專利名稱：家蠶核型多角體病毒抗性關鍵基因BmPGRP2及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物基因工程領域，特別涉及到家蠶的抗性基因。
背景技術：
家蠶是一種重要的經濟昆蟲，蠶絲是絲綢工業(yè)的重要原料。在中國、印度、巴西等發(fā)展中國家，養(yǎng)蠶業(yè)是農民經濟收入的一個重要來源，甚至是某些地區(qū)的支柱性產業(yè)。但是，家蠶卻面臨嚴重的疾病威脅，每年因蠶病引起的損失占蠶業(yè)生產總收入的20%左右。核型多角體病毒病是蠶業(yè)生產上最常見而且危害最嚴重的一類蠶病，引起該病的病原為核型多角體病毒(BmNPV)，該病的傳染力極強并且難以控制，全世界各蠶業(yè)主產區(qū)經常因為該病的爆發(fā)而造成嚴重的經濟損失。由于BmNPV在蠶業(yè)生產上危害嚴重，科研工作者一直希望找出影響家蠶病毒抗性的關鍵基因，通過轉基因的方式上調或下調抗性關鍵基因來提高家蠶對BmNPV的抗性。對影響家蠶病毒抗性的關鍵基因全長序列進行克隆和鑒定，為闡明家蠶抵抗BmNPV的機制， 以及培育抗性品種應用于蠶業(yè)生產有著重要的理論價值和實踐意義。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的之一在于提供家蠶核型多角體病毒抗性基因及其重組載體，其為一種新的基因及重組載體，為調控多角體病毒抗性提供的有效思路。為實現上述目的，本發(fā)明的技術方案為
所述家蠶核型多角體病毒抗性關鍵基因為如SEQ ID N0:3所示的核苷序列中的任一連續(xù)的21 25 bp。所述家蠶核型多角體病毒抗性關鍵基因含有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。所述家蠶核型多角體病毒抗性關鍵基因，所述家蠶核型多角體病毒抗性基因含有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。所述家蠶核型多角體病毒抗性關鍵基因，所述家蠶核型多角體病毒抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示。所述的家蠶核型多角體病毒抗性基因的重組載體。所述的重組載體，所述重組載體為含有如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列的干擾載體。所述的重組載體，所述干擾載體為1180-IElP-BmPGRP2-S-A3intron-BmPGRP2-A-SV40載體，所述干擾載體為pSLfall80fa載體和依次連接IEl啟動子、如SEQ ID NO: 1所示的正向核苷酸序列、如SEQ ID NO: 1所示的反向互補核苷酸序列及SV40終止子的L4440載體在5 / I琳Bgl #酶切位點連接而成的重組載體，所述干擾載體的核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示。所述的重組載體，所述重組載體為PiggyBac [3 XP3 EGFP afm]載體與1180-IElP-BmPGRP2-S-A3intron- BmPGRP2-A-SV40 載體在 Asc / 酶切位點連接而成。本發(fā)明的目的之二在于提供家蠶核型多角體病毒抗性基因的制備方法，該方法穩(wěn)定性高，操作簡單。為實現上述目的，本發(fā)明的技術方案為
所述家蠶核型多角體病毒抗性關鍵基因的制備方法，1)以如SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列作為靶標，設計轉基因干涉引物，正向片段上游引物為Sense-F: 5' - ggaattcatcttcagattaatagaacacag- 3' ， 下游 弓| 物為 Sense-R 5' -cgggatccttagttttcactttcgatcat- 3'，以克隆的如 SEQ ID No 2 所示的汝 /基因的質粒為模板進行PCR擴增，PCR反應條件為94°C預變性4分鐘，然后94°C變性40秒、48°C 退火40秒、72°C延伸15秒，共30個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘，得如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列；
或 2)BmPGRP2 的正向引物5， - ATGAAGAGTGATGGTGATGAAAAT- 3，，反向引物 5， TTAGTTTTCACTTTCGATCATTGC 3'，以家蠶的全蠶或組織cDNA為模板進行擴增，PCR反應條件為94°C預變性4分鐘，然后94°C變性40秒、48°C退火40秒、72°C延伸1分鐘，共30個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；得如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。本發(fā)明的目的之三在于提供上述基因及重組載體的應用，該應用為提高家蠶對核型多角體病毒的抵抗性提供了有效辦法。為實現上述目的，本發(fā)明的技術方案為
所述家蠶核型多角體病毒抗性關鍵基因在調控核型多角體病毒抗性中的應用。所述的重組載體在調控核型多角體病毒抗性中的應用。上述技術方案是通過如下實驗設計得到的
(1)首先根據家蠶基因組序列設計特異引物，以家蠶5齡3天的全蠶CDNA為模板進行擴增，獲得了目的條帶，PCR產物回收后與PMD19-T載體連接，轉化DH5 α感受態(tài)細胞，獲得陽性克隆后送往上海生工生物技術有限公司測序，測序結果表明^？基因的CDS序列被成功克隆。(2)根據克隆的汝 /基因⑶S序列，設計3’ Race特異引物，根據試劑盒的操作說明進行3’ Race，對擴增出的條帶進行回收、連接和轉化，篩選陽性克隆，通過測序得到 BmPGRP2 的 3，UTR 序列。(3)根據家蠶基因組序列以及克隆的/ 基因的⑶S序列，設計引物擴增5’ UTR序列的引物，以5齡3天的全蠶cDNA為模板進行擴增，對擴增出的條帶進行回收、連接和轉化，篩選陽性克隆，通過測序得到/？基因的5’ UTR序列。(4)以家蠶各時期cDNA為模板，通過RT-PCR的方法檢測BmPGRP2的轉錄表達情況；以家蠶5齡3天雌雄各組織cDNA為模板，通過定量PCR的方法檢測BmPGRP2的轉錄表達情況，RT-PCR和定量PCR檢測的結果顯示該基因的表達量非常低。(5)以汝 /基因的特異序列作為靶標(如SEQ ID NO: 1所示)，設計轉基因干涉引物，以克隆的^ / ？基因的CDS質粒為模板進行PCR擴增，對目的條帶進行回收、 連接和轉化，篩選陽性克隆后測序。利用轉座載體pBaC[3XP3-EGFPafm]構建包括病毒 immediately early基因(IEl)啟動子、^ / 基因正反向片段、家蠶肌動蛋白Actin 3 內含子以及SV40終止信號序列的轉基因干涉載體(pb-PGRP2I)。
(6)將家蠶932品種通過15°C低溫催青解除滯育，將產下的非滯育蠶卵收集好，在蠶卵產后ai-4h用顯微注射儀內將3-如1、總濃度為400ng/ul的混合質粒(增量表達載體和輔助質粒按1:1混合)注射進蠶卵蠶卵，然后用無毒膠水將注射孔封住。將完成注射的蠶卵在35%的甲醛蒸汽中消毒^iin后，置于25°C、相對濕度為80%的環(huán)境中進行催青直到孵化，將孵化的蟻蠶置于標準條件中飼養(yǎng)，將當代(GO)的蠶蛾進行自交或者回交，將滯育性的Gl代蠶卵即時浸酸解除滯育，胚胎發(fā)育第六天在熒光顯微鏡下面篩選轉基因陽性個體， 將獲得的轉基因個體單蛾區(qū)正常飼養(yǎng)，繼代擴大群體數量。(7)將轉基因干涉系統PGRP2I-1、PGRP2I-2和非轉基因932品種(正常932)在 3齡起蠶，用半致死劑量的BmNPV病毒通過經口感染，設置不添食病毒的轉基因品系和正常 932品種對照，連續(xù)10天統計死亡率。本發(fā)明的有益效果在于克隆了家蠶的一個影響家蠶抗性的關鍵基因/？序列，包括全長⑶S序列和5’ UTR序列以及3’ UTR序列，該基因表達量非常低，沒有EST序列，克隆非常困難；通過同源比對發(fā)現該基因是一個新基因；通過RT-PCR和定量PCR技術對該基因的時期組織表達譜進行了檢測，檢測結果表明該基因的表達量非常低；為了研究該基因的功能，以該基因的特異序列作為靶標(如SEQ ID NO: 1所示)，構建轉基因干涉載體；通過轉基因顯微注射，篩選得到轉基因陽性個體；以該基因作為干涉靶標的轉基因家蠶系統對BmNPV病毒的抗性顯著提高，因此該基因在家蠶轉基因抗病育種的研究和應用中具有重要價值。


圖1為通過RT-PCR麵BtnPGRP2基因時期表達情況；其中，1為卵第2天，2為卵第4天，3為卵第6天，4為卵第8天，5為蟻蠶，6為一齡眠蠶，7為二齡起蠶，8為二齡眠蠶， 9為三齡起蠶，10為三齡眠蠶，11為四齡起蠶，12為四齡眠蠶，13為五齡起蠶，12為蛹第2 天，15為蛹第4天，16為蛹第6天，17為蛹第8天，18為蛾。圖2為通過定量PCR技術檢測BmPGRP2基因組織表達情況(以5齡3天家蠶幼蟲雌雄各組織cDNA為模板)。圖3為BmPGRP2基因轉基因干涉載體pb_PGRP2I示意圖。圖4為轉基因干涉系統PGRP2I抗性檢測結果。
具體實施例方式本發(fā)明的目的在于提供一個來自于家蠶的控制家蠶對BmNPV病毒抗性的關鍵基因汝 / 的全長序列，如SEQ ID NO: 3所示，包括編碼區(qū)序列(Coding sequence，CDS)和 5，非翻譯區(qū)序列(5，Untranslated region，5，UTR)(如 SEQ ID NO:4 所示)以及 3，非翻譯區(qū)序列(3’UTR)(如SEQ ID N0:5所示)。通過轉基因干涉的方式降低該基因在家蠶體內的表達量，抗性檢測結果顯示轉基因干涉系統對BmNPV病毒的抗性顯著提高，說明如SEQ ID N0:1-3所示的任一序列是一個影響家蠶對病毒抗性的關鍵基因，可為家蠶轉基因抗性品種的培育提供理論基礎和靶標基因。
根據家蠶基因組序列，我們設計引物，條飛織BmPGRP2基因包括⑶S (如SEQ ID NO:2 )以及 5，UTR(如 SEQ ID NO:4)和 3，UTR(如 SEQ ID NO:5)在內的 1450bp 的全長序列(如SEQ ID N0:3)，該基因沒有EST序列，說明表達量非常低，全長序列克隆非常困難。該基因包括一個跨膜結構域和一個PGRP(P印tidoglycan recognition protein，肽聚糖識別蛋白)的結構域；在NCBI站點上用BLAST完成序列同源性分析，跟該基因DNA序列相似性最高的只有10%左右，這表明BmPGRP2基因是一個新基因。通過RT-PCR和定量PCR 對該基因的時期組織表達情況進行了檢測，研究結果進一步證實該基因的表達量極低。為了研究該基因的功能，我們通過轉基因干涉的方式來降低家蠶體內該基因的表達量，然后檢測轉基因干涉系統的抗性是否有明顯變化。首先以該基因如SEQ ID NO: 1所示的特異序列作為靶標，構建轉基因干涉載體；通過轉基因顯微注射家蠶實用品種932，獲得該基因的 2個轉基因干涉系統；通過經口添食BmNPV的方法檢測/ 基因轉基因干涉系統的死亡率，和對照(正常932)相比，轉基因系統的死亡率顯著降低，說明如SEQ ID N0:l_3所示的任一序列所示/？基因是一個影響家蠶抗性的關鍵基因，可以作為家蠶轉基因抗病育種的靶標基因。具體方法如下
(1)首先根據家蠶基因組序列設計特異引物，以家蠶5齡3天的全蠶cDNA為模板進行擴增，獲得了目的條帶，PCR產物回收后與PMD19-T載體連接，轉化DH5 α感受態(tài)細胞，獲得陽性克隆后送往上海生工生物技術有限公司測序，測序結果表明我們成功克隆了 ^？ 基因的⑶S JnSEQ ID N0:2所示。(2)根據克隆的汝 /基因⑶S序列，設計3’ Race特異引物，根據試劑盒的操作說明進行3’ Race，對擴增出的條帶進行回收、連接和轉化，篩選陽性克隆，通過測序得到 BmPGRP2 的 3，UTR 序列(如 SEQ ID N0:5 所示)。(3)根據家蠶基因組序列以及克隆的/ 基因的⑶S序列，設計引物擴增5’ UTR序列的引物，以5齡3天的全蠶cDNA為模板進行擴增，對擴增出的條帶進行回收、連接和轉化，篩選陽性克隆，通過測序得到汝 /^ ？基因的5，UTR序列(如SEQ ID N0:4所示)。(4)獲得了汝 / 基因序列 1450bp (如 SEQ ID NO: 3)，包括 281bp 的 5，UTR(如 SEQ ID NO:4)、945bp 的 CDS 全長序列(如 SEQ ID N0:2)和 224bp 的 3，UTR 序列(如 SEQ ID N0:5)。生物信息學分析顯示該基因包括一個跨膜結構域和一個PGRP的結構域。在NCBI 站點上用BLAST完成序列同源性分析，結果顯示跟該基因DNA序列相似性最高的只有10% 左右，這表明BmPGRP2基因是一個新基因。(5)以家蠶各時期cDNA為模板，通過RT-PCR的方法檢測汝 /的轉錄表達情況；以家蠶5齡3天雌雄各組織cDNA為模板，通過定量PCR的方法檢測BmPGRP2的轉錄表達情況，RT-PCR和定量PCR檢測的結果顯示該基因的表達量非常低。(6)以汝 /基因的特異序列作為靶標(如SEQ ID NO: 1)，設計轉基因干涉引物，以克隆的^ / ？基因的CDS質粒為模板進行PCR擴增，對目的條帶進行回收、連接和轉化，篩選陽性克隆后測序。利用轉座載體pBaC[3XP3-EGFPafm]構建包括病毒 immediately early基因(IEl)啟動子、^ / 基因正反向片段、家蠶肌動蛋白Actin 3 內含子以及SV40終止信號序列的轉基因干涉載體(pb-PGRP2I)。(7)將家蠶932品種通過15°C低溫催青解除滯育，將產下的非滯育蠶卵收集好，在蠶卵產后ai-4h用顯微注射儀內將3-如1、總濃度為400ng/ul的混合質粒(增量表達載體和輔助質粒按1:1混合)注射進蠶卵蠶卵，然后用無毒膠水將注射孔封住。將完成注射的蠶卵在35%的甲醛蒸汽中消毒^iin后，置于25°C、相對濕度為80%的環(huán)境中進行催青直到孵化，將孵化的蟻蠶置于標準條件中飼養(yǎng)，將當代(GO)的蠶蛾進行自交或者回交，將滯育性的Gl代蠶卵即時浸酸解除滯育，胚胎發(fā)育第六天在熒光顯微鏡下面篩選轉基因陽性個體， 將獲得的轉基因個體單蛾區(qū)正常飼養(yǎng)，繼代擴大群體數量。(8)將轉基因系統PGRP2I-1、PGRP2I-2和非轉基因932品種(正常932)在3齡起蠶，用半致死劑量的BmNPV病毒通過經口感染，設置不添食病毒的轉基因品系和正常932品種對照，連續(xù)10天統計死亡率。結果顯示轉基因系統PGRP2I對BmNPV病毒的抗性明顯提高，說明/^^ ^？基因是影響家蠶抗性的關鍵基因，可以作為家蠶轉基因抗病育種的靶標基因。
實施例1克隆^ /基因 1 ^ / 基因的CDS的克隆
(1)在家蠶基因組數據庫(http://silkworm, swu. edu. cn/silkdb/)中沒有該基因的EST序列，說明該基因表達量非常低，克隆很困難。我們首先根據家蠶基因組序列設計特異引物，正向引物5' -atgaagagtgatggtgatgaaaat-3，，反向引物 5' -ttagttttcactttcgatcattgc-3，。以家蠶5齡3天的全蠶cDNA為模板進行擴增，PCR反應條件為94°C預變性4分鐘，然后94°C變性40秒、48°C退火40秒、72°C延伸1分鐘，共30 個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收，然后與pMD19-T 載體連接，連接反應在T4 DNA連接酶作用下，16°C過夜連接，然后轉化DH5ci感受態(tài)細胞， 獲得陽性克隆后送往上海生工生物技術有限公司測序，測序結果表明本實施例成功克隆了 BmPGRP2基因的CDS序列(如SEQ ID NO: 2所示)。2汝7/基因的全長序列的克隆 1) BmPGRP2 的 3 ’ UTR 的克隆
根據克隆的汝 /^ ？基因⑶S，設計3’ Race特異引物，兩條正向引物為3-1F :5’-actggtcatcgtccaacac-3'和 3-2F: 5' - atccgtgaaacagtcagtcc_3',反向弓丨物購買自 TaKaRa公司。根據試劑盒的操作說明進行3’Race，對擴增出的條帶進行回收、連接和轉化， 篩選陽性克隆，通過測序得到^ / ？的3’ UTR序列。2 ) BmPGRP2 的 5，UTR 的克隆
根據家蠶基因組序列以及克隆的BmPGRP2基因的CDS序列，設計引物擴增 5，UTR 的引物。兩條正向引物為:5-lF 5' -tgcattacaatcacagtcg-3，和 5-2F 5'-aattgggcattatggtgt-3，，反向弓丨物為 5R 5' - tagtaatcgggatgtaggaa-3，，禾口 5-2F 相比， 5-1F距離BmPGRP2基因翻譯起始位點ATG的距離更遠。以5齡3天的全蠶cDNA為模板進行擴增，PCR反應條件為94°C預變性4分鐘，然后94°C變性40秒、50°C退火40秒、72°C延伸2分鐘，共30個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定發(fā)現5-1F 和5R這對引物沒有擴增出條帶，5-2F和5R這對引物擴增出目的條帶，對擴增出的條帶進行回收、連接和轉化，篩選陽性克隆，通過測序得到/？的5’ UTR序列。最終我們獲得了總長為1450bp的徹/基因序列，包括281bp的5，UTR、945bp 的⑶S全長序列和224bp的3’ UTR序列。生物信息學分析顯示該基因包括一個跨膜結構域和一個PGRP的結構域。在NCBI站點上用BLAST完成序列同源性分析，結果顯示跟該基因DNA序列相似最高的只有10%左右，這表明汝 /基因是一個新基因，如SEQ ID NO:3 所示。RNA干擾是指通過反義RNA和正鏈RNA形成雙鏈RNA( dsRNA)分子，在mRNA水平關閉相應序列基因的表達或使其沉默，即序列特異性的轉錄后基因沉默技術。dsRNA在體內能被一種dsRNA特異的核酸內切酶識別，并被隨機均勻地切割成21 25核苷酸長的干擾性 SiRNA0 siRNA可與該核酸酶的dsRNA結合結構域結合，并且作為模板識別目的mRNA ；識別之后，mRNA與dsRNA的有義鏈發(fā)生鏈交換，原先dsRNA中的有義鏈被mRNA代替，從酶-dsRNA 復合物中釋放出來，而mRNA則處于原先的有義鏈的位置。核酸酶在同樣位置對mRNA進行切割，目標基因的mRNA就被特異降解(摘自分子生物學課本；RNAi—基因沉默指南.G. J. iXiikilli.； Bass B L. Double-stranded RNA as a template for gene silencing. (J) Cell. 2000； Gura Τ. A silence that speaks volumes. (J) Nature. 2000； Sayda M Elbashir. RNA interference is mediated by 21- and 22- mucleotide RNAs. (J) Gene& Development. 2011;夏慶友.RNA干涉及其在蠶功能基因組研究中的應用.(J)蠶業(yè)科學.2003)。按照RNAi的原理，目標基因mRNA序列中的任一 21 25 bp都可以作為干涉的靶標，換言之就是任一和目標基因序列完全匹配長度超過21 bp的 dsRNA都可以降解靶基因mRNA，從而抑制其功能。本發(fā)明以BmPGRP2基因的224bp特異序列作為靶標構建轉基因干涉載體，抑制該基因的表達，從而提高家蠶的抗性。按照RNAi的原理，以/ 基因任一超過21bp的序列作為干涉靶標，都可能達到本發(fā)明同樣的效果。 所以，按照RNAi的原理，以/ 基因任一超過21bp的序列作為干涉靶標的結果都可以理解為本發(fā)明的延伸。所以，所述家蠶核型多角體病毒抗性關鍵基因為如SEQ ID N0:3所示的核苷序列中的任一連續(xù)的21 25 bp。
3召 /基因片段的克隆
以汝 /基因的特異序列作為靶標，如SEQ ID N0:1所示，設計轉基因干涉引物， 正向片段上游弓丨物為Sense-F 5' -ggaattcatcttcagattaatagaacacag- 3',下游弓丨物為 Sense-R 5' _cgggatccttagttttcactttcgatcat_3',反向片段上游弓I物為 Anti-F 5' - cc aagcttttagttttcactttcgatcat_3',下游弓I物為 Anti-R 5' - gctctagaatcttcagattaatag aacacag-3’。以克隆的汝 / 基因的⑶S (如SEQ ID N0:幻質粒為模板進行PCR擴增， PCR反應條件為94 V預變性4分鐘，然后94°C變性40秒、48 V退火40秒、72 °C延伸15秒， 共30個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；對擴增出的正反向片段分別進行回收、連接和轉化， 篩選陽性克隆后測序，分別得如SEQ ID N0:1 / 基因片段及其互補反向片斷。實施例2 ,BmPGRP2基因的時期組織表達譜檢測 1通過RT-PCR檢測BmPGRP2基因時期表達情況
以家蠶卵第2天、卵第4天、卵第6天、卵第8天、蟻蠶、一齡眠蠶、二齡起蠶、二齡眠蠶、三齡起蠶、三齡眠蠶、四齡起蠶、四齡眠蠶、五嶺起蠶、蛹第2天、蛹第4天、蛹第6 天、蛹第8天和蛾的cDNA作為模板，以BmPGRP2基因的特異引物BmPGRP2QRT (F 5'-taattggcaacgacaatagag-3' , R 5' -agtaatcgggatgtaggaaac- 3')進行 RT-PCR 檢測，PCR 擴增條件為94°C預變性4分鐘，然后94°C變性40秒、56°C退火40秒、72°C延伸11秒，共30個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；以家蠶看家基因BmGAPDH作為內參，以其特異引物 BmGAPDH QRT (F 5'_cattccgcgtccctgttgctaat_3' , R 5'-gctgcctccttgaccttttgc- 3') 進行RT-PCR檢測，PCR擴增條件為94°C預變性4分鐘，然后94°C變性40秒、56°C退火40 秒、72°C延伸10秒，共25個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘。2通過定量PCR技術檢測BmPGRP2基因組織表達情況
以家蠶5齡3天雌雄幼蟲的頭、皮、血、中腸、脂肪體、絲腺、氣管、馬氏管和卵巢以及精巢等組織的cDNA作為模板，以/ 基因的特異引物BmPGRP2QRT進行定量PCR檢測(試劑盒為 SYBR Premix Ex Taq Kit，TaKaRa ；定量PCR檢測儀器為 ABI Prism 7000 Sequence Detection System, Applied Biosystems ；按照試劑盒和儀器使用說明書進行操作);以家蠶看家基因BGIBMGA003186-TA作為內參，檢測引物序列為F 5' - ttcgtactggctcttctcgt-3' , R 5'_caaagttgatagcaattcccT_3'。3 結果
如圖1所示的RT-PCR檢測和如圖2所示的定量PCR檢測的結果證明該基因的表達量確實非常低，同時也說明能克隆得到如SEQ ID N0:3所示的該基因的全長序列確實非常不
各易ο實施例3重組載體的構建
(1)為了研究該基因的功能，我們通過轉基因干涉的方式來降低家蠶體內該基因的表達量，然后再觀察轉基因干涉系統的生物學現象是否有改變，從而證明該基因的功能。(2)以BmPGRP2基因的特異序列作為靶標，如SEQ ID NO: 1所示，設計轉基因干涉弓丨物，正向片段上游弓丨物為Sense-F 5' _ggaattcatcttcagattaatagaacacag_3'，下游弓| 物為 Sense-R 5' - cgggatccttagttttcactttcgatcat-3，，反向片段上游弓丨物為 Anti-F 5 ‘_ccaagcttttagttttcactttcgatcat_3',下游弓I物為 Anti-R 5' -gctctagaatcttcagattaa tagaacacag-3'。以克隆的汝 /基因的⑶S質粒為模板進行PCR擴增，PCR反應條件為 94°C預變性4分鐘，然后94°C變性40秒、48°C退火40秒、72°C延伸15秒，共30個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；對擴增出的正反向互補片段分別進行回收、連接和轉化，篩選陽性克隆后測序。(2 )將正向片段BmPGRP2_S用EcoR I和BamH /進行雙酶切，經瓊脂糖電泳鑒定并回收，得BmPGRP2-S酶切片段，同時用I琳BamH /雙酶切已經包含家蠶肌動蛋白Actin 3內含子的pMD-19載體，經瓊脂糖電泳鑒定并回收，得pMD_19 載體酶切片段，將BmPGRP2-S酶切片段和pMD_19載體酶切片段進行連接轉化，篩選陽性克隆，得到pMD-19-BmPGRP2-S-A3intron載體；將反向互補片段BmPGRP2_A和 pMD-19-BmPGRP2-S-A3intron載體分別用Hind ///和Xba I進行雙酶切，回收目的條帶后連接轉化，篩選陽性克隆,得到pMD-19-BmPGRP2-S-A3intron- BmPGRP2-A載體。(3)將已經包含IEl啟動子和SV40終止信號的L4440載體和 T-19-BmPGRP2-S-A3intron- BmPGRP2_A 分別用 EcoR I 和 Xba I 進行雙酶切，回收目的條帶后連接轉化，篩選陽性克隆，得到 L4440-IElP-BmPGRP2-S-A3intron- BmPGRP2-A-SV40 載體，如 SEQ ID NO:6 ；將 L4440-IElP-BmPGRP2-S-A3intron- BmPGRP2-A_SV40 和 pSLfallSOfa載體分別用5 / I熱Bgl #進行雙酶切，回收目的條帶后連接轉化，篩選陽性克隆，得到 1180-IElP-BmPGRP2-S-A3intron- BmPGRP2-A_SV40 載體。
(4)將 piggyBac[3Xp3 EGFP afm]載體和 1180-IElP-BmPGRP2-S_A3intron-BmPGRP2-A-SV40分別用Asc I單酶切，回收目的條帶后連接轉化，篩選陽性克隆，得到pig gyBac [IElP-BmPGRP2-S-A3intron- BmPGRP2-A-SV40-3Xp3 EGFP afm]載體(pb_PGRP2I )， 如圖3所示。實施例4轉基因顯微注射和陽性個體的篩選
(1)將家蠶932品種蠶卵浸酸(鹽酸比重為1.073，溫度為46°C，時間為5分鐘)解除滯育以后，放于15°C和85%濕度的黑暗環(huán)境中催青30天左右直至孵化，將蟻蠶收好置于標準環(huán)境中飼養(yǎng)(溫度25°C，濕度80%)，化蛾以后將雌雄蠶蛾交配4小時，拆對后產下的蠶卵為非滯育蠶卵，用于下一步的顯微注射；
(2)將pb-PGRP2I重組載體和輔助質粒A3H混合備用。將產下的蠶卵在干凈的載玻片上排列整齊，在蠶卵產后2小時用Eppendorf顯微注射儀將混合質粒溶液注射932蠶卵中， 總注射蠶卵數為175粒。用無毒膠水封口以后置于25°C、相對濕度80%的環(huán)境中催青10天左右孵化，將孵化的陽頭GO代蟻蠶用桑葉收集飼養(yǎng)至化蛾，GO代蠶蛾通過自交或回交共獲得19蛾圈Gl代蠶卵，用Olympus 電動宏觀熒光顯微鏡觀察Gl胚胎篩選并獲得2個陽性蛾圈，轉化效率為10. 53%。實施例5 轉基因系統的抗性檢測
(1)將獲得的2個PGRP2I陽性蛾圈各自單蛾圈飼養(yǎng)，繼代擴大得到/ 基因的兩個轉基因干涉系統PGRP2I-1和PGRP2I-2 ；
(2)取轉基因干涉系統PGRP2I-1、PGRP2I-2和非轉基因932(正常932)品種，在3齡起蠶時期以半致死劑量單頭經口添食BmNPV病毒，3個系統各設置3個重復區(qū)，每個重復區(qū) 80頭蠶，同時每個系統設置3個不攻毒對照區(qū)，連續(xù)10天統計死亡率；
(3)抗性檢測結果如圖4顯示，轉基因干涉系統攻毒后的死亡率明顯低于正常932系統，其中PGRP2I-2的攻毒后死亡率降低約32%。我們通過轉基因干涉的方法降低該基因在家蠶體內的表達量，然后觀察轉基因系統的抗性是否有變化。有趣的是，抗性檢測顯示轉基因干涉系統PGRP2I對BmNPV病毒的抗性顯著提高，說明/ / ？基因是一個影響家蠶抗性的關鍵基因，可以作為家蠶轉基因抗病育種的靶標基因用于今后的分子育種工作中。最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管通過參照本發(fā)明的優(yōu)選實施例已經對本發(fā)明進行了描述，但本領域的普通技術人員應當理解，可以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。
權利要求
1.家蠶核型多角體病毒抗性關鍵基因，其特征在于，所述家蠶核型多角體病毒抗性關鍵基因為如SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列中的任一連續(xù)的21 25 bp。
2.根據權利要求1所述的家蠶核型多角體病毒抗性關鍵基因，其特征在于，所述家蠶核型多角體病毒抗性基因含有如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
3.根據權利要求1所述的家蠶核型多角體病毒抗性關鍵基因，其特征在于，所述家蠶核型多角體病毒抗性基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示。
4.含有權利要求1所述的家蠶核型多角體病毒抗性關鍵基因的重組載體。
5.根據權利要求4所述的重組載體，其特征在于，所述重組載體為含有如SEQID N0:1 所示的核苷酸序列的干擾載體。
6.根據權利要求4所述的重組載體，其特征在于，所述干擾載體為 1180-IElP-BmPGRP2-S-A3intron- BmPGRP2-A-SV40 載體，所述干擾載體為 pSLfall80fa 載體和依次連接IEl啟動子、如SEQ ID NO: 1所示的正向核苷酸序列、如SEQ ID NO: 1所示的反向互補核苷酸序列及SV40終止子的L4440載體在5 / I琳Bgl #酶切位點連接而成的重組載體，所述干擾載體的核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示。
7.根據權利要求4所述的重組載體，其特征在于，所述重組載體為piggyBaC[3Xp3 EGFP afm]載體與 1180-IElP-BmPGRP2-S-A3intron- BmPGRP2-A_SV40 載體在 Asc / 酶切位點連接而成。
8.權利要求1所述的家蠶核型多角體病毒抗性關鍵基因的制備方法，其特征在于1)以如SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列作為靶標，設計轉基因干涉引物，正向片段上游弓丨物為 F :5，- ggaattcatcttcagattaatagaacacag- 3，，下游弓丨物為 R :5， -cgggatccttagttttcactttcgatcat- 3’，以克隆的如 SEQ ID NO: 2 所示的汝 /基因的質粒為模板進行PCR擴增，PCR反應條件為94°C預變性4分鐘，然后94°C變性40秒、48°C 退火40秒、72°C延伸15秒，共30個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘，得如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列；或 2、BmPGRP2 的正向引物 F :5，-ATGAAGAGTGATGGTGATGAAAAT- 3，，反向引物 R:5' -TTAGTTTTCACTTTCGATCATTGC- 3'，以家蠶的全蠶或組織cDNA為模板進行擴增，PCR反應條件為94°C預變性4分鐘，然后94°C變性40秒、48°C退火40秒、72°C延伸1分鐘，共30 個循環(huán)，最后72°C延伸10分鐘；得如SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列。
9.權利要求1-3任一項所述的家蠶核型多角體病毒抗性關鍵基因在調控核型多角體病毒抗性中的應用。
10.權利要求4所述的重組載體在調控核型多角體病毒抗性中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物基因工程領域，特別涉及到家蠶的抗性關鍵基因，家蠶核型多角體病毒抗性關鍵基因，如SEQIDNO:1所示，及含有家蠶核型多角體病毒抗性基因的重組載體，其可在調控核型多角體病毒抗性中起到關鍵作用；通過同源比對發(fā)現該基因是一個新基因；通過RT-PCR和定量PCR對該基因的時期組織表達譜進行了檢測，檢測結果表明該基因的表達量非常低；為了研究該基因的功能，以該基因的特異序列作為干涉靶標，構建了轉基因干涉載體；通過轉基因顯微注射，篩選得到轉基因陽性個體；以該基因作為干涉靶標的轉基因家蠶對BmNPV病毒的抗性顯著提高，說明該基因是一個影響家蠶對病毒抗性的關鍵基因，因此該基因在家蠶轉基因抗病育種的研究和應用中具有重要價值。
文檔編號C12N15/12GK102433340SQ20111037919
公開日2012年5月2日 申請日期2011年11月25日 優(yōu)先權日2011年11月25日
發(fā)明者夏慶友, 徐漢福, 王根洪, 程廷才, 蔣亮, 金盛凱, 陸改 申請人:西南大學