專利名稱：致瀉大腸桿菌四重?zé)晒舛縫cr檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種四重實(shí)時(shí)熒光定量PCR在同一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)檢測胃腸炎腹瀉患者的糞便標(biāo)本中致瀉性大腸桿菌0157 :H7、0104 :H4血清型的核酸檢測方法，可應(yīng)用于致瀉性大腸桿菌引起暴發(fā)疫情的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)急檢測。
背景技術(shù)：
引起腹瀉的大腸桿菌稱為致瀉性大腸桿菌，根據(jù)毒力因子、致病機(jī)理和流行病學(xué)特征，通常將致瀉性大腸桿菌分為5類，分別為腸致病性大腸桿菌(EPEC)、腸產(chǎn)毒性大腸桿菌(ETEC)、腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)、腸集聚性大腸桿菌(EAEC)以及腸出血性大腸桿菌 (EHEC)。EHEC感染后，患者往往會(huì)出現(xiàn)出血性腸炎，表現(xiàn)為腹瀉(血便，鮮血樣)、腹痛和溶血性尿毒綜合征(HUS)。HUS表現(xiàn)為腎功能衰竭、溶血性貧血、血小板減少、血栓性血小板減少紫癜(TTP)，可因腎衰和多臟器受損而死亡，死亡率達(dá)3%-5%，近30%的患者會(huì)留下嚴(yán)重的后遺癥。0157:H7是EHEC的主要血清型，1999年我國蘇皖等地暴發(fā)了大腸桿菌0157:H7 感染性腹瀉，估計(jì)2萬人感染。2011年德國暴發(fā)的疫情是由EHEC 0104 :H4血清型引起，死亡病例M例，其中女性15例。除德國外，奧地利、捷克、丹麥、法國、荷蘭、挪威、西班牙、瑞典、瑞士、英國、盧森堡、美國、加拿大等15個(gè)國家也報(bào)告了輸入性EHEC感染病例，部分發(fā)展為溶血性尿毒綜合征。鑒于致瀉性大腸桿菌在公共衛(wèi)生中的重要性與日俱增，因而在胃腸炎和食物中毒監(jiān)測中要進(jìn)行多種腹瀉細(xì)菌的檢測，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力而且浪費(fèi)臨床標(biāo)本與試劑。常規(guī)檢測以傳統(tǒng)培養(yǎng)方法為主，不僅操作繁瑣、耗時(shí)長、而且容易污染。因此，建立一種能夠快速檢測出致瀉性大腸桿菌的技術(shù)對我國應(yīng)對潛在的致瀉性大腸桿菌疫情具有重要的意義。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展及其在醫(yī)學(xué)研究中的廣泛應(yīng)用，特別是最近幾年興起的熒光定量PCR技術(shù)，該方法具有準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，已廣泛用于基因表達(dá)研究、病原體檢測、SNP分析及基因分型等諸多領(lǐng)域。該方法采用完全閉管檢測，省去了對PCR 產(chǎn)物后處理，避免了交叉污染，結(jié)果判斷由計(jì)算機(jī)完成，簡化了操作步驟，并加強(qiáng)了結(jié)果的可靠性。隨著熒光定量技術(shù)、儀器以及材料科學(xué)的發(fā)展，熒光定量技術(shù)不僅僅在定量上發(fā)揮它的優(yōu)勢，而且運(yùn)用iTaqMan或I1aqMan — MGB探針的5、末端標(biāo)記上不同的熒光染料(FAM、 HEX等)技術(shù)可以進(jìn)行基因分型、基因突變檢測和SNP分析等方面研究。因此，建立關(guān)于 0104 :H4和0157 :H7致瀉性大腸桿菌的多重?zé)晒舛縋CR的快速、準(zhǔn)確、靈敏、特異的基因診斷分子生物學(xué)方法與診斷試劑盒尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種針對致瀉大腸桿菌0157 :H7、0104 :H4四重?zé)晒舛縋CR 檢測試劑盒及檢測方法。該試劑盒由熒光定量PCR反應(yīng)液、0157標(biāo)準(zhǔn)品、H7標(biāo)準(zhǔn)品、0104 標(biāo)準(zhǔn)品、H4標(biāo)準(zhǔn)品、對照品組成，其中熒光定量PCR反應(yīng)液包含有PCR反應(yīng)緩沖液(含氯化鎂和三磷酸脫氧核糖核苷酸混合物、耐熱Taq DNA聚合酶等)、特異性上下游引物和探針，其中特異性上下游引物、特異性探針和基因標(biāo)準(zhǔn)品序列分別如下 0157 上游引物-F: 5，- TGGCATGACGTTATAGGCTACAAT -3， 0157 下游引物-R: 5’ - AGCTTGTTCTAACTGGGCTAATCCT -3， 0157 特異性探針-P: 5’ - FAM-ATAGGATGACAAATATCTGCGCTGCT-BHQ1-3， H7 上游引物-F: 5，-GGCGCAGGCTGCTGATT -3， H7 下游引物-R: 5’ -AGCTTCAAAACGTGATGCGTTAGCTG -3， H7 特異性探針-P: 5，- HEX-CAGATTTACCCACATCAGCATG -BHQ1-3' 0104 上游引物-F: 5，- AGGAGTAAACAATGTCAAAGCAAC -3， 0104 下游引物-R: 5，- AAAATCCTTTAAACTATACGCCC-3，
0104 特異性探針-P 5，- R0X-ACTTGGTTTTTTTGTATTAGCAATAAGTGGTG-BHQ2-3， H4 上游引物-F: 5，- GCTGGGGGTAAACAAGTCAA -3， H4 下游引物-R: 5' - CAGAATCAACGACCGCATATT -3' H4 特異性探針-P 5，- CY5-TGTCTTACACTGACACCGCGTCTAACA-BHQ3 -3， 0157基因標(biāo)準(zhǔn)品
TGGCATGACG TTATAGGCTA CAATTATAGG ATGACAAATA TCTGCGCTGC TATAGGATTA GCCCAGTTAG AACAAGCT H7基因標(biāo)準(zhǔn)品
GGCGCAGGCT GCTGATTCAG CTTCAAAACG TGATGCGTTA GCTGCCACCC TTCATGCTGA TGTGGGTAAA TCTGTT 0104基因標(biāo)準(zhǔn)品
TGTCGCGCAA AGAATTTCAA CTTTACTTGG TTTTTTTGTA TTAGCAATAA GTGGTGTCAT TTCAAGTCAG GTTTCTAGGG CGTATAGTTT AAAGGATTTT H4基因標(biāo)準(zhǔn)品
GCTGGGGGTA AACAAGTCAA TTTACTGTCT TACACTGACA CCGCGTCTAA CAGTACTAAA TATGCGGTCG TTGATTCTG
標(biāo)準(zhǔn)品分陰性對照品和陽性對照品，陰性對照品為高壓滅菌的DEPC (焦碳酸二乙酯)處理水，陽性對照品為0157、H7、0104和H4的陽性質(zhì)粒樣品。本發(fā)明提供的定量試劑盒保存于_20°C，盡量減少反復(fù)凍融。本發(fā)明試劑盒使用方法如下
1.待測樣品核酸提取可按常規(guī)方法進(jìn)行，如采用德國QIAGEN公司的DNA Mini Kit或其它試劑盒，按照試劑盒說明書進(jìn)行提??；
2.核酸的檢測以待測樣品DNA為模板，PCR緩沖液為HR Qpcr Master Mix緩沖液，其終濃度為IX，是指緩沖液各組分在反應(yīng)體系中的終濃度與IXHR Qpcr Master Mix 緩沖液中各組分的濃度相同。通常采用反應(yīng)體系1/2體積的2XHR Qpcr Master Mix緩沖液。IXHR Qpcr Master Mix緩沖液的組成參見上海輝睿生物科技有限公司的HR Qpcr Master Mix, Code :HR-RT01-50o反應(yīng)總體積為50μ ,其中 2X qPCR Master Mix25 μ 四種弓丨物(20 μ mol/L)各 1 μ 四種探針 QO μ mol/L) 1 μ ,模板DNA 2-3 μ DEPC水補(bǔ)足50 μ 。在四色熒光定量PCR儀上進(jìn)行檢測，反應(yīng)參數(shù)為95°C5min熱啟動(dòng)，然后95°C 10s,55°C 45s，在55°C進(jìn)行四重?zé)晒鈾z測，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。3.熒光定量結(jié)果報(bào)告
①致瀉大腸桿菌0157、H7、0104和H4探針各自CT值(threshold cycle,每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))均等于40. 0的標(biāo)本為陰性，②致瀉大腸桿菌0157、H7、0104和H4各探針CT值彡35的標(biāo)本，檢測結(jié)果為相應(yīng)細(xì)菌陽性，則待測樣品含有致瀉大腸桿菌0157、H7、0104和H4型，如其中一個(gè)出現(xiàn)熒光檢測結(jié)果呈陽性，則待檢樣本中含有陽性熒光對應(yīng)的靶細(xì)菌。③CT值在35 40之間為灰值區(qū)域，重做后大于37值為陰性。根據(jù)所獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測標(biāo)本中細(xì)菌量值(拷貝數(shù)/ml)。本發(fā)明的創(chuàng)新之處是運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，采用細(xì)菌特異引物和特異熒光探針，開發(fā)研制用于致瀉大腸桿菌0157 :H7、0104 :H4群細(xì)菌四重?zé)晒舛繖z測試劑盒。 該發(fā)明是通過一個(gè)PCR反應(yīng)，可以從標(biāo)本中檢測出致瀉大腸桿菌0157 :H7、和0104 :H4型細(xì)菌的存在，比傳統(tǒng)的普通PCR和單重?zé)晒舛縋CR方法更簡便、快速和準(zhǔn)確，而且對檢測的細(xì)菌進(jìn)行實(shí)時(shí)準(zhǔn)確定量，為臨床上疑似該菌感染的患者早期明確診斷，以便及時(shí)制定治療方案，減少死亡率。


圖1、熒光PCR法檢測致瀉大腸桿菌0157的靈敏度；從1至5依次為1000000、 100000、10000、1000、IOOcopy。圖2、致瀉大腸桿菌0157標(biāo)準(zhǔn)品熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖3、熒光PCR法檢測致瀉大腸桿菌H7的靈敏度；從1至5依次為1000000、 100000、10000、1000、IOOcopy。圖4、致瀉大腸桿菌H7標(biāo)準(zhǔn)品熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖5、熒光PCR法檢測致瀉大腸桿菌0104的靈敏度；從1至5依次為1000000、 100000、10000、1000、lOOcopy。圖6、致瀉大腸桿菌0104標(biāo)準(zhǔn)品熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖7、熒光PCR法檢測致瀉大腸桿菌H4的靈敏度；從1至5依次為1000000、 100000、10000、1000、lOOcopy。圖8、致瀉大腸桿菌H4標(biāo)準(zhǔn)品熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此。實(shí)施例一
1材料與方法 1. 1菌株與臨床標(biāo)本
致瀉大腸桿菌0157:H7、0104:H4型細(xì)菌(菌株經(jīng)全自動(dòng)生化儀鑒定及日本生研、丹麥血清凝集)購于中國疾病預(yù)防控制中心。臨床樣本來源于近期患者的糞便標(biāo)本，樣本采集后低溫保存并及時(shí)運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。1.2 引物與探針
5從美國的NCBI基因庫上下載了世界各地的致瀉大腸桿菌0157:H7、0104:H4型細(xì)菌基因序列。對其進(jìn)行了同源性比較，在對應(yīng)基因組的保守基因區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物與Taqman探針，序列如下
0157 上游引物-F: 5，- TGGCATGACGTTATAGGCTACAAT -3，
0157 下游引物-R: 5’ - AGCTTGTTCTAACTGGGCTAATCCT -3，
0157 特異性探針-P: 5’ - FAM-ATAGGATGACAAATATCTGCGCTGCT-BHQ1-3，
H7 上游引物-F: 5，-GGCGCAGGCTGCTGATT -3，
H7 下游引物-R: 5’ -AGCTTCAAAACGTGATGCGTTAGCTG -3，
H7 特異性探針-P: 5，- HEX-CAGATTTACCCACATCAGCATG -BHQ1-3'
0104 上游引物-F: 5，- AGGAGTAAACAATGTCAAAGCAAC -3，
0104 下游引物-R: 5，- AAAATCCTTTAAACTATACGCCC-3，
0104 特異性探針-P 5，- R0X-ACTTGGTTTTTTTGTATTAGCAATAAGTGGTG-BHQ2-3，
H4 上游引物-F: 5，- GCTGGGGGTAAACAAGTCAA -3，
H4 下游引物-R: 5' - CAGAATCAACGACCGCATATT -3'
H4 特異性探針-P 5，- CY5-TGTCTTACACTGACACCGCGTCTAACABHQ3 -3，
弓丨物和探針委托上海輝睿生物科技有限公司合成。1.3細(xì)菌定量標(biāo)準(zhǔn)與細(xì)菌DNA的提取
細(xì)菌DNA的提取采用德國QIAGEN公司的QIAamp DNA Mini Kit，按試劑盒說明書提取， 得到細(xì)菌DNA，利用NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer 在^Onm測量細(xì)菌DNA的濃度， 從而確定DNA的拷貝數(shù)以備用。1. 4熒光RT-PCR反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化
試劑盒選用上海輝睿生物科技有限公司的HR Qpcr Master Mix, Code =HR-RTO 1-50, 按說明書操作，反應(yīng)體系為50 μ ，其中2XHR Qpcr Master Mix 25ul，上游與下游引物 (20ymol/L)各 1 μ ，探針(20ymol/L) 1 μ ，模板 DNA 2-3 μ ，DEPC 水補(bǔ)足 50 μ 。反應(yīng)條件為95°C 5min，然后95°C 10s,55°C 40s，在55°C進(jìn)行四重?zé)晒鈾z測，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。結(jié)果判斷選擇熒光檢測模式FAM、HEX、ROX、CY5，熒光基線調(diào)整取3_15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)平均值，閾值設(shè)定以閾值線剛好超過正常陰性對照品的最高點(diǎn)，樣本呈典型的擴(kuò)增曲線，判斷為陽性。無典型的擴(kuò)增曲線，判斷為陰性。體系的優(yōu)化試驗(yàn)，在以相同濃度陽性核酸為模板的反應(yīng)體系中，引物濃度從0. 10 1.00 μ M，探針濃度從0. 10 0. 50 μ Μ，采用矩陣法優(yōu)選引物和探針的最佳濃度，根據(jù)最低Ct值和最高熒光強(qiáng)度增加值(ΔΙ^η)選擇最佳引物和探針濃度。1.5熒光PCR特異性、敏感性和重復(fù)性試驗(yàn)
選擇致瀉大腸桿菌0157: Η7和0104: Η4型細(xì)菌，提取核酸，用0157、Η7、0104和Η4多重?zé)晒釶CR方法進(jìn)行檢測，驗(yàn)證方法的特異性；對已標(biāo)定拷貝數(shù)的0157:H7(2X IO7Copies/ ml)和0104:H4型(2X 107Copies/ml)大腸桿菌梯度稀釋后，平行進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)，比較其靈敏度。此外，對每一個(gè)濃度的細(xì)菌DNA稀釋液作4次重復(fù)檢測，得到的Ct值計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差，驗(yàn)證方法的重復(fù)性。2 結(jié)果
2. 1熒光PCR反應(yīng)體系及條件選用上海輝睿生物科技有限公司的HR Qpcr Master Mix, Code :HR-RT01-50，按說明書操作，反應(yīng)體系為50 μ ，其中2XHR Qpcr Master Mix 25 ul，四種引物(20ymol/L)各 μ ，四種探針(20ymol/L) 1 μ ,模板DNA 2-3 μ ，DEPC水補(bǔ)足50 μ 。在四色熒光定量 PCR儀上進(jìn)行檢測，反應(yīng)參數(shù)為95°C 5min熱啟動(dòng)，然后95°C 10s,55°C 45s，在55°C進(jìn)行四重?zé)晒鈾z測，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。2. 2特異性試驗(yàn)
本發(fā)明建立的多重?zé)晒釶CR方法對致瀉性大腸桿菌0157 H7和0104 H4型具有較好的特異性，近期采集的腹瀉患者的糞便標(biāo)本也檢測出陽性反應(yīng)。而與其他腸道細(xì)菌如其它血清型大腸桿菌、陰溝腸桿菌、空腸彎曲菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、嗜水氣單胞菌、類志賀鄰單胞菌、副溶血弧菌、河流弧菌等均無交叉反應(yīng)。2.3敏感性試驗(yàn)
對已標(biāo)定拷貝數(shù)的致瀉性大腸桿菌0157:H7 (lX107Copies/ml)和0104:H4 (1 X 107Copies/ml)核酸分別稀釋10、100、1000、10000、100000倍，用熒光PCR方法進(jìn)行檢測，結(jié)果熒光PCR方法檢測敏感性分別達(dá)到1 X 100、1 X 100、1 X 100和1 X 100 Copies/ml。 結(jié)果參見圖1-8。2. 4 重復(fù)性試驗(yàn)
致瀉性大腸桿菌 0157:H7 (終濃度為 lXl(fCopies/ml)和 0104:H4 (1 X 107Copies/ml) 混合后按10倍梯度稀釋成5個(gè)不同的濃度，對每一個(gè)濃度的樣本作4個(gè)重復(fù)檢測，結(jié)果不同核酸濃度各自的檢測Ct值標(biāo)準(zhǔn)差在0. 10 0. 35之間，具有較好的重復(fù)性(參見表1)。
權(quán)利要求
1.一種致瀉大腸桿菌四重?zé)晒舛縋CR檢測試劑盒，由熒光定量PCR反應(yīng)液、0157標(biāo)準(zhǔn)品、H7標(biāo)準(zhǔn)品、0104標(biāo)準(zhǔn)品、H4標(biāo)準(zhǔn)品、對照品組成，其中熒光定量PCR反應(yīng)液包含PCR 反應(yīng)緩沖液、特異性上下游引物和特異性探針，其中PCR反應(yīng)緩沖液含氯化鎂和三磷酸脫氧核糖核苷酸混合物、耐熱Taq DNA聚合酶，特異性上下游引物、特異性探針和標(biāo)準(zhǔn)品的序列分別如下0157 上游引物-F: 5，- TGGCATGACGTTATAGGCTACAAT -3，0157 下游引物-R: 5’ - AGCTTGTTCTAACTGGGCTAATCCT -3，0157 特異性探針-P: 5’- FAM-ATAGGATGACAAATATCTGCGCTGCT-BHQ1-3，H7 上游引物-F: 5，-GGCGCAGGCTGCTGATT -3，H7 下游引物-R: 5’-AGCTTCAAAACGTGATGCGTTAGCTG -3，H7 特異性探針-P: 5，- HEX-CAGATTTACCCACATCAGCATG -BHQ1-3'0104 上游引物-F: 5，- AGGAGTAAACAATGTCAAAGCAAC -3，0104 下游引物-R: 5，- AAAATCCTTTAAACTATACGCCC-3，0104 特異性探針-P 5，- R0X-ACTTGGTTTTTTTGTATTAGCAATAAGTGGTG-BHQ2-3， H4 上游引物-F: 5，- GCTGGGGGTAAACAAGTCAA -3， H4 下游引物-R: 5' - CAGAATCAACGACCGCATATT -3' H4 特異性探針-P 5，- CY5-TGTCTTACACTGACACCGCGTCTAACA-BHQ3 -3， 0157基因標(biāo)準(zhǔn)品TGGCATGACG TTATAGGCTA CAATTATAGG ATGACAAATA TCTGCGCTGC TATAGGATTA GCCCAGTTAG AACAAGCT H7基因標(biāo)準(zhǔn)品GGCGCAGGCT GCTGATTCAG CTTCAAAACG TGATGCGTTA GCTGCCACCC TTCATGCTGA TGTGGGTAAA TCTGTT 0104基因標(biāo)準(zhǔn)品TGTCGCGCAA AGAATTTCAA CTTTACTTGG TTTTTTTGTA TTAGCAATAA GTGGTGTCAT TTCAAGTCAG GTTTCTAGGG CGTATAGTTT AAAGGATTTT H4基因標(biāo)準(zhǔn)品GCTGGGGGTA AACAAGTCAA TTTACTGTCT TACACTGACA CCGCGTCTAA CAGTACTAAA TATGCGGTCG TTGATTCTG。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種致瀉大腸桿菌四重?zé)晒舛縋CR檢測試劑盒，其特征在于，對照品分陰性對照和陽性對照，陰性對照為高壓滅菌的焦碳酸二乙酯處理水，陽性對照為0157、H7、0104和H4的陽性質(zhì)粒樣品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種致瀉大腸桿菌四重?zé)晒舛縋CR檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒保存于-20°C，盡量減少反復(fù)凍融。
全文摘要
本發(fā)明提供一種致瀉大腸桿菌四重?zé)晒舛縋CR檢測試劑盒，由熒光定量PCR反應(yīng)液、O157標(biāo)準(zhǔn)品、H7標(biāo)準(zhǔn)品、O104標(biāo)準(zhǔn)品、H4標(biāo)準(zhǔn)品、對照品組成，其中熒光定量PCR反應(yīng)液包含PCR反應(yīng)緩沖液(含氯化鎂和三磷酸脫氧核糖核苷酸混合物、耐熱TaqDNA聚合酶等)、特異性上下游引物和探針。本發(fā)明通過一個(gè)PCR反應(yīng)，可以從標(biāo)本中檢測出致瀉大腸桿菌O157H7、和O104H4型細(xì)菌的存在，比傳統(tǒng)的普通PCR和單重?zé)晒舛縋CR方法更簡便、快速和準(zhǔn)確，而且對檢測的細(xì)菌進(jìn)行實(shí)時(shí)準(zhǔn)確定量，為臨床上疑似該菌感染的患者早期明確診斷，以便及時(shí)制定治療方案，減少死亡率。
文檔編號(hào)C12Q1/06GK102399884SQ201110376158
公開日2012年4月4日 申請日期2011年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月23日
發(fā)明者孔海深, 鄭書發(fā), 陳曉, 陳瑜 申請人:浙江大學(xué)