專利名稱：一種產(chǎn)2-MIB藍(lán)藻的PCR定性和TaqMan熒光定量PCR定量的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水環(huán)境監(jiān)測、水生態(tài)學(xué)、微生物有害代謝物等領(lǐng)域，更具體涉及一種采用PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))和熒光定量PCR對環(huán)境中的產(chǎn)2-MIB藍(lán)藻進(jìn)行檢測的方法，適用于對水庫、湖泊和河流等飲用水源地及水生態(tài)系統(tǒng)中的藻源性2-MIB進(jìn)行預(yù)警和快速定
性、定量。
背景技術(shù)：
近年來，隨著水體富營養(yǎng)化的日益加重，藍(lán)藻水華在全球尤其是我國大面積爆發(fā)。水華問題已經(jīng)成為我國環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域所面臨的重大問題。藍(lán)藻水華的危害表現(xiàn)在很多方面，其中對人類健康和飲用水有直接威脅的藻毒素問題已經(jīng)受到了極大的關(guān)注。除各種藻毒素外，很多藍(lán)藻種類還分泌具有異味的揮發(fā)性次生代謝產(chǎn)物，使水體和水產(chǎn)品產(chǎn)生令人反感的嗅味。水體異味問題不僅大大降低了飲用水的水質(zhì)，還對漁業(yè)、生態(tài)景觀和旅游業(yè)等造成了巨大的損失。由藍(lán)藻所引起的藻源性異味次級代謝產(chǎn)物和藻毒素一起已經(jīng)成為全球普遍存在的嚴(yán)重的環(huán)境問題。近年來，隨著對異味問題的重視，已經(jīng)有越來越多的水體異味問題的報道，其中對社會經(jīng)濟造成極大影響的當(dāng)屬2007年太湖飲用水危機。具土霉味的萜類化合物2-MIBQ-甲基異茨醇)被認(rèn)為是引起各種淡水水體異味問題的主要原因之一。作為富營養(yǎng)化水體中重要的生物類群，藍(lán)藻通常被認(rèn)為是2-MIB合成和釋放的主要生物類群。通過傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察等方法一般并不能有效地區(qū)分藍(lán)藻是否產(chǎn)2-MIB。申請者最近的研究成果表明，在藍(lán)藻中2-MIB是由一個基因簇(含有一個甲基化酶基因和一個單萜環(huán)化酶基因)調(diào)控合成而來，只有具有此基因簇的藍(lán)藻藻株才能夠產(chǎn)生2-MIB。目前，多種基于基因的產(chǎn)毒藍(lán)藻的分子檢測方法已經(jīng)建立，而關(guān)于產(chǎn)2-MIB藍(lán)藻的分子檢測方法尚未有報道。由于具有簡便、快捷、高靈敏度等優(yōu)勢，基于PCR的分子方法對產(chǎn)2-MIB藍(lán)藻的鑒定具有獨特的優(yōu)勢。傳統(tǒng)的水環(huán)境中2-MIB濃度的檢測主要基于氣象色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的化學(xué)分析技術(shù)，這類技術(shù)雖然能準(zhǔn)確定量濃度，但是其缺點在于相對繁瑣、昂貴，并且具有一定的檢測限。在水體中2-MIB的主要濃度主要由具2-MIB合成能力的藍(lán)藻的生物量決定。從分子生物學(xué)的角度來看，水體中2-MIB合成基因的拷貝數(shù)在一定程度上最終決定了 2-MIB的濃度。普通的PCR檢測技術(shù)可以定性檢測藍(lán)藻是否產(chǎn)2-MIB和環(huán)境中是否有產(chǎn)2-MIB藍(lán)藻，不能定量檢測水體中產(chǎn)2-MIB藍(lán)藻的濃度。因此，開發(fā)一種基于2-MIB合成基因-單萜環(huán)化酶基因-的定性PCR和基于分子探針(TaqMan)的實時熒光定量PCR檢測技術(shù)快速、高靈敏度的定性和定量環(huán)境中產(chǎn)2-MIB藍(lán)藻的濃度對水質(zhì)監(jiān)測和預(yù)警具有非常重要的現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有的水體異味監(jiān)測需求，是在于提供了一種產(chǎn)2-MIB藍(lán)藻的PCR定性和TaqMan熒光定量PCR定量的檢測方法，方法易行，操作簡便，TaqManqRT-PCR具有很高的靈敏度和準(zhǔn)確度，可以快速、準(zhǔn)確的定量水樣中產(chǎn)2-MIB藍(lán)藻的濃度，能夠?qū)Νh(huán)境中或純培養(yǎng)的產(chǎn)2-MIB藍(lán)藻定性和定量，可用于對各類富營養(yǎng)化淡水水體中具2-MIB產(chǎn)生能力的藍(lán)藻進(jìn)行快速定量。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施采集環(huán)境樣本(水樣)并提取基因組DNA，采用分子信標(biāo)熒光定量PCRCTaqManqRT-PCR)的方法對2-MIB合成相關(guān)單萜環(huán)化酶基因片段進(jìn)行定量檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和待測樣本的Ct值計算單位體積樣本中單萜環(huán)化酶基因的拷貝數(shù)和產(chǎn)2-MIB藍(lán)藻的濃度。一種產(chǎn)2-MIB藍(lán)藻的PCR定性和TaqMan熒光定量PCR定量的檢測方法，其步驟如下1、采集一定體積(300_1000ml)的待測水樣，經(jīng)0. 45 μ m的醋酸纖維素膜過濾，將過濾到的藻進(jìn)行總基因組DNA的提取和純化。將提取到的DNA溶于一定體積(30-50 μ 1)的無菌雙蒸水中，置-20°C保存。2、定性PCR的反應(yīng)體系為2XPCR反應(yīng)體系(Mix) 10 μ 1，特異性擴增2-ΜΙΒ合成相關(guān)單萜環(huán)化酶基因的正反引物各ι μ 1，待檢測的DNA 1 μ 1，以雙蒸水校正至20 μ 1體積。所用引物為CITf(5-CAGCACGACAGCTTCTACACCT-3)，CITr(5-GCCGCAATCTGTAGCACCAT-3)。以產(chǎn)2-MIB藍(lán)藻DNA為陽性對照，雙蒸水為陰性對照。3、定性PCR的反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性:3min，接著40個循環(huán)，每個循環(huán)94°C 30s、58°C 30s和72°C 30s，循環(huán)過后最后72°C延伸5min。4、定性PCR產(chǎn)物和陽性對照、陰性對照一起進(jìn)行2% (w/w)瓊脂糖凝膠電泳，電泳過后溴化乙錠(EB)染色，紫外燈下觀測。目標(biāo)條帶長度為206bp。5、熒光定量PCR的反應(yīng)體系反應(yīng)體系20 μ 1，含Taqman reaction Mix 10 μ 1，Taqman ProbeO. 4 μ 1 (Ctaq :5-CAGCACGACAGCTTCTACACCTCC_3，5 端 FAM 修飾，3 端 TAMRA修飾)，特異性正反向引物各 5pmol (CRTf 5-CTGTTACGCCACCTTCTYTATGT-3, CRTr 5-ACSGAAAGGAGATCGTTGACC-3，目標(biāo)產(chǎn)物大小為87bp)，待測樣品總DNA 1 μ 1，用雙蒸水補足反應(yīng)體系。陰性模板對照加無菌雙蒸水。6、熒光定量PCR的反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性5min，接著40個循環(huán)，每個循環(huán)包括940C 30s,560C 30s和72°C 30s，每個循環(huán)完成后進(jìn)行一次熒光檢測。反應(yīng)完成后記錄各個樣品的Ct值。7、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取已知濃度的產(chǎn)2-MIB假魚腥藻做為標(biāo)準(zhǔn)藻株，提取其基因組總DNA，10倍梯度稀釋做為標(biāo)準(zhǔn)模板(IO8-IO3拷貝/μ 1)。依照上述熒光定量PCR的體系(步驟5)和程序(步驟6)與待測樣品同時進(jìn)行定量PCR擴增。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)各個濃度梯度的Ct值和濃度值繪制熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。8、根據(jù)待測樣品的Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品2-ΜΙΒ基因的拷貝數(shù)，進(jìn)而推算原水樣中產(chǎn)2-ΜΙΒ藍(lán)藻的濃度。上訴所涉及到的引物全部為本發(fā)明所設(shè)計，并在^witrogen (上海)公司合成，經(jīng)PAGE純化得到。引物使用濃度為lOnmol/ml。本發(fā)明的方法相較于傳統(tǒng)方法具有顯著的優(yōu)點和效果傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察等方法并不能有效區(qū)分樣品中有沒有產(chǎn)2-MIB藍(lán)藻，需要將樣品中的各個藍(lán)藻分離純培養(yǎng)出來才能測定，步驟繁瑣、耗時。應(yīng)用本發(fā)明的定性方法可以快速確定樣品中有無產(chǎn)2-MIB種類。TaqMan qRT_PCR具有很高的靈敏度和準(zhǔn)確度，可以快速、準(zhǔn)確的定量水樣中產(chǎn)2-MIB藍(lán)藻的濃度?？捎捎诰哂袠O高的靈敏度，在傳統(tǒng)的分析方法尚不能檢測到水樣中的2-MIB時，本方法即可檢測、定量出2-MIB藍(lán)藻，因此在水質(zhì)預(yù)警系統(tǒng)中具有很高的應(yīng)用價值。本發(fā)明的方法重復(fù)性好，對樣品的定性和定量分別在3小時和12小時之內(nèi)就可完成，而且一次可以處理大量樣品。


圖1為一種產(chǎn)2-MIB藍(lán)藻TaqMan熒光定量PCR定量的檢測方法獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。如標(biāo)曲圖所示，本發(fā)明所用引物擴增效率高(E = 98.9% )，所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好(R2 = 0. 998)。
具體實施例方式實施例1 一種產(chǎn)2-MIB藍(lán)藻的PCR定性和TaqMan熒光定量PCR定量的檢測方法，其步驟是1、樣品采集和DNA提取采集2010年7、9月份陸水水庫(湖北赤壁)水樣進(jìn)行產(chǎn)2-MIB藍(lán)藻的定量，采樣點為6個。將300mL水樣經(jīng)0. 45 μ m醋酸纖維素膜過濾，對濾膜進(jìn)行總DNA的提取和純化.2、定性 PCR:采用引物CITf和CITr對每個樣點進(jìn)行產(chǎn)2-MIB藍(lán)藻的定性分析，反應(yīng)體系和程序為2 XPCR反應(yīng)體系(Mix)IOy 1，CITf和CITr各1 μ 1，待檢測的DNA 1μ 1，以雙蒸水校正至20 μ 1體積；94°C預(yù)變性3min，接著40個循環(huán)，每個循環(huán)94°C 30s,58 °C 30s和72°C 30s，循環(huán)過后最后72°C延伸5min。定性PCR的結(jié)果顯示在所有的樣品中均能檢測到2-MIB合成基因的存在，預(yù)示著這些樣點全部存在著產(chǎn)2-MIB藍(lán)藻。3、熒光定量PCR:采用TaqMan分子探針法對樣品中的2-MIB基因數(shù)量進(jìn)行定量反應(yīng)體系20 μ 1，含 Taqmanreaction Mix 10 μ 1, Taqman Probe 0. 4 μ 1 (Ctaq),特異個生正反向弓I 物各5pmol(CRTf,CRTr) ；94°C預(yù)變性5min，接著40個循環(huán)，每個循環(huán)包括94°C 30s,56°C 30s和72°C 30s，每個循環(huán)完成后進(jìn)行一次熒光檢測。4、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取已知濃度的產(chǎn)2-MIB假魚腥藻做為標(biāo)準(zhǔn)藻株，提取其基因組總DNA，10倍梯度稀釋做為標(biāo)準(zhǔn)模板(IO8-IO3拷貝/ μ 1)。依照上述步驟2熒光定量PCR的體系和程序與待測樣品同時進(jìn)行定量PCR擴增。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)各個濃度梯度的Ct值和濃度值繪制熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。5、樣品中2-ΜΙΒ濃度的計算本次實驗的標(biāo)準(zhǔn)曲線的計算公式為
拷貝數(shù)=5. OX 10χ, χ = 12e-°'667Ct Ct值為實驗所得到的值。將熒光定量中各個樣品的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式中即可得出原始樣品中2-MIB基因的準(zhǔn)確的拷貝數(shù)。陸水水庫2010年7月、9月各個樣點的2-MIB基因拷貝數(shù)如下
權(quán)利要求
1. 一種產(chǎn)2-MIB藍(lán)藻的PCR定性和TaqMan熒光定量PCR定量的檢測方法，其步驟是A、采集待測水樣，經(jīng)0.45 μ m的醋酸纖維素膜過濾，將過濾到的藻進(jìn)行總基因組DNA的提取和純化，將提取到的DNA溶于無菌雙蒸水中，置_20°C保存；B、定性PCR的反應(yīng)體系為2XPCR反應(yīng)體系10μ 1，特異性擴增2-ΜΙΒ合成相關(guān)單萜環(huán)化酶基因的正反引物各1 μ 1，待檢測的DNA 1 μ 1，以雙蒸水校正至20 μ 1體積，所用引物為CITf5-CAGCACGACAGCTTCTACACCT-3，CITr 5-GCCGCAATCTGTAGCACCAT-3，以產(chǎn) 2-MIB 藍(lán)藻DNA為陽性對照，雙蒸水為陰性對照；C、定性PCR的反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性3min，接著40個循環(huán)，每個循環(huán)94°C 30s、58°C 30s和72°C 30s，循環(huán)過后最后72°C延伸5min ；D、定性PCR產(chǎn)物和陽性對照、陰性對照一起進(jìn)行2%w/w瓊脂糖凝膠電泳，電泳過后溴化乙錠染色，紫外燈下觀測，目標(biāo)條帶長度為206bp ；E、熒光定量PCR的反應(yīng)體系反應(yīng)體系20μ1，含Taqmanreaction Mix 10μ 1,Taqman Probe 0· 4 μ ICtaq :5-CAGCACGACAGCTTCTACACCTCC_3，5 端 FAM 修飾，3 端TAMRA 修飾，特異性正反向引物各 5pmol CRTf 5-CTGTTACGCCACCTTCTYTATGT-3, CRTr 5-ACSGAAAGGAGATCGTTGACC-3，目標(biāo)產(chǎn)物大小為87bp，待測樣品總DNA 1 μ 1，用雙蒸水補足反應(yīng)體系，陰性模板對照加無菌雙蒸水；F、熒光定量PCR的反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性5min，接著40個循環(huán)，每個循環(huán)包括94°C 30s、56°C 30s和72°C 30s，每個循環(huán)完成后進(jìn)行一次熒光檢測，反應(yīng)完成后記錄各個樣品的Ct值；G、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取已知濃度的產(chǎn)2-MIB假魚腥藻做為標(biāo)準(zhǔn)藻株，提取其基因組總DNA，10倍梯度稀釋做為標(biāo)準(zhǔn)模板108-103拷貝/μ 1，依照上述熒光定量PCR的體系步驟5和步驟6與待測樣品同時進(jìn)行定量PCR擴增，反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)各個濃度梯度的Ct值和濃度值繪制熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線；H、根據(jù)待測樣品的Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品2-ΜΙΒ基因的拷貝數(shù)，進(jìn)而推算原水樣中產(chǎn)2-ΜΙΒ藍(lán)藻的濃度。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種產(chǎn)2-MIB藍(lán)藻的PCR定性和TaqMan熒光定量PCR定量的檢測方法，其步驟A、采集待測水樣，經(jīng)醋酸纖維素膜過濾，將過濾到的藻進(jìn)行總基因組DNA的提取和純化；B、定性PCR的反應(yīng)體系為合成相關(guān)單萜環(huán)化酶基因，以產(chǎn)2-MIB藍(lán)藻DNA為陽性對照，雙蒸水為陰性對照；C、定性PCR的反應(yīng)程序為94°C預(yù)變性3min，接著循環(huán)，循環(huán)過后最后延伸；D、定性PCR產(chǎn)物和陽性對照、陰性對照；E、熒光定量PCR的反應(yīng)體系，陰性模板對照加無菌雙蒸水；F、熒光定量PCR的反應(yīng)程序；G、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作；H、根據(jù)待測樣品的Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線計算原水樣中產(chǎn)2-MIB藍(lán)藻的濃度。方法易行，操作簡便，具有很高的靈敏度和準(zhǔn)確度，可以快速、準(zhǔn)確的定量水樣中產(chǎn)2-MIB藍(lán)藻的濃度。
文檔編號C12Q1/06GK102392076SQ201110378908
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月24日
發(fā)明者宋高飛, 李仁輝, 王中杰, 虞功亮 申請人:中國科學(xué)院水生生物研究所