩種可能，一是花粉生殖細(xì)胞接受了 DNA，進(jìn)而，通過生長的花粉管進(jìn)入卵細(xì)胞；另一種可能是，農(nóng)桿菌粘附在花粉管上，花粉管攜帶細(xì)菌到達(dá)胚囊后通過目前還未知的機(jī)制使卵細(xì)胞或合子實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。玉米的花粉落在柱頭上5分鐘即可萌發(fā)(植物學(xué)教科書)，花粉管生長速度達(dá)0. 5cm/h(網(wǎng)絡(luò)信息)，在花粉萌發(fā)1 2h后營養(yǎng)核與生殖核開始向花粉管移動，通常是營養(yǎng)核首先進(jìn)入花粉管，而后生殖細(xì)胞進(jìn)入，并且以較快的速度移向管端(參考文獻(xiàn))。據(jù)此，本發(fā)明先在25°C以下的溫度下，將農(nóng)桿菌侵染液注入雌穗頂端，生長一定時間后，用自花花粉人工授粉，讓花粉管通過感染區(qū)，在行進(jìn)中完成附著和轉(zhuǎn)化行為。根據(jù)試驗觀察的結(jié)果，證實所獲轉(zhuǎn)化種子的下代(如果將當(dāng)代所得種子和種子苗植株按組培轉(zhuǎn)化的TO算，即Tl代)，對潮霉素的抗性與否成1 2 1分離，意味著最大可能是在花粉管生長期間已得到轉(zhuǎn)化，當(dāng)代獲得的種子基因型與常規(guī)雜交一樣是Aa雜合體，因此在下代呈現(xiàn)正常孟德爾分離。4、用花粉的轉(zhuǎn)化最終實現(xiàn)卵細(xì)胞的轉(zhuǎn)化不同于農(nóng)桿菌浸花技術(shù)，在擬南芥中的研究進(jìn)展，說明農(nóng)桿菌浸染的目的受體是胚珠，證實轉(zhuǎn)化時間發(fā)生在授粉前。本方法在花粉管伸長的行進(jìn)中完成了轉(zhuǎn)化，不必再對雌穗做任何處理，按常規(guī)育種方法套袋隔離，一直到秋收收獲種子。將收獲的種子于當(dāng)年冬季即于溫室條件下，在種子萌發(fā)期間，利用篩選基因?qū)?yīng)的篩選劑選出主根長得好的轉(zhuǎn)化子種子，移種至盆中長苗，進(jìn)一步通過報告基因或PCR等手段確定，接著就可以得到轉(zhuǎn)基因玉米下代種子?；蛴谙履甏杭驹诿缙诤Y選，得到初選苗后，直接進(jìn)入田間獲得轉(zhuǎn)基因后代。通過這些步驟，可以獲得較多的轉(zhuǎn)化種子，并且每個種子既是一個獨立轉(zhuǎn)基因個體，大大提高了轉(zhuǎn)化率達(dá)百分之十以上，而 且也使成功率幾乎達(dá)到100%。為基因工程育種和基因組學(xué)研究提供了很實用的技術(shù)。本發(fā)明以簡單的步驟首先獲得較多轉(zhuǎn)化的花粉，再通過自然受精過程獲得較多不同基因背景的轉(zhuǎn)基因個體，不僅提高了轉(zhuǎn)化率和成功率，而且可提高為獲得不同背景的轉(zhuǎn)基因后代的工作效率。這個方法具有低成本、周期短、轉(zhuǎn)化效率高和基因型限制小的優(yōu)點，實用性強(qiáng)，容易操作，一般常規(guī)育種人員即可于田間進(jìn)行轉(zhuǎn)基因。同時，由于不用組織培養(yǎng)，為進(jìn)一步的無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)化建立了基礎(chǔ)系統(tǒng)。
具體實施例方式例1、本發(fā)明由以下步驟實現(xiàn)(1)種植受體玉米，按正常管理至開花期；(2)菌種準(zhǔn)備，平板菌種貯藏于4°C冰箱，每周活化一次，一個月后用YEP液體培養(yǎng)基于21°C培養(yǎng)三天至對數(shù)期，OD600 = 1，離心取出菌體，重懸至侵染培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)密度在 OD600 = 1，25°C搖床培養(yǎng)4小時，制成感染液，用來侵染；(3)轉(zhuǎn)化操作，在23°C天氣溫度操作，用剪刀將距離雌穗頂端Icm的花絲剪平，將感染液注入包葉內(nèi)，滴入量4ml，套上紙袋，經(jīng)過1. 5小時后人工授粉，授粉時，為使較多花粉授粉，將花絲分開，然后授粉，隨即套袋再次隔離，管理至結(jié)實成熟；(4)收獲及篩選轉(zhuǎn)化子。待玉米成熟后收獲，篩選時，將種子用篩選劑溶液處理， 然后播于蛭石介質(zhì)的盤中篩選，或待出苗后涂抹葉片，選出抗性苗，經(jīng)分子檢測獲得陽性株后，移栽至大花盆或直接進(jìn)入田間。例2、本發(fā)明由以下步驟實現(xiàn)(1)種植受體玉米，按正常管理至開花期；(2)菌種準(zhǔn)備，平板菌種貯藏于4°C冰箱，每周活化一次，一個月后用YEP液體培養(yǎng)基于21°C培養(yǎng)三天至對數(shù)期，OD600 = 1，離心取出菌體，重懸至侵染培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)密度在 OD600 = 0 . 7，23°C搖床培養(yǎng)5小時，制成感染液，用來侵染；(3)轉(zhuǎn)化操作，在25°C天氣溫度操作，用剪刀將距離雌穗頂端Icm的花絲剪平，將感染液注入包葉內(nèi)，滴入量2ml，套上紙袋，經(jīng)過1. 5小時后人工授粉，授粉時，為使較多花粉授粉，將花絲分開，然后授粉，隨即套袋再次隔離，管理至結(jié)實成熟；(4)收獲及篩選轉(zhuǎn)化子。待玉米成熟后收獲，篩選時，將種子用篩選劑溶液處理， 然后播于蛭石介質(zhì)的盤中篩選，或待出苗后涂抹葉片，選出抗性苗，經(jīng)分子檢測獲得陽性株后，移栽至大花盆或直接進(jìn)入田間。例 3、本發(fā)明由以下步驟實現(xiàn)(1)種植受體玉米，按正常管理至開花期；(2)菌種準(zhǔn)備，平板菌種貯藏于4°C冰箱，每周活化一次，一個月后用YEP液體培養(yǎng)基于21°C培養(yǎng)三天至對數(shù)期，OD600 = 1，離心取出菌體，重懸至侵染培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)密度在OD600 = 0 . 8，24°C搖床培養(yǎng)4. 5小時，制成感染液，用來侵染；(3)轉(zhuǎn)化操作，在20°C天氣溫度操作，用剪刀將距離雌穗頂端Icm的花絲剪平，將感染液注入包葉內(nèi)，滴入量3ml，套上紙袋，經(jīng)過1. 5小時后人工授粉，授粉時，為使較多花粉授粉，將花絲分開，然后授粉，隨即套袋再次隔離，管理至結(jié)實成熟；(4)收獲及篩選轉(zhuǎn)化子。待玉米成熟后收獲，篩選時，將種子用篩選劑溶液處理， 然后播于蛭石介質(zhì)的盤中篩選，或待出苗后涂抹葉片，選出抗性苗，經(jīng)分子檢測獲得陽性株后，移栽至 大花盆或直接進(jìn)入田間。例4、菌液準(zhǔn)備帶有質(zhì)粒pl301-GFP 的農(nóng)桿菌 EHA105 在附加(50mg/L kanamycin) (forpl301) and 50mg/LRif (for AgrobacteriumEHA105)的YEP培養(yǎng)基中生長克隆，甘油儲藏管保存在-80°C冰柜。于轉(zhuǎn)化之前1月取出劃平板，貯藏于4°C冰箱。每周活化一次，一個月后用時從活化平板劃一菌落，接種于含40ml附加(50mg/L Rif，and 50mg/L kanamycin)的YEP 液體培養(yǎng)基的IOOml三角瓶中，于21°C培養(yǎng)三天成液體菌種，4°C貯藏。用時以感染培養(yǎng)基重懸，在室溫23-25°C大量培養(yǎng)至對數(shù)期，0D600 = 0. 7_1。于23_25°C搖床培養(yǎng)4_5小時， 即用于侵染轉(zhuǎn)化。例5、轉(zhuǎn)化操作受體自交系種植生長至開花受粉期，授粉前注意對雌雄穗做套袋隔離，嚴(yán)防異花受粉。操作當(dāng)天重懸菌體，23°C左右慢搖4-5小時，當(dāng)天13:00-14:00注菌。天氣溫度25°C 以下。用剪刀將距離雌穗頂端Icm外的花絲剪除剪平。將感染液注入包葉內(nèi)花絲，用手輕擠捏迫使感染液沉下，滴入量5ml左右。套好硫酸紙代。人工授粉時先把花須分開，然后授粉，套上紙袋，記好標(biāo)記，看護(hù)至結(jié)實成熟。例6、篩選成熟種子的轉(zhuǎn)基因篩選。將成熟后的種子播種于高8cm、直徑6. 5cm的營養(yǎng)缽中， 當(dāng)幼苗長至三葉期時，以50mg/L濃度的潮霉素涂抹葉片法篩選轉(zhuǎn)化子苗，第1片葉反應(yīng)后， 為進(jìn)一步證實抗感性，在第三片葉又涂抹一次。涂抹后5天就見對照和未轉(zhuǎn)化者變黃，有的從綠色直接萎蔫。對95粒種子做篩選，獲得32株抗性苗。對這32株苗做PCR分析鑒定， 24個陽性，轉(zhuǎn)化率達(dá)25%。例7、GFP基因轉(zhuǎn)化受體鐵7922自交系，供體菌株EHA105，載體pl301，基因GFP(綠色熒光蛋白)，選擇標(biāo)記基因Hpt (潮霉素)。按實例3的方法轉(zhuǎn)化，篩選時，先對種子用潮霉素浸泡處理，然后播種于營養(yǎng)缽內(nèi)萌發(fā)。非轉(zhuǎn)基因的不能發(fā)芽，而轉(zhuǎn)基因的可以正常出苗長大。取1穗中的100粒種子做篩選，獲得16株抗性苗，PCR鑒定13株陽性。轉(zhuǎn)化率13%。將此13株的種子收獲，再次種植下一代，開花期取其雄花(接近散粉期)，在共聚交熒光顯微鏡下觀察， 花粉表現(xiàn)熒光反應(yīng)。所得T2代種子HPT處理的萌發(fā)抗感反應(yīng)呈1 2 1孟德爾分離。T2萌發(fā)篩選種子長根數(shù)行株穗號播種粒數(shù)長根總數(shù)無根總數(shù)最長總數(shù) 19—250401012
注彡3cm的記為最長根，彡0. 5cm的記為無根，彡2cm為中長。
權(quán)利要求
1.一種花粉管介導(dǎo)的玉米原位轉(zhuǎn)基因方法，其特征是采用如下步驟完成(1)種植受體玉米，按正常管理至開花期；(2)菌種準(zhǔn)備，平板菌種貯藏于4°C冰箱，每周活化一次，一個月后用YEP液體培養(yǎng)基于 21°C培養(yǎng)三天至對數(shù)期，OD600 = 1，離心取出菌體，重懸至侵染培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)密度在0D_ = 0. 7-1，23-25°C搖床培養(yǎng)4-5小時，制成感染液，用來侵染；(3)轉(zhuǎn)化操作，在20-25°C天氣溫度操作，用剪刀將距離雌穗頂端Icm的花絲剪平，將感染液注入包葉內(nèi)，滴入量2-4ml，套上紙袋，經(jīng)過1. 5小時后人工授粉；，(4)收獲及篩選轉(zhuǎn)化子。待玉米成熟后收獲，篩選時，將種子用篩選劑溶液處理，然后播于蛭石介質(zhì)的盤中篩選，或待出苗后涂抹葉片，選出抗性苗，經(jīng)分子檢測獲得陽性株后，移栽至大花盆或直接進(jìn)入田間。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的花粉管介導(dǎo)的玉米原位轉(zhuǎn)基因方法，其特征于授粉時，將花絲分開，然后授粉，隨即套袋再次隔離，管理至結(jié)實成熟。
全文摘要
一種花粉管介導(dǎo)的玉米原位轉(zhuǎn)基因方法，屬于農(nóng)業(yè)生物和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域，采用種植受體玉米、菌種準(zhǔn)備、轉(zhuǎn)化操作和收獲及篩選轉(zhuǎn)化子步驟完成，其中轉(zhuǎn)化操作是在20-25℃天氣溫度操作，用剪刀將距離雌穗頂端1cm的花絲剪平，將感染液注入包葉內(nèi)，滴入量2-4ml，套上紙袋，經(jīng)過1.5小時后人工授粉。本發(fā)明方法具有低成本、周期短、轉(zhuǎn)化效率高和基因型限制小的優(yōu)點，同時，由于不用組織培養(yǎng)，為進(jìn)一步的無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)化建立了基礎(chǔ)系統(tǒng)。
文檔編號C12N15/82GK102392044SQ20111037488
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月23日
發(fā)明者劉德璞 申請人:劉德璞