專(zhuān)利名稱(chēng)：一種編碼缺刻緣綠藻δ15脂肪酸去飽和酶的dna序列及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種DNA序列，具體地說(shuō)，是一種編碼缺刻緣綠藻Δ 15脂肪酸去飽和酶的DNA序列及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
ω 3 長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸(ω 3 polyunsaturated fatty acid, ω 3 PUFA)主要包括 α -亞麻酸(α-Iinolenic acid，C183Δ9’ 12’ 15，ALA)、二十碳五烯酸(eicosapentenoic acid, 020:5Δ5' 8’ “’ 14’ 17，ΕΡΑ)和二十二碳六烯酸(docosahexenoic acid，C206Δ4’ 7’ “’ 13’ 16' 19, DHA)。它在人體中有多種生理學(xué)及藥理學(xué)活性，可預(yù)防心腦血管疾病、抑制腫瘤生長(zhǎng)等。例如，DHA和EPA參加到神經(jīng)元細(xì)胞膜的卵磷脂中，使細(xì)胞膜的液態(tài)流動(dòng)性變好，通透性增加；DHA對(duì)大腦神經(jīng)細(xì)胞的分裂、增殖、神經(jīng)傳導(dǎo)、突觸的生長(zhǎng)和發(fā)育起著重要的作用， 是大腦合成和智商開(kāi)發(fā)的必需物質(zhì)，尤其對(duì)嬰兒的視力及神經(jīng)發(fā)育非常關(guān)鍵。ω 3 PUFA還可降低多核白細(xì)胞及肥大細(xì)胞膜磷脂中花生四烯酸(arachidonic acid, C20:4"5’ 8' “’ 14， ArA)的含量，使過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生時(shí)其釋放量減少，從而降低白三烯的生成，減少炎癥。雖然ω3 PUFA對(duì)人體健康具有重要的作用，但是ω3 PUFA卻是人類(lèi)的必需脂肪酸，即人體自身并不能合成ω3 PUFA，而必須從食物中獲得。因海產(chǎn)品中ω3 PUFA的含量較高，因此，目前ω3 PUFA的商業(yè)來(lái)源主要是海產(chǎn)品，如市場(chǎng)上的魚(yú)油。但魚(yú)油存在腥味重、口感不佳、含膽固醇及芥酸等缺點(diǎn)，再加上海洋魚(yú)類(lèi)資源的不足，因而尋找合適的ω3 PUFA原料是營(yíng)養(yǎng)學(xué)、衛(wèi)生學(xué)、生物學(xué)等方面研究人員急待解決的問(wèn)題。其中，植物中的ALA在合適的酶催化下，可轉(zhuǎn)化為EPA和DHA，同樣具有魚(yú)油類(lèi)似功能，且性質(zhì)穩(wěn)定、易獲取、不含膽固醇和芥酸等特點(diǎn)，因而近來(lái)對(duì)植物ALA的研究特別重視與關(guān)注。缺刻緣綠藻i/^im)是一種單細(xì)胞綠藻，屬于綠藻門(mén)、 Trebouxiophyceae綱，細(xì)胞常聚集在一起形成類(lèi)似非定形群體的細(xì)胞團(tuán)。研究發(fā)現(xiàn)該藻含有ALA、EPA等ω 3 PUFA,與其他微藻比較，該藻PUFA含量較高，有利于通過(guò)微藻生物反應(yīng)器工業(yè)化生產(chǎn)PUFA，實(shí)現(xiàn)微藻產(chǎn)品的高值化。在微藻的PUFA合成代謝途徑中，微藻脂肪酸去飽和酶(fatty acid desaturase， FAD)是PUFA合成的關(guān)鍵酶類(lèi)，而ω 3脂肪酸去飽和酶(ω 3 fatty acid desaturase, ω 3 FAD)則是微藻FAD中的一種。在微藻中，ω 3 FAD主要包括Δ 15 FAD、Δ 17 FAD等。其中 Δ 15 FAD可催化缺刻緣綠藻的亞油酸(linoleic acid,C182Δ9' 12，LA) Δ 15位去飽和轉(zhuǎn)化為ALA，A17 FAD可催化缺刻緣綠藻的ArA產(chǎn)生EPA，從而進(jìn)入ω 3 PUFA代謝途徑。因此， 克隆和鑒定微藻PUFA合成的關(guān)鍵酶類(lèi)——ω 3 FAD，對(duì)通過(guò)基因工程方法大規(guī)模生產(chǎn)ω 3 PUFA意義重大。中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)CN 200710300675. 8，公告日2011年9月7日，公開(kāi)了一種海洋
微藻△ 5脂肪酸去飽和酶、其編碼基因其應(yīng)用，該發(fā)明提供的一種海洋微藻△ 5脂肪酸去飽和酶可有效地催化ETA (20:4Δ8’"’14’17)生成EPA (20:5Δ5’8’"’14’17)；中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)CN200810115245. 3，公告日2010年12月22日，公開(kāi)了一種海洋微藻Δ 6脂肪酸去飽和酶、其編碼基因其應(yīng)用，該發(fā)明提供的一種海洋微藻△ 6脂肪酸去飽和酶可有效地催化LA生成 SDA (18:4Δ6’9’12’15)。但是關(guān)于編碼缺刻緣綠藻Δ 15 FAD的DNA序列及其應(yīng)用目前還未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種編碼缺刻緣綠藻△ 15脂肪酸去飽和酶的DNA序列。本發(fā)明的再一的目的是，提供一種重組表達(dá)載體。本發(fā)明的另一的目的是，提供一種基因工程化的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的另一的目的是，提供一種上述DNA序列、重組表達(dá)載體和宿主細(xì)胞的用途。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是 所述的DNA序列包括
(a)SEQ ID NO. 10所述的核苷酸序列，或
(b)與(a)所述的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。為實(shí)現(xiàn)上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是
所述的載體是由上述核苷酸序列與質(zhì)?；虿《舅鶚?gòu)建的重組表達(dá)載體。所述的質(zhì)粒是pYES2質(zhì)粒。為實(shí)現(xiàn)上述第三個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是 所述的宿主細(xì)胞選自于下列一種宿主細(xì)胞
(a)用上述核苷酸序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞及其后代細(xì)胞； (b )用上述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞及其后代細(xì)胞。所述的宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞、植物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞，或這些宿主細(xì)胞的后代。所述的宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。為實(shí)現(xiàn)上述第四個(gè)目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是
所述的DNA序列、所述的重組表達(dá)載體或所述的宿主細(xì)胞在生產(chǎn)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸中的應(yīng)用。所述的長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸是ω 3長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸。所述的長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸是α -亞麻酸。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于
1、本發(fā)明克隆了缺刻緣綠藻的ω 3 FAD基因并對(duì)其進(jìn)行了功能鑒定，證實(shí)其可以編碼 Δ 15 FAD酶，將LA催化成為ALA。2、本發(fā)明為闡明缺刻緣綠藻的PUFA合成代謝途徑奠定了基礎(chǔ)。3、本發(fā)明為提高油料作物合成PUFA的能力提供了理論基礎(chǔ)，為在生物體內(nèi)進(jìn)行遺傳操作以實(shí)現(xiàn)《3 PUFA的高效合成創(chuàng)造了條件，如將該基因轉(zhuǎn)入到油料作物中，能夠有效地將LA去飽和為ALA，使這些油料作物具有合成ω3 PUFA的能力，以提高其品質(zhì)。


附圖1是5'-和3'-末端RACE擴(kuò)增和特異性目的條帶的電泳圖譜。附圖2是缺刻緣綠藻ω 3 FAD基因全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)示意圖。附圖3是未添加底物組的酵母脂肪酸成分檢測(cè)結(jié)果。附圖4是添加底物L(fēng)A (α8:2Δ9’ 12)組的酵母脂肪酸成分檢測(cè)結(jié)果。附圖5是酵母脂肪酸成分的GC-MS圖譜。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式
作詳細(xì)說(shuō)明。 實(shí)施例1、材料
(1)缺刻緣綠藻incisa Reisigl) H4301 來(lái)自 Culture collection of algae of Charles University of Prague。在溫度為 25°C、光照強(qiáng)度為 115 μ mol photons m_2 s—1、光/暗比為14 h/10 h的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)基為BG-Il。(2) pYES2質(zhì)粒載體和酵母INVScl菌株(His\ LeiT、Tr1T及JJra—缺陷型)均購(gòu)自hvitrogen公司。酵母用YPD培養(yǎng)基，28°C，200 rpm轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)。2、方法
(1)取100 mg新鮮的藻細(xì)胞置于預(yù)冷的研缽中，加入液氮充分研磨。(2) CTAB法提取基因組DNA和Trizol法抽提總RNA，_20°C保存?zhèn)溆?。?_5 μδ RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)進(jìn)行cDNA第一鏈合成，作為基因克隆的PCR反應(yīng)模板。(3)根據(jù)萊茵衣藻和普通小球藻ω3 FAD氨基酸序列(GenBank登錄號(hào)分別為ABL09485和ΒΑΒ78717)的保守區(qū)TMFWALF和HHDIGTH，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物序列上游弓丨物(SEQ ID NO. 1) :5，-ACCATGTTCTGGGC(C/T)CT(G/C)TT-3，，下游弓丨物(SEQ ID N0. 2) :5，-TG(G/C)GTGCC(A/G)ATGTCGTGGTG-3‘(在附加的序列表中，y 表示 C/ T，s表示G/C，r表示A/G)，用于缺刻緣綠藻ω3 FAD基因cDNA片段的克隆。然后應(yīng)用下列反應(yīng)體系和程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。25 PL的反應(yīng)體系包含10XPCR緩沖液
Π 2. 5 μ , dNTP (各 10 mM) 2 μ ，引物各 1.0 μ (10 μΜ)，模板 1.0 μ ，Taq 酶 0· 5 μ
(TaKaRa公司)，無(wú)RNase水17 μ 。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性2 min，然后30個(gè)循環(huán)包括94°C變性30 s，58°C退火30 s，72°C延伸1 min，最后72°C延伸10 min。將PCR產(chǎn)物膠回收純化后，與PMD19T載體(Promega公司)連接后轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆，菌落PCR驗(yàn)證后，將陽(yáng)性克隆菌液送至上海桑尼生物科技有限公司測(cè)序得到缺刻緣綠藻ω3 FAD基因片段的序列。(4)根據(jù)獲得的缺刻緣綠藻ω 3 FAD基因cDNA片段序列設(shè)計(jì)基因特異性引物GSP 1 (SEQ ID Ν0· 3) :5，-ATGTGTGCGGTGGCTGATCCTCCAGC-3，，
GSP 2 (SEQ ID Ν0· 4) :5，-CTTCTCCAGCAACAAGACGCTCAACAAC-3，。根據(jù) SMART RACE cDNA擴(kuò)增試劑盒(Clontech公司)的使用說(shuō)明分別建立5 ‘ -RACE和3 ‘ -RACE反轉(zhuǎn)錄體系， 然后根據(jù)降落PCR原理進(jìn)行擴(kuò)增。25 PL的5' -RACE反應(yīng)體系包括17 μ 的PCR級(jí)水、2.5 μ 的 IOXAdvantage 2 PCR緩沖液、0. 5 μ 的 dNTPs、0. 5 μ GSP1、2. 5 μ 的 10XUPM、 1.5 μ 的5' -RACE模板即步驟(2)獲得的cDNA第一鏈、0. 5 μ 的50XAdvantage 2聚合酶混合液。3'-端的反應(yīng)體系除0.5 PLWGSP 2和1.5 μ 的3' -RACE cDNA外，其它的同5'-端反應(yīng)體系。反應(yīng)程序?yàn)?4°C變性30 s，72°C延伸150 s，5個(gè)循環(huán)；94°C變性 30 s，70°C退火 30 s，72°C延伸 150 s，5 個(gè)循環(huán)；94°C變性 30 s，68°C退火 30 s，72°C延伸150 s，30個(gè)循環(huán)；72°C延伸7 min。然后電泳檢測(cè)、膠回收純化、TA克隆并測(cè)序，序列拼接獲得缺刻緣綠藻ω 3 FAD基因的cDNA全長(zhǎng)序列。(5)根據(jù)步驟(4)獲得的缺刻緣綠藻ω3 FAD基因的cDNA全長(zhǎng)序列， 分別在該基因的5 ‘ -UTR和3 ‘ -UTR設(shè)計(jì)引物上游引物(SEQ ID NO. 5) 5'-AAACCCGGCAACAATGCA-3，，下游引物(SEQ ID NO. 6) :5，-AGAATCAGAACCCGAAGC-3，，克隆 ω 3 FAD基因的DNA全長(zhǎng)序列。25 μ 的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系包含2. 5 μ 的10 X PCR緩沖液，2 μ WdNTP (各 10 mM)，1.5 μ 的 Mg2+ (25 mM)，各 1.0 μ 的引物(10 μΜ)，1. 0 μ 模板，0.5 μ Taq酶(TaKaRa公司)及無(wú)RNase水15. 5 μ 。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性5 min ；然后 ；35個(gè)循環(huán)包括94°C變性1 min，55°C退火1 min，72°C延伸2 min ；最后72°C延伸10 min。 以上PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后，均作TA克隆，選擇陽(yáng)性克隆送至上海桑尼生物有限公司測(cè)序得到缺刻緣綠藻ω 3 FAD基因的DNA全長(zhǎng)序列。(6)根據(jù)pYES2載體(Promega公司)和缺刻緣綠藻ω 3 FAD基因的ORF序列設(shè)計(jì)引物上游引物(SEQ ID NO. 7 ) 5，-cgGAA77TATGCAGGCCCCCACTATGT-3，，下游引物(SEQ ID NO. 8):5，-gc/T7^6^CTACACATCCGAGCCACTG-3，，其中，斜體 G^TTT 和斜體 TCTAGA 分別代表 ^^肌和^^^的酶切位點(diǎn)。以缺刻緣綠藻ω 3 FAD cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系如下2. 5 μ L 的 10 X PCR 緩沖液，2 μ L 的 dNIPs，1. 5 yL&Mg2+(25 mM), 1. 0 μ L 模板， 上下游引物各1 PL，16 μ L的無(wú)RNase水，0.25 μ L的Taq酶(5U/μ L)。PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5 min ;36個(gè)循環(huán)包含94°C變性1 1^11、661退火1 min ；72°C延伸^iiin，最后72°C延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后作TA克隆后，送陽(yáng)性克隆至上海桑尼生物有限公司測(cè)序確保序列的準(zhǔn)確性。(7)從大腸桿菌DH5a中抽提pMD19T_co3 FAD質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶I和損aI進(jìn)行雙酶切消化反應(yīng)，同時(shí)對(duì)pYES2質(zhì)粒也進(jìn)行^b0RI /損aI雙酶切反應(yīng)。反應(yīng)體
系為4 PL 的 10 X M 緩沖液，4 μ L 的 0. 1% BSA，DNA 彡 2 μ g,EcoRlR Xbal # 1 yL，加
無(wú)RNase水至20 μ L。37°C消化反應(yīng)4 h。割膠回收酶切后的目的片段，并用T4 DNA連接酶將酶切后的ω3 FAD基因片段與pYES2片段連接得到重組載體ρΥ_ω3 FAD。連接反應(yīng)體系為2. 5 μ L的緩沖液，ω 3 FAD基因DNA片段約0. 3 pmol，載體pYES2的DNA消化片段約0.03 pmol,l PLWT4 DNA連接酶，加無(wú)RNase水至25 μ L0 16°C連接過(guò)夜。連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞，按照上述方法進(jìn)行克隆、菌落PCR驗(yàn)證和測(cè)序。從大腸桿菌 DH5a中抽提ρΥ-ω3 FAD質(zhì)粒，_20°C保存?zhèn)溆谩?8)酵母感受態(tài)細(xì)胞的制備。將酵母接種于YPD培養(yǎng)基中，28°C復(fù)蘇培養(yǎng)過(guò)夜，然后按1 100放大培養(yǎng)，以250 rpm轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)至細(xì)胞密度約為1 X IO8細(xì)胞/mL (約4_5
6h)。冰上冷卻15 min使細(xì)胞停止生長(zhǎng)，4°C條件下以5 000 rpm轉(zhuǎn)速離心5 min收集酵母細(xì)胞，預(yù)冷無(wú)菌水洗滌細(xì)胞2次，同樣條件下離心收集。20 mL預(yù)冷的1 M山梨醇洗滌細(xì)胞 1次，然后溶于0. 5 mL預(yù)冷的1 M山梨醇，調(diào)整細(xì)胞的濃度在1 X 101°細(xì)胞/mL。冰上保存細(xì)胞(或是4°C )，便于電擊使用。(9)電穿孔儀(Bio-Rad)電擊，將重組的載體ρΥ_ω3 FAD轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞。 取在冰上預(yù)冷的待轉(zhuǎn)化的ρΥ-ω 3 FAD重組質(zhì)粒DNA約5_10 μ L (5-200 ng)與感受態(tài)細(xì)胞混勻，并與0. 2 cm的電擊杯一起冰上預(yù)冷，然后將DNA-細(xì)胞混合液轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的電擊杯輕輕混勻，冰浴5 min后，選擇程序電擊一次，移走電擊杯，立刻加入1 mL預(yù)冷的IM山梨醇，輕輕轉(zhuǎn)移到新的YPD培養(yǎng)基中，28°C輕微振蕩證，將菌液涂布于含有1 M山梨醇的尿嘧啶缺陷合成培養(yǎng)基(SC-U)上，倒置靜置培養(yǎng)48-72 h，挑取菌落于液體SC-U培養(yǎng)基中培養(yǎng)。菌落PCR驗(yàn)證后，用含21葡萄糖或2%棉籽糖的SC-U培養(yǎng)基保存菌種。(10)將保存的菌液接種YPD培養(yǎng)基中下以220 rpm轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)。然后離心收集菌液，重懸于21半乳糖的YPD培養(yǎng)基中，分別加入底物L(fēng)A (C18:2co6)和ArA (C20:4co6)至終濃度為 0. 005%(170 μ M-180 μ Μ)，并加入表面活性劑 1% Tergitol type NP-40，10°C下以150 rpm轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)72 h。離心收集酵母菌體，經(jīng)去離子水洗滌3次后液氮凍存。(11)將液氮凍存的酵母冷凍干燥，然后進(jìn)行脂肪酸甲酯化。稱(chēng)取約25 mg酵母粉末于酯化瓶中，加入2 ml含洲硫酸的甲醇溶液。充氮?dú)夂?，?2°C水浴鍋酯化反應(yīng)1 h， 便于將結(jié)合的脂肪酸分子充分解離并甲基化。酯化反應(yīng)后，向上述酯化瓶中分別加入1 mL 去離子水和1 mL正己烷，充分混勻，然后在5500 rpm下離心10 min。收集上清液至樣品瓶中，氮?dú)鉂饪s，4°C保存?zhèn)溆谩?12)采用Angilent 6890 plus型氣相色譜儀進(jìn)行脂肪酸組成分析，色譜柱為 HP-5型毛細(xì)管柱(30 mXO. 25 mm)；升溫程序?yàn)?0°C保留1 min，25°C /min升溫至200°C， 然后3°C/min升溫至230°C，最后保留18 min ；分流比為50:1 ；氮?dú)狻錃?、空氣的流速分別為 30 mL/min、450 mL/min、40 mL/min。進(jìn)樣量為 1 μ L0(13) GC-MS 檢測(cè)生成的產(chǎn)物。GC 的色譜柱為 HP-INNOWax Polyethylene Glyco (30 mX320 ymXO. 25 μ m)，連接MS四級(jí)桿，150 C(最大值200 C)。升溫程序50°C保持1 min,以10°C /min升到150°C后保持1 min，然后再以4°C /min升到230°C后再保持5 min, 運(yùn)行時(shí)間37 min。氦為載氣體，初始值50°C，壓力7. 6522 8丨，流速2.6891 mL/min，平均速率 59. 763 cm/s，滯留時(shí)間 0. 83664 min，流速 2. 6891 mL/min，運(yùn)行時(shí)間 37 min。MS 采集參數(shù)選用EMV模式，跟蹤檢測(cè)的離子能為69. 922 eV。3、結(jié)果
(1)利用RACE方法擴(kuò)增得到ω 3 FAD基因的ORF序列，5 ‘-和3 ‘-末端RACE擴(kuò)增和特異性目的條帶的電泳圖譜如圖1所示。圖中，M代表DL 2000分子量標(biāo)準(zhǔn);A圖為5’-末端產(chǎn)物，長(zhǎng)度為650 bp ；C圖為3’-末端產(chǎn)物，長(zhǎng)度為1759 bp ;B圖為目的條帶，長(zhǎng)度為671 bp。經(jīng)測(cè)序得到ω 3 FAD基因的ORF序列如SEQ ID NO. 9所示?？寺〔y(cè)序得到DNA全長(zhǎng)序列如SEQ ID NO. 10所示。缺刻緣綠藻ω 3 FAD基因全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)如圖2所示。(2)選用pYES2載體通過(guò)限制性內(nèi)切酶I和損a I的基因操作，成功地構(gòu)建了 ω3 FAD基因的表達(dá)載體ρΥ-ω 3 FAD。將ω3 FAD基因組裝在pYES2載體的GALl啟動(dòng)子下游，應(yīng)用半乳糖誘導(dǎo)基因過(guò)表達(dá)。(3)采用電穿孔儀電擊的方法成功地將重組的表達(dá)載體ρΥ_ω3 FAD導(dǎo)入酵母 INVScl中。由于酵母INVScl是His-、Leu-、Trp-、toa-缺陷型菌株，而pYES2載體上有編碼尿嘧啶的URA3基因，因而轉(zhuǎn)入ρΥ-ω 3 FAD質(zhì)粒的酵母能夠在尿嘧啶缺陷的合成培養(yǎng)基 (SC-U)上生長(zhǎng)，進(jìn)而篩選獲得轉(zhuǎn)基因的酵母細(xì)胞。(4)培養(yǎng)基中分別添加外源底物L(fēng)A和ArA，經(jīng)半乳糖誘導(dǎo)后，GC-MS檢測(cè)酵母甲酯化的脂肪酸。未添加底物組的酵母脂肪酸成分檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，圖中箭頭指示酵母自身合成的脂肪酸成分；添加底物υν(α8:2Δ9’ 12)組的酵母脂肪酸成分檢測(cè)結(jié)果如圖4所示， 圖中粗箭頭指示的是添加的外源脂肪酸底物，細(xì)箭頭指示其產(chǎn)物。在圖3和圖4中，a代表野生型對(duì)照組，b代表轉(zhuǎn)空載體對(duì)照組，c代表含有ω 3 FAD的轉(zhuǎn)基因酵母ρΥ-ω 3 FAD組。 GC-MS圖譜如圖5所示。比較了轉(zhuǎn)基因酵母在添加不同脂肪酸底物培養(yǎng)后，細(xì)胞中脂肪酸組分的含量(占總脂肪酸％)，結(jié)果如表1所示
表權(quán)利要求
1.一種編碼缺刻緣綠藻Δ15脂肪酸去飽和酶的DNA序列，其特征在于，所述的DNA序列包括(a)SEQ ID NO. 10所述的核苷酸序列，或(b)與(a)所述的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
2.一種重組表達(dá)載體，其特征在于，所述的載體是由權(quán)利要求1所述的核苷酸序列與質(zhì)?；虿《舅鶚?gòu)建的重組表達(dá)載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述的質(zhì)粒是PYES2質(zhì)粒。
4.一種基因工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞選自于下列一種宿主細(xì)胞(a)用權(quán)利要求1所述的核苷酸序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞及其后代細(xì)胞；(b)用權(quán)利要求2或3所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞及其后代細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞、植物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞，或這些宿主細(xì)胞的后代。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。
7.權(quán)利要求1所述的DNA序列、權(quán)利要求2或3所述的重組表達(dá)載體或權(quán)利要求4或 5所述的宿主細(xì)胞在生產(chǎn)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸中的應(yīng)用。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸是ω3長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸是α-亞麻
全文摘要
本發(fā)明涉及一種編碼缺刻緣綠藻Δ15脂肪酸去飽和酶的DNA序列，所述的DNA序列包括(a)SEQIDNO.10所述的核苷酸序列，或(b)與(a)所述的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了含有上述核苷酸序列的重組表達(dá)載體和基因工程化的宿主細(xì)胞及其用途。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于克隆了缺刻緣綠藻的脂肪酸去飽和酶基因并對(duì)其進(jìn)行了功能鑒定，為闡明缺刻緣綠藻的長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸合成代謝途徑奠定了基礎(chǔ)，并為在生物體內(nèi)進(jìn)行遺傳操作以實(shí)現(xiàn)ω3長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的高效合成創(chuàng)造了條件。
文檔編號(hào)C12N1/19GK102492700SQ20111037917
公開(kāi)日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2011年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月25日
發(fā)明者于水燕, 吳洪, 周志剛, 李慧, 李春陽(yáng), 歐陽(yáng)瓏玲, 陳思弘 申請(qǐng)人:上海海洋大學(xué), 新奧科技發(fā)展有限公司