專利名稱：一種新型食品防腐劑抗菌肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)食品防腐劑的方法，具體的說是一種新型食品防腐劑抗菌肽的制備方法。
背景技術(shù)：
在食品工業(yè)中，各類食品的防腐保鮮始終是一個(gè)亟待解決的重要問題，據(jù)估計(jì)，我國每年約有20% 30%的食物因食物腐敗而遭到嚴(yán)重的損失。食品腐敗變質(zhì)不僅降低食品的營養(yǎng)價(jià)值，嚴(yán)重時(shí)還會造成食物中毒。食品腐敗的原因有多方面，包括物理、化學(xué)、酶及微生物四個(gè)方面的因素，其中微生物作用最為嚴(yán)重。食品在加工、保藏、消費(fèi)過程中容易受到細(xì)菌、酵母菌、霉菌等一系列微生物的侵染，這就決定了食品防腐劑在食品工業(yè)中將發(fā)揮至關(guān)重要的作用。通過防腐劑抑制或殺滅微生物，可以起到阻止、延緩食品的變質(zhì)，甚至提高食品的品質(zhì)的作用。為了延長食品的保藏期限，人們在食品加工過程中采用不同的手段使微生物喪失活性，延緩或阻止其生長。添加防腐劑是其中一種使用方便、非常有效的食品防腐方法，因而被普遍采用。食品防腐劑一般分為合成防腐劑和天然防腐劑，過去人們大都使用合成防腐劑，如苯甲酸、山梨酸及其鹽類、對羥基苯甲酸脂類等。而人工合成的防腐劑具有誘發(fā)癌癥的發(fā)生、致使出現(xiàn)畸形嬰幼兒和引起食物中毒等問題，同時(shí)人工防腐劑中的苯甲酸鹽能夠引起食物中毒，而亞硝酸鹽和硝酸鹽容易造成癌癥的發(fā)生。
隨著生活水平的提高，人們對防腐劑的要求也越來越高，不但要求防腐劑安全、無毒，而且要求防腐劑營養(yǎng)化和功能化。天然防腐劑具有抗菌性強(qiáng)、安全無毒、水溶性及熱穩(wěn)定性好、作用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，而且還具有一定的營養(yǎng)價(jià)值，但是目前天然防腐劑的合成方法復(fù)雜，不易合成。
抗菌肽是生物在長期進(jìn)化過程中為適應(yīng)環(huán)境、求得生存而產(chǎn)生的免疫活性分子， 具有選擇性效應(yīng)，分子質(zhì)量小、無抗原性，被認(rèn)為是天然免疫的重要介質(zhì)。抗菌肽在宿主對抗病原入侵的免疫防御中起著極其重要的作用，因此被形象地稱為“天然抗菌劑”或“陽離子宿主防御肽”，是重要的分子屏障。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對上述問題，提供了一種新型食品防腐劑抗菌肽的制備方法，其制備方法簡單，操作方便等優(yōu)點(diǎn)，保存食品時(shí)所需劑量低、效果明顯。
本發(fā)明涉及到以下菌種和試劑巴斯德畢赤酵母X-33菌和大腸桿菌JM109為普通未變異的巴斯德畢赤酵母X-33菌和大腸桿菌JM109，通過實(shí)驗(yàn)室提取或市場購買均能得到，而本發(fā)明中的巴斯德畢赤酵母 X-33菌購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心和大腸桿菌JM109購于中國普通微生物菌種保藏管理中心；所述的載體為酵母表達(dá)載體PPICZ-α-A，在市場上即可購買得到，在本發(fā)明中酵母表達(dá)載體pPICZ- α -A購于上海英俊生物技術(shù)有限公司，其產(chǎn)品為(GLD195)；DNA凝膠回收試劑盒購買于碧云天生物技術(shù)研究所，該試劑盒中自配有成品的DNA純化結(jié)合液，洗滌液，洗脫液，DNA純化柱，收集管；
限制性內(nèi)切酶》ιο I、限制性內(nèi)切酶Xba I、限制性內(nèi)切酶BamH I緩沖液、T4DNA連接酶、10倍T4DNA連接酶緩沖液、限制性內(nèi)切酶勒·/ II、10倍限制性內(nèi)切酶勒·/ II緩沖液、限制性內(nèi)切酶Mc I和10倍限制性內(nèi)切酶Mc I緩沖液購買于大連寶生物工程有限公司；
濃度為2. 5mmol的三磷酸脫氧核糖核苷混合液、10倍PCR緩沖液、濃度為25mmol Mg2+ 的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶購買于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；
通用鑒定引物5’ AOX和引物3’ AOX購買于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；
一種新型食品防腐劑抗菌肽的制備方法，
步驟一、抗菌肽Metnikowin- II H基因的設(shè)計(jì)與合成
1)根據(jù)全球公共序列數(shù)據(jù)庫Genebank中記載序列號為P80409的抗菌肽 Metnikowin- II的核苷酸序列為模板，在抗菌肽Metni kowin- II的核苷酸序列后端加入6個(gè)組氨酸，即加入6個(gè)cat的核苷酸序列，形成抗菌肽Metnikowin- II H，以抗菌肽Metnikowin- II H的核苷酸序列為模板，依據(jù)畢赤酵母的偏嗜性，分別在抗菌肽 Metnikowin- II H基因的前端加入限制性內(nèi)切酶xho 的酶切位點(diǎn)，后端加入限制性內(nèi)切酶 Xba I的酶切位點(diǎn)，并在限制性內(nèi)切酶)(ba I的酶切位點(diǎn)前端加入終止密碼子UAA，將設(shè)計(jì)好的核苷酸序列進(jìn)行合成；
其中抗菌肽Metnikowin- II H的核苷酸序列為
GTTGATAAACCAGATCTTAGACCAAGACCATGGCCAAGACCAAATcatcatcatcatcatcat 將抗菌肽Metnikowin- II H的核苷酸翻譯為氨基酸，抗菌肽Metnikowin- II H的氨基酸序列為
VDKPDLRPRPffPRPNHHHHHH
步驟二、抗菌肽Metnikowin- II H基因的酶切、回收
1)酶切體系的配制在0.5ml離心管a中加入8. Ομ 抗菌肽Metnikowin- II H基因、 0. 5μ1限制性內(nèi)切酶)(ho I、0·5μ1限制性內(nèi)切酶)(ba 1,2. Ομ 限制性內(nèi)切酶緩沖液和 9. Ομ 去離子水，混合均勻，形成混合物Α，將混合物A放入37° C水浴鍋中，反應(yīng)3小時(shí)，取出，備用；
2)利用瓊脂糖凝膠電泳對混合物A進(jìn)行檢測
利用瓊脂糖凝膠電泳檢測混合物Α，在凝膠成像系統(tǒng)中確認(rèn)混合物A中含有酶切后的抗菌肽Metnikowin- II H基因的目的基因；
3)用DNA凝膠回收試劑盒對酶切后的抗菌肽Metnikowin-II H基因進(jìn)行回收、純化 取1. 5ml離心管a并稱其重量，在紫外燈下將混合物A從步驟2)中的凝膠上切下，將
切下的混合物A放在已稱重的1. 5ml離心管a中，稱取1. 5ml離心管a的總重并計(jì)算出從凝膠上切下來的混合物A的重量，將1. 5ml離心管a中的混合物A搗碎，按每g混合物A 加入ImlDNA純化結(jié)合液的比例加入DNA純化結(jié)合液，混合均勻，將1. 5ml離心管a放置在 50° C水浴中加熱至混合物A完全融解，得到混合液A，將混合液A加入到DNA純化柱a上， DNA純化柱a位于收集管a內(nèi)，將收集管a置于21°C條件下放置1分鐘，后將收集管a放到離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘后，取出含有沉淀的DNA純化柱a，倒掉收集管a內(nèi)的液體，向DNA純化柱a上加入700 μ 1洗滌液，將DNA純化柱a置于收集管a內(nèi)，將收集管a在21°C條件下放置1分鐘，后將收集管a送入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘， 離心1分鐘后，取出含有沉淀的DNA純化柱a，倒掉收集管a內(nèi)的液體，向DNA純化柱a上加入500 μ 1洗滌液，將DNA純化柱a置于收集管a內(nèi)，后將收集管a放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為 12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘后，取出含有沉淀的DNA純化柱a，倒掉收集管a中的液體后， 將DNA純化柱a置于收集管a內(nèi)，再將收集管a放入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心 1分鐘，取出DNA純化柱a將其放置于1. 5ml離心管b中，后在DNA純化柱a上加入30 μ 1 洗脫液，使1. 5ml離心管b在21°C條件下放置1分鐘，后放入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱a得到1. 5ml離心管中b中的液體，該液體就是酶切、回收并純化后的抗菌肽Metnikowin- II H基因，存儲于_20°C條件下，備用；步驟三、酵母表達(dá)載體PPICZ- α -A酶切、回收1)酶切體系的配制在0.5ml離心管b中加入8. Ομ 酵母表達(dá)載體pPICZ- α -Α、0. 5μ1 限制性內(nèi)切酶》ιο I、0. 5μ1限制性內(nèi)切酶)(ba Ι、2. Ομ 限制性內(nèi)切酶緩沖液和9. Ομ 去離子水，混合均勻，形成混合物B，將混合物B放入37° C水浴鍋中，反應(yīng)3小時(shí)，取出，備用；2)利用瓊脂糖凝膠電泳對混合物B進(jìn)行檢測利用瓊脂糖凝膠電泳檢測混合物B，在凝膠成像系統(tǒng)中確認(rèn)混合物B中含有酶切后的酵母表達(dá)載體PPICZ- α -A ；3)用DNA凝膠回收試劑盒對酶切后的酵母表達(dá)載體pPICZ-α -A進(jìn)行回收、純化依據(jù)步驟二中對混合物B即酶切后的抗菌肽Metnikowin- II H基因進(jìn)行回收與純化的方法對酶切后的酵母表達(dá)載體pPICZ-α-A進(jìn)行回收與純化，將回收、純化后的酶切酵母表達(dá)載體pPICZ-α-A，存儲于_20°C條件下，備用；步驟四、抗菌肽Metnikowin- II H基因和酵母表達(dá)載體pPICZ-α -A的連接連接體系的配制在0. 5ml離心管c中加入2. Ομ 酶切酵母表達(dá)載體pPICZ-α -Α、 6. Ομ 酶切抗菌肽 Metnikowin- II H 基因、1. Ομ 的 Τ4 DNA 連接酶和 1. 0 μ 110 倍 Τ4 DNA 連接酶緩沖液，混合均勻，后將0. 5ml離心管c放在4°C條件下，放置12小時(shí)，形成混合物 C，備用；步驟五、大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化均在無菌條件下操作，大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞的制備1)在IOml離心管a中加入5mlLB液體培養(yǎng)基和一個(gè)大腸桿菌JM109單菌落，混合均勻，轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘，37°C條件下，培養(yǎng)12小時(shí)，形成混合菌液I，備用；2)在150ml三角瓶中加入Iml混合菌液I和IOOmlLB液體培養(yǎng)基，混合均勻，形成混合菌液II，轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘，37°C條件下進(jìn)行培養(yǎng)，待混合菌液II的0D600=0. 4時(shí)停止培養(yǎng)，后將含有混合菌液II的150ml三角瓶置于0°C冰水混合物中，放置10分鐘，備用；3)在1.5ml離心管c中加入步驟2)中放置后的混合菌液II 1ml，將1. 5ml離心管c送入4°C離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄去1. 5ml離心管c內(nèi)沉淀上層的液體，后在1. 5ml離心管c內(nèi)加入500μ1的4°C CaCl2溶液，濃度為0. lmol/L,混合均勻，后將1. 5ml離心管c置于0°C冰水混合物中，放置30分鐘，然后1. 5ml離心管c送入4°C離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，棄去1. 5ml離心管c內(nèi)沉淀上層的液體，再加入 200μ1的4°C CaCl2溶液，濃度為0. lmol/L，混合均勻，置于4°C條件下，放置12小時(shí)，形成大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，備用；
大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化
1)在1.5ml離心管d中加入200 μ 1大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞和10 μ 1步驟四中的混合物C，混合均勻，將1. 5ml離心管d置于0°C冰水混合物中，放置30分鐘，后取出將1. 5ml 離心管d置于42°C的水浴鍋內(nèi)，放置90秒，取出，再將1. 5ml離心管d置于0°C冰水混合物中，放置5分鐘后，取出，備用；
2)在步驟1)的1.5ml離心管d內(nèi)加入800 μ ILB液體培養(yǎng)基，混合均勻，送入37°C搖床內(nèi)，轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分鐘，離心45分鐘，后送入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為300轉(zhuǎn)/分鐘，離心30 秒，棄去1. 5ml離心管d內(nèi)沉淀上層的液體，得到沉淀物I，備用；
3)取200μ 1步驟2)中的沉淀物I，并涂布于含有濃度為5(^g/ml博來霉素的LB固體培養(yǎng)基上，放置20分鐘，后置于37°C條件下，培養(yǎng)16小時(shí)，形成培養(yǎng)菌落，備用；
步驟六、重組質(zhì)粒的篩選和酶切鑒定
1)在50ml離心管a中加入45ml含有濃度為5(^g/ml博來霉素的LB液體培養(yǎng)基和步驟五中的一個(gè)培養(yǎng)菌落，混合均勻，在37°C條件下，培養(yǎng)12小時(shí)，后將50ml離心管a送入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為300轉(zhuǎn)/分鐘，離心3秒，棄去50ml離心管a內(nèi)沉淀上層的液體，得到沉淀物II，備用；
2)在0.5ml離心管d中加入5. Oug沉淀物II、0. 5 μ 1限制性酶切酶々§·_/ II、2. 0 μ 1的 10倍限制性酶切酶ife·/ II緩沖液和12. 5 μ 1去離子水，混合均勻，形成混合物D，后將0. 5ml 離心管d送入37°C水浴鍋內(nèi)，放置3小時(shí)，備用；
3)利用瓊脂糖凝膠電泳對混合物D進(jìn)行檢測
利用瓊脂糖凝膠電泳檢測混合物D，在凝膠成像系統(tǒng)中確認(rèn)混合物D中含有酶切后的重組質(zhì)粒 pPICZ- α -Metnikowin- II H ；
將酶切后的重組質(zhì)粒pPICZ-α -Metnikowin- II H進(jìn)行序列測定，測序完成后利用生物軟件DNAstar進(jìn)行堿基序列比對、同源性分析；
步驟七、重組質(zhì)粒pPICZ-α -Metnikowin- II H的線性化
1)在0.5ml離心管e中加入混合物D即酶切后的20ug重組質(zhì)粒 pPICZ-α-Metnikowin- II Η、5μ 1限制性酶切酶&ic I、20μ 1的10倍限制性酶切酶&ic I 緩沖液和175 μ 1去離子水，混合均勻，形成混合物Ε，后將0. 5ml離心管e置于37°C水浴鍋內(nèi)，放置4小時(shí)，備用；
2)利用瓊脂糖凝膠電泳對混合物E進(jìn)行檢測
利用瓊脂糖凝膠電泳檢測混合物E，在凝膠成像系統(tǒng)中確認(rèn)混合物E中含有線性化后的重組質(zhì)粒pPICZ-α-Metnikowin- II H，其線性化后的目的片段為3600bp，備用；
3)在1.5ml離心管e中加入190μ 1混合物E即線性化的重組質(zhì)粒pPICZ-α-Metnikowin- II H、200 μ 1去離子水和390 μ 1苯酚，混合均勻，形成混合物F，后將1. 5ml離心管e送入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，得到上層澄清液體I，在1. 5ml 離心管f中加入200 μ 1上層澄清液體I和200 μ 1酚與氯仿混合液，混合均勻，后將1. 5ml 離心管f送入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，得到上層澄清液體II，在1. 5ml 離心管g中加入200 μ 1上層澄清液體II、20 μ 1濃度為3mol且pH為5. 2的NaAC和500 μ 1 的0°C無水乙醇，混合均勻，在_20°C條件下放置1小時(shí)，然后將1. 5ml離心管g送入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，棄去1. 5ml離心管g內(nèi)沉淀上層的液體，在含有沉淀的1. 5ml離心管g內(nèi)加入500 μ 1濃度為70%的乙醇，混合均勻，然后將1. 5ml離心管 g送入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，棄去1. 5ml離心管g內(nèi)沉淀上層的液體，后1. 5ml離心管g內(nèi)加入500 μ 1濃度為70%的乙醇，混合均勻，后將1. 5ml離心管g 送入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，棄去1. 5ml離心管g內(nèi)沉淀上層的液體，得到沉淀物III，在含有沉淀物III的1. 5ml離心管g中加入去離子水，形成濃度為Ιμβ/μ1 的 pPICZ- α -Metnikowin- II H 溶液，備用；步驟八、酵母菌Χ-33感受態(tài)細(xì)胞的制備1)巴斯德畢赤酵母Χ-33菌的活化在YPDS固體培養(yǎng)基中接種巴斯德畢赤酵母X-33菌，將YPDS固體培養(yǎng)基置于30°C 條件下培養(yǎng)72小時(shí)，觀察到白色單個(gè)菌落，備用；2)在無菌條件下制備巴斯德畢赤酵母X-33菌感受態(tài)細(xì)胞①在IOml離心管b中加入5ml的YPDS液體培養(yǎng)基和一個(gè)巴斯德畢赤酵母X_33菌的單菌落，混合均勻，形成混合菌液III，30°C條件下培養(yǎng)12小時(shí)，備用；②在250ml三角瓶中加入0.5ml混合菌液III和50mlYPDS液體培養(yǎng)基，混合均勻，形成混合菌液IV，30°C條件下進(jìn)行培養(yǎng)，待混合菌液IV的0D600=1. 5時(shí)停止培養(yǎng)，形成混合液B， 在50ml離心管b中加入45ml混合液B，將50ml離心管b送入4°C離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為2500 轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄去50ml離心管b內(nèi)沉淀上層的液體，后在50ml離心管b中加入 45ml去離子水，混合均勻，將50ml離心管b送入4°C離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心 5分鐘，得到沉淀，在含有沉淀的50ml離心管b內(nèi)再次加入45ml去離子水，混合均勻，然后將50ml離心管b送入4°C離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，得到沉淀物V，備用；③重復(fù)步驟②的方法一次，后在含有沉淀物V的50ml離心管b中加入IOml濃度為 Imol的0°C D-山梨醇，混合均勻，將50ml離心管b送入4°C離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，得到沉淀物VI，備用；④在含有沉淀物VI的50ml離心管b內(nèi)加入濃度為Imol的D-山梨醇，得到0D600=1. 0 的巴斯德畢赤酵母X-33菌感受態(tài)細(xì)胞，備用；步驟九、陽性重組子的制備及篩選1)在細(xì)1離心管中加入步驟七中10 μ 1濃度為l^g/的pPICZ-α - Metnikowin- II H 溶液和80 μ 10D600=1. 0的巴斯德畢赤酵母X-33菌感受態(tài)細(xì)胞，混合均勻，形成混合液C，備用；2 )在0° C條件下，將電擊杯放于濃度為70%的乙醇中，浸泡30分鐘后，取出，在電擊杯內(nèi)加入120 μ 1混合液C，將電擊杯放置5分鐘，后將電擊杯放到電轉(zhuǎn)化儀內(nèi)，進(jìn)行電擊，電脈沖為25微法，電壓為1. 5千伏，電阻為200歐姆，電擊時(shí)間為0. 05秒，電擊結(jié)束后，取出含有混合液C的電擊杯，后在電擊杯內(nèi)加入ImlD-山梨醇，混合均勻，得到混合物G，將混合物G加到1. 5ml離心管h中，將1. 5ml離心管h送入30° C搖床中，轉(zhuǎn)速為225轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)2小時(shí)后，取100 μ 1培養(yǎng)后的混合物G，并將其涂布于含有濃度為lOOPg/ml博來霉素的 YPDS固體培養(yǎng)基上，將涂布后的YPDS固體培養(yǎng)基置于30° C培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)4天，得到白色單菌落，備用；4)將步驟3)中得到的全部白色單菌落接種到MM固體培養(yǎng)基上，然后將接種后的MM固體培養(yǎng)基置于30° C的培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)3天，觀察并得到巴斯德畢赤酵母Mut+菌落，備用；
5)取步驟4)中的一個(gè)巴斯德畢赤酵母Mut+菌落，并將其接種到含有濃度為IOOOPg/ ml博來霉素的YPDS固體培養(yǎng)基上，將涂布后的YPDS固體培養(yǎng)基置于30°C的培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)3天，觀察到單個(gè)菌落，即得到的陽性重組子，備用；
步驟十、對陽性重組子進(jìn)行檢測
1)在1.5ml離心管i中加入一個(gè)陽性重組子和100 μ 1的pH為8. 0的三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶液，混合均勻，形成混合液D，在1. 5ml離心管j中加入100 μ 1混合液D，混合均勻，將1. 5ml離心管j送入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為2500轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄去 1. 5ml離心管j內(nèi)沉淀上層的液體，在1. 5ml離心管j內(nèi)加入500μ 1的PBS溶液，混合均勻， 將1. 5ml離心管j送入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為2500轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄去1. 5ml離心管j 內(nèi)沉淀上層的液體，在1. 5ml離心管j內(nèi)加入100 μ 1 pH為8. 0的三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶液，混合均勻，后將1. 5ml離心管j置于100°C沸水中，加熱10分鐘，后將加熱后的1. 5ml離心管j置于_80°C條件下，放置30分鐘，取出，再將1. 5ml離心管j置于100°C 沸水中，加熱10分鐘，取出，將1. 5ml離心管j送入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心 5分鐘，得到上層液體，即得到酵母基因組DNA，備用；
2)利用通用鑒定引物5，AOX和3，AOX對步驟7)中的酵母基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定
PCR反應(yīng)液的配制在0. 5ml離心管f中加入2. 5 μ 1酵母基因組DNA,2. 5 μ LlO倍PCR
緩沖液、1 μ 1濃度為2. 5mmol的三磷酸脫氧核糖核苷混合液、1. 5 μ 1濃度為25mmol Mg2+的 PCR緩沖液、0. 25 μ 1的引物5，Α0Χ,0. 25 μ 1的引物3，Α0Χ,0. 25 μ 1的Taq DNA聚合酶禾口 16. 75 μ 1去離子水，混合均勻，PCR反應(yīng)液，備用；
PCR程序?qū)CR反應(yīng)液放入PCR儀內(nèi)，PCR擴(kuò)增共30個(gè)循環(huán)，先94°C預(yù)變性5分鐘， 后94°C變性30秒、56°C退火30秒和72°C延伸45秒為一個(gè)循環(huán)，完成30個(gè)循環(huán)后，72°C再次延伸10分鐘，形成PCR產(chǎn)物；
利用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，在凝膠成像系統(tǒng)中確認(rèn)PCR產(chǎn)物中含有酵母基因組DNA目的片段，表明抗菌肽Metnikowin- II H基因己整合到酵母菌基因組內(nèi)，即得到含有抗菌肽Metnikowin- II H基因的酵母菌，備用；
步驟十一、陽性酵母重組子的誘導(dǎo)表達(dá)
1)取含有抗菌肽Metnikowin- II H基因的酵母菌，將其接種到5ml含有濃度為IOOPg/ ml博來霉素的YPDS液體培養(yǎng)基上，混合均勻，形成培養(yǎng)菌液a，將培養(yǎng)菌液a置于30° C條件下培養(yǎng)12小時(shí)，在50ml離心管c中加入IOml BMGY液體培養(yǎng)基和0. 2ml培養(yǎng)后的培養(yǎng)菌液a，混合均勻，形成培養(yǎng)菌液b，將培養(yǎng)菌液b置于30° C條件下，培養(yǎng)至培養(yǎng)菌液b的 0D600=5時(shí)，將50ml離心管c送入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心3分鐘，得到沉淀物VL在50ml離心管d中加入30mlBMMY液體培養(yǎng)基和IOml沉淀物VL混合均勻，形成培養(yǎng)菌液c，將培養(yǎng)菌液c置于C條件下培養(yǎng)96小時(shí)，在培養(yǎng)過程中每隔M小時(shí)添加2ml濃度為0. 5%的甲醇，培養(yǎng)結(jié)束后，將50ml離心管d送入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為8000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，得到上層澄清液體，即為表達(dá)后的抗菌肽Metnikowin- II H;
所述的載體為酵母表達(dá)載體PPICZ- α -A其產(chǎn)品為(GLD195)購于上海英俊生物技術(shù)有限公司；所述的含有濃度為5(^g/ml博來霉素的LB固體培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比培養(yǎng)基中含有1%的胰蛋白胨、0. 5%的博來霉素、0. 5%的酵母提取物、1%的氯化鈉、1. 5%的瓊脂粉，余量為水；所述的含有濃度為50μβ/πι1博來霉素的LB液體培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比培養(yǎng)基中含有1%的胰蛋白胨、0. 5%的博來霉素、0. 5%的酵母提取物、1%的氯化鈉，余量為水；所述的LB固體培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比LB固體培養(yǎng)基中含有1%的胰蛋白胨、0. 5%的酵母提取物、1%的氯化鈉、1. 5%的瓊脂粉，余量為水；所述的LB液體培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比LB液體培養(yǎng)基中含有1%的胰蛋白胨、0. 5%的酵母提取物、1%的氯化鈉，余量為水；所述PBS溶液組成成份按重量百分比PBS溶液中含有0. 8%的氯化鈉、0. 024%的磷酸二氫鉀、0. 02%的氯化鉀、0. 144%的磷酸氫二鈉，余量為水；所述三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶液的組成成份每升三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶液中含有IOmmol的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、Immol的乙二胺四乙酸，余量為水；所述的DNA純化結(jié)合液的組成成份每升DNA純化結(jié)合液中含有25mmol的葡萄糖、10 mmol的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、5mmol的乙二胺四乙酸，余量為水；所述的洗滌液的組成成份按重量百分比洗滌液中含有8%的十二烷基磺酸鈉，余量為水；所述的洗脫液的組成成份按重量百分比洗脫液中含有40%的濃度lOmol/L的乙酸鈉、 8. 5%的冰醋酸，余量為水；所述的YPDS固體培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比YPDS固體培養(yǎng)基中含有1%的酵母提取物、洲的胰蛋白胨、2%的葡萄糖、2%的瓊脂粉，余量為水；所述的YPDS液體培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比YPDS液體培養(yǎng)基中含有1%的酵母提取物、洲的胰蛋白胨、2%的葡萄糖，余量為水；所述的含有濃度為lOOPg/ml博來霉素的YPDS固體培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比培養(yǎng)基中含有1%的酵母提取物、2%的胰蛋白胨、1%的山梨糖醇、1%的博來霉素、2%的葡萄糖、2%的瓊脂粉，余量為水；所述的含有濃度為lOOOPg/ml博來霉素的YPDS固體培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比培養(yǎng)基中含有1%的酵母提取物、洲的胰蛋白胨、10%的博來霉素、洲的葡萄糖、洲的瓊脂粉，余量為水；所述的含有濃度為lOOPg/ml博來霉素的YPDS液體培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比培養(yǎng)基中含有1%的酵母提取物、2%的胰蛋白胨、1%的山梨糖醇、1%的博來霉素、2%的葡萄糖，余量為水；所述的BMMY液體培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比BMMY液體培養(yǎng)基中含有1%的酵母提取物、2%的胰蛋白胨、1. 34%的無氨基酸酵母氮源、0. 4%生物素、0. 5%甲醇、1. 0%的磷酸鹽緩沖液，余量為水；所述的BMGY液體培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比BMGY液體培養(yǎng)基中含有1%的酵母提取物、2%的胰蛋白胨、1. 34%的無氨基酸酵母氮源、0. 4%生物素、1%甘油、1. 0%的磷酸鹽緩沖液，余量為水；14所述的MM固體培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比MM固體培養(yǎng)基中含有1. 34%的無氨基酸酵母氮源、4xl0_5 %生物素、0. 5%甲醇、1. 5%的瓊脂粉，余量為水；
所述的溶液II的組成成份按重量百分比溶液II中含有0. 06%濃度為lOmmol/L的氫氧化鈉、10%的十二烷基磺酸鈉，余量為水；
所述的溶液III的組成成份按重量百分比溶液III中含有60%的濃度5 mol/L的乙酸鉀、 11. 5%的冰醋酸，余量為水；
所述的酚與氯仿混合液的組成成分按體積比酚與氯仿混合液中含有25份的酚和M 份的氯仿。有益效果
本發(fā)明提供的新型食品防腐劑抗菌肽的制備方法，該方法制備的食品防腐劑抗菌肽方法簡單，便于操作，能夠廣泛的應(yīng)用于市場，合成速度快，提高了生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。利用本發(fā)明的制備防腐劑抗菌肽的方法所制的防腐劑抗菌肽，應(yīng)用基因工程方法制備的抗菌肽Metnikowin- II H，與常用的化學(xué)防腐劑相比，安全性高，易溶于水，減少細(xì)菌感染的幾率，不被細(xì)菌所利用，熱穩(wěn)定性好，PH值穩(wěn)定性好，不易揮發(fā)。利用本發(fā)明的制備防腐劑抗菌肽的方法所制得的防腐劑抗菌肽，在人體內(nèi)能夠被人體內(nèi)自身的酶降解、消化，在人體內(nèi)不產(chǎn)生殘留；本發(fā)明所制得的防腐劑抗菌肽可以降低滅菌時(shí)的溫度、減少熱處理時(shí)間，改善食品的營養(yǎng)價(jià)值、風(fēng)味、結(jié)構(gòu)、顏色等理化性狀，從而可以降低生產(chǎn)成本；本發(fā)明所制得的防腐劑抗菌肽，其酸性、熱穩(wěn)定性和低溫貯藏性能穩(wěn)定，是一種良好的天然食品防腐保鮮劑。


圖1為表達(dá)產(chǎn)物抗菌肽Metnikowin- II H的SDS-PAGE電泳圖； 圖2為表達(dá)產(chǎn)物抗菌肽Metnikowin- II H的熱穩(wěn)定性能檢測曲線圖； 圖3為表達(dá)產(chǎn)物抗菌肽Metnikowin- II H的pH性能值檢測曲線圖4為表達(dá)產(chǎn)物抗菌肽Metnikowin- II H的蘋果果汁抑菌活性檢測圖； 圖中標(biāo)號=Marker為14. 4kD、檢測樣品為表達(dá)產(chǎn)物抗菌肽Metnikowin- II H分子量為 2. 67kD、bl為試驗(yàn)樣品s、Id2為試驗(yàn)樣品t、b3為試驗(yàn)樣品u、b4為濃度為0. 05%的山梨酸鉀。
具體實(shí)施例方式一種新型食品防腐劑抗菌肽的制備方法， 步驟一、抗菌肽Metnikowin- II H基因的設(shè)計(jì)與合成
1)根據(jù)全球公共序列數(shù)據(jù)庫Genebank中記載序列號為P80409的抗菌肽 Metnikowin- II,MET2的核苷酸序列為模板，在抗菌肽Metnikowin- II,MET2的核苷酸序列后端加入6個(gè)組氨酸，即加入6個(gè)cat的核苷酸序列，利用抗菌肽Metnikowin- II H的核苷酸序列為模板，依據(jù)畢赤酵母的偏嗜性，分別在抗菌肽Metnikowin- II H基因的前端加入限制性內(nèi)切酶xho的酶切位點(diǎn)，后端加入限制性內(nèi)切酶)(ba I的酶切位點(diǎn)，并在限制性內(nèi)切酶)(ba I的酶切位點(diǎn)前端加入終止密碼子UAA中的任意一種終止密碼子，將設(shè)計(jì)好的核苷酸序列送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行合成；其中抗菌肽Metnikowin- II H的核苷酸序列為GTTGATAAACCAGATCTTAGACCAAGACCATGGCCAAGACCAAATcatcatcatcatcatcat將抗菌肽Metnikowin- II H的核苷酸翻譯為氨基酸，抗菌肽Metnikowin- II H的氨基酸序列為VDKPDLRPRPffPRPNHHHHHH步驟二、抗菌肽Metnikowin- II H基因的酶切、回收1)酶切體系的配制在0.5ml離心管a中加入8. Ομ 抗菌肽Metnikowin- II H基因、 0. 5μ1限制性內(nèi)切酶)(ho I、0·5μ1限制性內(nèi)切酶)(ba 1,2. Ομ 限制性內(nèi)切酶緩沖液和 9. Ομ 去離子水，混合均勻，形成混合物Α，將混合物A放入37°C水浴鍋中，反應(yīng)3小時(shí)，取出，備用；2)利用瓊脂糖凝膠電泳對混合物A進(jìn)行檢測稱取0. 5克瓊脂糖粉末加到含有50毫升瓊脂糖凝膠電泳緩沖液的三角瓶中，將三角瓶內(nèi)瓊脂糖凝膠電泳緩沖液加熱至沸騰并使瓊脂糖粉末充分溶解，加入5μ 1的溴化乙錠溶液，混合均勻，后倒入瓊脂糖制膠板中，插入制膠梳，凝固后的固體稱為凝膠，拔去制膠梳， 在凝膠上出現(xiàn)一排點(diǎn)樣孔，將凝膠放入含有瓊脂糖凝膠電泳緩沖液的電泳凝膠盒中，在凝膠的點(diǎn)樣孔中分別加入5 μ 1的混合物A和2 μ IDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker，打開電泳儀開關(guān)， 在電泳儀電壓為100伏特時(shí)開始電泳，電泳30分鐘后關(guān)閉電泳儀，在凝膠成像系統(tǒng)中確認(rèn)混合物A中含有酶切后的抗菌肽Metnikowin- II H基因的目的基因；3)用DNA凝膠回收試劑盒對酶切后的抗菌肽Metnikowin-II H基因進(jìn)行回收、純化取1. 5ml離心管a并稱其重量，在紫外燈下將混合物A從步驟2)中的凝膠上切下，將切下的混合物A放在已稱重的1. 5ml離心管a中，稱取1. 5ml離心管a的總重并計(jì)算出從凝膠上切下來的混合物A的重量，然后將1. 5ml離心管a中的混合物A搗碎，加入與混合物 A等體積的DNA純化結(jié)合液，混合均勻，將1. 5ml離心管a放置在50° C水浴中加熱至混合物 A完全融解，得到混合液A，將混合液A加入到DNA純化柱a上，DNA純化柱a位于收集管a 內(nèi)，將收集管a置于21°C條件下放置1分鐘，后將收集管a放到離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/ 分鐘，離心1分鐘后，取出含有沉淀的DNA純化柱a，倒掉收集管a內(nèi)的液體，向DNA純化柱 a上加入700 μ 1洗滌液，將DNA純化柱a置于收集管a內(nèi)，將收集管a在21°C條件下放置1 分鐘，后將收集管a送入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘后，取出含有沉淀的 DNA純化柱a，倒掉收集管a內(nèi)的液體，向DNA純化柱a上加入500 μ 1洗滌液，將DNA純化柱 a置于收集管a內(nèi)，后將收集管a放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘后，取出含有沉淀的DNA純化柱a，倒掉收集管a中的液體后，將DNA純化柱a置于收集管a內(nèi)，再將收集管a放入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱a將其放置于1. 5ml離心管b中，后在DNA純化柱a上加入30 μ 1洗脫液，使1. 5ml離心管b在21°C條件下放置1分鐘，后放入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱a得到1. 5ml離心管中b中的液體，該液體就是酶切、回收并純化后的抗菌肽Metnikowin- II H 基因，存儲于_20°C條件下，備用；步驟三、酵母表達(dá)載體PPICZ- α -A酶切、回收1)酶切體系的配制在0. 5ml離心管b中加入8. Ομ 酵母表達(dá)載體pPICZ- α -Α、0. 5μ1 限制性內(nèi)切酶》ιο I、0. 5μ1限制性內(nèi)切酶)(ba Ι、2. Ομ 限制性內(nèi)切酶緩沖液和9. Ομ 去離子水，混合均勻，形成混合物B，將混合物B放入37° C水浴鍋中，反應(yīng)3小時(shí)，取出，備用；
2)利用瓊脂糖凝膠電泳對混合物B進(jìn)行檢測
依據(jù)步驟二中對酶切后的抗菌肽Metnikowin- II H基因進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測的方法對酶切后的酵母表達(dá)載體PPICZ-α-A進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，最后在凝膠成像系統(tǒng)中確認(rèn)混合物B中含有酶切后的酵母表達(dá)載體pPICZ- α -A ；
3)用DNA凝膠回收試劑盒對酶切后的酵母表達(dá)載體pPICZ-α -A進(jìn)行回收、純化
依據(jù)步驟二中對酶切后的抗菌肽Metnikowin- II H基因進(jìn)行回收與純化的方法對酶
切后的酵母表達(dá)載體pPICZ-α-A進(jìn)行回收與純化，將回收、純化后的酶切酵母表達(dá)載體 pPICZ-α -A，存儲于_20°C條件下，備用；
步驟四、抗菌肽Metnikowin- II H基因和酵母表達(dá)載體pPICZ-α-A的連接
連接體系的配制在0. 5ml離心管c中加入2. Ομ 酶切酵母表達(dá)載體pPICZ-α-A、 6. Ομ 酶切抗菌肽 Metnikowin- II H 基因、1. Ομ 的 Τ4 DNA 連接酶和 1. O μ 110 倍 Τ4 DNA 連接酶緩沖液，混合均勻，后將0. 5ml離心管c放在4°C條件下，放置12小時(shí)，形成混合物 C，備用；
步驟五、大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化
大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化均在無菌條件下操作大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞的制備
1)在IOml離心管a中加入5mlLB液體培養(yǎng)基和一個(gè)大腸桿菌JM109單菌落，混合均勻，形成混合菌液I，轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘，37°C條件下，培養(yǎng)12小時(shí)，備用；
2)在150ml三角瓶中加入Iml混合菌液I和IOOmlLB液體培養(yǎng)基，混合均勻，形成混合菌液II，轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘，37°C條件下，培養(yǎng)3小時(shí)，檢測混合菌液II的0D600值，待混合菌液II的0D600=0. 4時(shí)，后將含有混合菌液II的150ml三角瓶置于0°C冰水混合物中，放置10分鐘，備用；
3)在1.5ml離心管c中加入步驟2)中放置后的混合菌液II 1ml，將1. 5ml離心管c送入4°C離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄去1. 5ml離心管c內(nèi)沉淀上層的液體，后在1. 5ml離心管c內(nèi)加入500μ1的4°C CaCl2溶液，濃度為0. lmol/L，混合均勻，后將1. 5ml離心管c置于0°C冰水混合物中，放置30分鐘，然后1. 5ml離心管c送入4°C離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，棄去1. 5ml離心管c內(nèi)沉淀上層的液體，再加入 200μ1的4°C CaCl2溶液，濃度為0. lmol/L，混合均勻，置于4°C條件下，放置12小時(shí)，形成大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，備用；
大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化
1)在1.5ml離心管d中加入200 μ 1大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞和10 μ 1步驟四中的混合物C，混合均勻，將1. 5ml離心管d置于0°C冰水混合物中，放置30分鐘，后取出將1. 5ml 離心管d置于42°C的水浴鍋內(nèi)，放置90秒，取出，再將1. 5ml離心管d置于0°C冰水混合物中，放置5分鐘后，取出，備用；
2)在步驟1)的1.5ml離心管d內(nèi)加入800 μ ILB液體培養(yǎng)基，混合均勻，送入37°C搖床內(nèi)，轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分鐘，離心45分鐘，后送入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為300轉(zhuǎn)/分鐘，離心30 秒，棄去1. 5ml離心管d內(nèi)沉淀上層的液體，得到沉淀物I，備用；
3)取200μ 1步驟2)中的沉淀物I，并涂布于含有濃度為5(^g/ml博來霉素的LB固體培養(yǎng)基上，放置20分鐘，后置于37°C條件下，培養(yǎng)16小時(shí)，形成培養(yǎng)菌落，備用；步驟六、重組質(zhì)粒的篩選和酶切鑒定1)在50ml離心管a中加入45ml含有濃度為5(^g/ml博來霉素的LB液體培養(yǎng)基和步驟五中的一個(gè)培養(yǎng)菌落，混合均勻，在37°C條件下，培養(yǎng)12小時(shí)，后將50ml離心管a送入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為300轉(zhuǎn)/分鐘，離心3秒，棄去50ml離心管a內(nèi)沉淀上層的液體，得到沉淀物II，備用；2)在0.5ml離心管d中加入5. Oug沉淀物II、0. 5 μ 1限制性酶切酶々§·_/ II、2. 0 μ 1的 10倍限制性酶切酶ife·/ II緩沖液和12. 5 μ 1去離子水，混合均勻，形成混合物D，后將0. 5ml 離心管d送入37°C水浴鍋內(nèi)，放置3小時(shí)，備用；3)利用瓊脂糖凝膠電泳對混合物D進(jìn)行檢測稱取0. 5克瓊脂糖粉末加到含有50毫升瓊脂糖凝膠電泳緩沖液的三角瓶中，將三角瓶內(nèi)瓊脂糖凝膠電泳緩沖液加熱至沸騰并使瓊脂糖粉末充分溶解，加入5μ 1的溴化乙錠溶液，混合均勻，后倒入瓊脂糖制膠板中，插入制膠梳，凝固后的固體稱為凝膠，拔去制膠梳， 在凝膠上出現(xiàn)一排點(diǎn)樣孔，將凝膠放入含有瓊脂糖凝膠電泳緩沖液的電泳凝膠盒中，在凝膠的點(diǎn)樣孔中分別加入5 μ 1的混合物D和2 μ IDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker，打開電泳儀開關(guān)， 在電泳儀電壓為100伏特時(shí)開始電泳，電泳30分鐘后關(guān)閉電泳儀，在凝膠成像系統(tǒng)中確認(rèn)混合物D中含有酶切后的重組質(zhì)粒pPICZ-α -Metnikowin- II H ；將酶切后的重組質(zhì)粒pPICZ-α-Metnikowin- II H送至上海英俊生物技術(shù)有限公司序列測定，測序完成后利用生物軟件DNAstar進(jìn)行堿基序列比對、同源性分析；步驟七、重組質(zhì)粒pPICZ-α -Metnikowin- II H的線性化1)在0.5ml離心管e中加入20ug重組質(zhì)粒pPICZ- α -Metnikowin- II Η、5 μ 1限制性酶切酶Me I、20 μ 1的10倍限制性酶切酶Me I緩沖液和175 μ 1去離子水，混合均勻，形成混合物Ε，后將0. 5ml離心管e置于37°C水浴鍋內(nèi)，放置4小時(shí)，備用；2)利用瓊脂糖凝膠電泳對混合物E進(jìn)行檢測稱取0. 5克瓊脂糖粉末加到含有50毫升瓊脂糖凝膠電泳緩沖液的三角瓶中，將三角瓶內(nèi)瓊脂糖凝膠電泳緩沖液加熱至沸騰并使瓊脂糖粉末充分溶解，加入5μ 1的溴化乙錠溶液，混合均勻，后倒入瓊脂糖制膠板中，插入制膠梳，凝固后的固體稱為凝膠，拔去制膠梳， 在凝膠上出現(xiàn)一排點(diǎn)樣孔，將凝膠放入含有瓊脂糖凝膠電泳緩沖液的電泳凝膠盒中，在凝膠的點(diǎn)樣孔中分別加入5 μ 1的混合物E和2 μ IDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker，打開電泳儀開關(guān)， 在電泳儀電壓為100伏特時(shí)開始電泳，電泳30分鐘后關(guān)閉電泳儀，在凝膠成像系統(tǒng)中確認(rèn)混合物E中含有線性化后的重組質(zhì)粒pPICZ- α -Metnikowin- II H，其線性化后的目的片段為3600bp，備用；3)在1.5ml離心管e中加入190 μ 1線性化的重組質(zhì)粒pPICZ- α - Metnikowin- II H、 200 μ 1去離子水和390 μ 1苯酚，混合均勻，形成混合物F，后將1. 5ml離心管e送入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，得到上層澄清液體I，在1. 5ml離心管f中加入200 μ 1上層澄清液體I和200 μ 1酚與氯仿混合液，混合均勻，后將1. 5ml離心管f送入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，得到上層澄清液體II，在1. 5ml離心管g 中加入200 μ 1上層澄清液體II、20 μ 1濃度為3mol的NaAC，pH為5. 2和500 μ 1的0°C無水乙醇，混合均勻，在-20°C條件下放置1小時(shí)，然后將1. 5ml離心管g送入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，棄去1.5ml離心管i內(nèi)沉淀上層的液體，在含有沉淀的 1. 5ml離心管g內(nèi)加入500 μ 1濃度為70%的乙醇，混合均勻，然后將1. 5ml離心管g送入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，棄去1. 5ml離心管g內(nèi)沉淀上層的液體， 后1. 5ml離心管g內(nèi)加入500 μ 1濃度為70%的乙醇，混合均勻，后將1. 5ml離心管g送入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，棄去1. 5ml離心管g內(nèi)沉淀上層的液體， 得到沉淀物III，在含有沉淀物III的1. 5ml離心管g中加入去離子水，形成濃度為Ιμβ/μ1的 pPICZ-α -Metnikowin- II H 溶液，備用；
步驟八、酵母菌Χ-33感受態(tài)細(xì)胞的制備
1)巴斯德畢赤酵母Χ-33菌的活化
在YPDS固體培養(yǎng)基中接種3ug巴斯德畢赤酵母X-33菌，將YPDS固體培養(yǎng)基置于30°C 條件下培養(yǎng)72小時(shí)，觀察到白色單個(gè)菌落，備用；
2)在無菌條件下制備巴斯德畢赤酵母X-33菌感受態(tài)細(xì)胞
①在IOml離心管b中加入5ml的YPDS液體培養(yǎng)基和一個(gè)巴斯德畢赤酵母X_33菌的單菌落，混合均勻，形成混合菌液III，30°C條件下培養(yǎng)12小時(shí)，備用；
②在250ml三角瓶中加入0.5ml混合菌液III和50mlYPDS液體培養(yǎng)基，混合均勻，形成混合菌液IV，30°C條件下培養(yǎng)3小時(shí)，檢測混合菌液IV的0D600值，待0D600=1. 5時(shí)，形成混合液B，在50ml離心管b中加入45ml混合液B，將50ml離心管b送入4°C離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為2500轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄去50ml離心管b內(nèi)沉淀上層的液體，后在50ml離心管b 中加入45ml去離子水，混合均勻，將50ml離心管b送入4°C離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，得到沉淀物V，備用；
③重復(fù)步驟②的方法一次，后在含有沉淀的50ml離心管b中加入IOml濃度為Imol的 O0C D-山梨醇，混合均勻，將50ml離心管b送入4°C離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心 5分鐘，得到沉淀物VI，備用；
④在含有沉淀物VI的50ml離心管b內(nèi)加入濃度為Imol的D-山梨醇，得到0D600=1. 0 的巴斯德畢赤酵母X-33菌感受態(tài)細(xì)胞，備用；
步驟九、陽性重組子的制備及篩選
1)在4ml離心管中加入步驟七中10 μ 1濃度為 μδ/μ1的pPICZ-α -Metnikowin- II H 溶液和80 μ 10D600=1. 0的巴斯德畢赤酵母X-33菌感受態(tài)細(xì)胞，混合均勻，形成混合液C，備用；
2 )在0° C條件下，將電擊杯放于濃度為70%的乙醇中，浸泡30分鐘后，取出，在電擊杯內(nèi)加入120 μ 1混合液C，將電擊杯放置5分鐘，后將電擊杯放到電轉(zhuǎn)化儀內(nèi)，進(jìn)行電擊，電脈沖為25微法，電壓為1. 5千伏，電阻為200歐姆，電擊時(shí)間為0. 05秒，電擊結(jié)束后，取出含有混合液C的電擊杯，后在電擊杯內(nèi)加入ImlD-山梨醇，混合均勻，得到混合物G，將混合物G加到1. 5ml離心管h中，將1. 5ml離心管h送入30°C搖床中，轉(zhuǎn)速為225轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)2小時(shí)后，取100 μ 1培養(yǎng)后的混合物G，并將其涂布于含有濃度為lOOPg/ml博來霉素的 YPDS固體培養(yǎng)基上，將涂布后的YPDS固體培養(yǎng)基置于30°C培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)4天，得到白色單菌落，備用；
4)將步驟3)中的得到全部白色單菌落接種到MM固體培養(yǎng)基上，然后將接種后的MM固體培養(yǎng)基置于30° C的培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)3天，觀察并得到巴斯德畢赤酵母Mut+菌落，備用；5)取步驟4)中的一個(gè)巴斯德畢赤酵母Mut+菌落，并將其接種到含有濃度為IOOOPg/ ml博來霉素的YPDS固體培養(yǎng)基上，將涂布后的YPDS固體培養(yǎng)基置于30°C的培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)3天，觀察到單個(gè)菌落，即得到的陽性重組子，備用； 步驟十、對陽性重組子進(jìn)行檢測1)在1.5ml離心管i中加入一個(gè)陽性重組子和100 μ 1的pH為8. 0的三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶液，混合均勻，形成混合液D，在1. 5ml離心管j中加入100 μ 1混合液D，混合均勻，將1. 5ml離心管j送入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為2500轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄去 1. 5ml離心管j內(nèi)沉淀上層的液體，在1. 5ml離心管j內(nèi)加入500μ 1的PBS溶液，混合均勻， 將1. 5ml離心管j送入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為2500轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄去1. 5ml離心管j 內(nèi)沉淀上層的液體，在1. 5ml離心管j內(nèi)加入100 μ 1 pH為8. 0的三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶液，混合均勻，后將1. 5ml離心管j置于100°C沸水中，加熱10分鐘，后將加熱后的1. 5ml離心管j置于_80°C條件下，放置30分鐘，取出，再將1. 5ml離心管j置于100°C 沸水中，加熱10分鐘，取出，將1. 5ml離心管j送入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心 5分鐘，得到上層液體，即得到酵母基因組DNA，備用；2)利用通用鑒定引物5，AOX和3，AOX對步驟7)中的酵母基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定 PCR反應(yīng)液的配制在0. 5ml離心管f中加入2. 5 μ 1酵母基因組DNA,2. 5 μ LlO倍PCR緩沖液、1 μ 1濃度為2. 5mmol的三磷酸脫氧核糖核苷混合液、1. 5 μ 1濃度為25mmol Mg2+的 PCR緩沖液、0. 25 μ 1的引物5，Α0Χ,0. 25 μ 1的引物3，Α0Χ,0. 25 μ 1的Taq DNA聚合酶禾口 16. 75 μ 1去離子水，混合均勻，PCR反應(yīng)液，備用；PCR程序?qū)CR反應(yīng)液放入PCR儀內(nèi)，PCR擴(kuò)增共30個(gè)循環(huán)，先94°C預(yù)變性5分鐘， 后94°C變性30秒、56°C退火30秒和72°C延伸45秒為一個(gè)循環(huán)，完成30個(gè)循環(huán)后，72°C再次延伸10分鐘，形成PCR產(chǎn)物；稱取0. 5克瓊脂糖粉末加到含有50毫升瓊脂糖凝膠電泳緩沖液的三角瓶中，將三角瓶內(nèi)瓊脂糖凝膠電泳緩沖液加熱至沸騰并使瓊脂糖粉末充分溶解，加入5μ 1的溴化乙錠溶液，混合均勻，后倒入瓊脂糖制膠板中，插入制膠梳，凝固后的固體稱為凝膠，拔去制膠梳， 在凝膠上出現(xiàn)一排點(diǎn)樣孔，將凝膠放入含有瓊脂糖凝膠電泳緩沖液的電泳凝膠盒中，在凝膠的點(diǎn)樣孔中分別加入5 μ 1的PCR產(chǎn)物和2 μ IDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker，打開電泳儀開關(guān)， 在電泳儀電壓為100伏特時(shí)開始電泳，電泳30分鐘后關(guān)閉電泳儀，在凝膠成像系統(tǒng)中確認(rèn) PCR產(chǎn)物中含有酵母基因組DNA目的片段，表明抗菌肽Metnikowin- II H基因己整合酵母菌基因組內(nèi)，即得到含有抗菌肽Metnikowin- II H基因的酵母菌，備用； 步驟十一、陽性重組子的誘導(dǎo)表達(dá)1)取含有抗菌肽Metnikowin- II H基因的酵母菌，將其接種到5ml含有濃度為IOOPg/ ml博來霉素的YPDS液體培養(yǎng)基上，混合均勻，形成培養(yǎng)菌液a，將培養(yǎng)菌液a置于30° C條件下培養(yǎng)12小時(shí)，在50ml離心管c中加入IOml BMGY液體培養(yǎng)基和0. 2ml培養(yǎng)后的培養(yǎng)菌液a，混合均勻，形成培養(yǎng)菌液b，將培養(yǎng)菌液b置于30° C條件下，培養(yǎng)至培養(yǎng)菌液b的 0D600=5時(shí)，將50ml離心管c送入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心3分鐘，得到沉淀物VL在50ml離心管d中加入30mlBMMY液體培養(yǎng)基和IOml沉淀物VL混合均勻，形成培養(yǎng)菌液c，將培養(yǎng)菌液c置于C條件下培養(yǎng)96小時(shí)，在培養(yǎng)過程中每隔M小時(shí)添加2ml濃度為0. 5%的甲醇，培養(yǎng)結(jié)束后，將50ml離心管d送入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為8000轉(zhuǎn)/分鐘，離20心10分鐘，得到上層澄清液體，即為表達(dá)產(chǎn)物抗菌肽Metnikowin- II H;
步驟十二、對表達(dá)產(chǎn)物抗菌肽Metnikowin- II H進(jìn)行聚丙烯酰胺電泳檢測和抑菌活性
測定
1)聚丙烯酰胺電泳檢測
試劑配制在IOOml去離子水中加入48g的丙烯酰胺和1. 5g的甲叉雙丙烯酰胺，混合均勻，形成30%丙烯酰胺儲存液，備用；
在IOOml去離子水中加入47g的丙烯酰胺和2. 5g的甲叉雙丙烯酰胺，混合均勻，形成 50%丙烯酰胺儲存液，備用；
在400ml去離子水中加入121. 14g的三羥甲基氨基甲烷，混合均勻，用鹽酸將其pH值調(diào)至8. 9，定容至500ml，形成10倍正極緩沖液，備用；
在500ml去離子水中加入60. 55g的三羥甲基氨基甲烷，89. 58gN_三(羥甲基)甲基甘氨酸和5g的十二烷基磺酸鈉，混合均勻，形成10倍負(fù)極緩沖液，備用；
在400ml去離子水中加入18. 15g的三羥甲基氨基甲烷和1. 5g的十二烷基磺酸鈉，混合均勻，用鹽酸將其PH值調(diào)至8. 45，定容至500ml，形成3倍凝膠緩沖液，備用；
取0. 5ml的3倍凝膠緩沖液、0. 16ml的30%的丙烯酰胺儲存液、0. 01的10%過硫酸銨、 0. OOlml N, N，N’，N’ -四甲基乙二胺和1. 34ml去離子水，混合均勻，制的濃縮膠，備用；
取Iml的3倍凝膠緩沖液、0. 61ml的30%的丙烯酰胺儲存液、0. 01的10%過硫酸銨、 0. OOlml N, N，N’，N’ -四甲基乙二胺和1. 39ml去離子水，混合均勻，制的夾層膠，備用；
取2ml的3倍凝膠緩沖液、2ml的60%的丙烯酰胺儲存液、2. 19g的尿素、0. 01%的10% 過硫酸銨、0. OOlml N, N，N，，N，-四甲基乙二胺和0. 49ml去離子水，混合均勻，制的分離膠，
取IOOmg的考馬斯亮蘭、50ml的濃度為95%的乙醇和IOOml的濃度為85%的磷酸，混合均勻，用去離子水稀釋至IOOOml中，過濾，得到考馬斯亮蘭染液，備用；
取4 %的十二烷基磺酸鈉、12 %的甘油、50mmol/L Tris,2 %的巰基乙醇和0. 05%的溴酚藍(lán)，混合均勻，用鹽酸將其PH值調(diào)至6. 8，形成樣品緩沖液，備用；
取6ul的樣品緩沖液和:3ul的表達(dá)產(chǎn)物抗菌肽Metnikowin- II H，混合均勻，制的上樣液，備用；
聚丙烯酰胺凝膠的配制在安裝好的聚丙烯酰胺凝膠制膠板內(nèi)依次加入分離膠、夾層膠和濃縮膠，插入制膠梳，放置8小時(shí)，后凝固的固體稱為聚丙烯酰胺凝膠，拔去制膠梳， 在凝膠上出現(xiàn)一排點(diǎn)樣孔，后將聚丙烯酰胺凝膠放入含有10倍負(fù)極緩沖液的電泳凝膠內(nèi)盒中，電泳凝膠內(nèi)盒位于含有10倍正極緩沖液的電泳凝膠外盒內(nèi)，在凝膠的點(diǎn)樣孔中分別加入5 μ 1的上樣液和2 μ IDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker，打開電泳儀開關(guān)，在電泳儀電壓為 100伏特時(shí)開始電泳，電泳3小時(shí)后關(guān)閉電泳儀，后通過考馬斯亮蘭染液染色30分鐘、去離子水水洗脫色，在凝膠成像系統(tǒng)中確認(rèn)上樣液中含有表達(dá)產(chǎn)物抗菌肽Metnikowin- II H 的目的片段，表達(dá)產(chǎn)物抗菌肽Metnikowin- II H的聚丙烯酰胺凝膠檢測電泳圖中，Marker 分別為99. 4kD、62. OkD,43. OkD,31. 2kD、20. IkD和14. 4kD，檢測樣品為表達(dá)后的抗菌肽 Metnikowin- II H，其檢測分子量為 2. 67kD ；
步驟十三、對表達(dá)產(chǎn)物抗菌肽Metnikowin- II H進(jìn)行His · Bind螯合層析柱純化 1)在His · Bind螯合層析柱內(nèi)加入2. 5ml的樹脂，通過重力作用使樹脂沉降至柱膜表面后，在His -Bind螯合層析柱內(nèi)依次分別加入7. 5ml的去離子水、12. 5ml的1倍離子化緩沖液和7. 5ml的1倍結(jié)合緩沖液，去離子水、1倍離子化緩沖液和1倍結(jié)合緩沖液分別經(jīng)過 His -Bind螯合層析柱柱膜的過濾，當(dāng)1倍結(jié)合緩沖液完全通過His-Bind螯合層析柱的柱膜后，在His .Bind螯合層析柱內(nèi)加入表達(dá)產(chǎn)物抗菌肽Metnikowin- II H，流速為25毫升/ 小時(shí)，待表達(dá)產(chǎn)物抗菌肽Metnikowin- II H過柱完畢后，用15ml的1倍漂洗緩沖液洗滌一次，再用15ml的1倍洗脫緩沖液洗滌一次，收集洗滌后的1倍洗脫緩沖液，4°C保存，備用； 步驟十四、對純化后的表達(dá)產(chǎn)物抗菌肽Metnikowin- II H進(jìn)行檢測1)對純化后的表達(dá)產(chǎn)物抗菌肽Metnikowin-II H進(jìn)行熱穩(wěn)定性測定在1. 5ml離心管k、l. 5ml離心管1、1. 5ml離心管m、l. 5ml離心管n、l. 5ml離心管ο 和1.5ml離心管ρ中加入100 μ 1純化后的表達(dá)產(chǎn)物抗菌肽Metnikowin- II H，然后將6個(gè) 1. 5ml離心管分別置于100°C的水中，加熱，1. 5ml離心管k加熱5分鐘取出，形成試驗(yàn)樣品 a、l. 5ml離心管1加熱10分鐘取出，形成試驗(yàn)樣品b、l. 5ml離心管m加熱15分鐘取出，形成試驗(yàn)樣品c、1.5ml離心管η加熱20分鐘取出，形成試驗(yàn)樣品d、1.5ml離心管ο加熱30 分鐘取出，形成試驗(yàn)樣品e、l. 5ml離心管ρ加熱60分鐘取出，形成試驗(yàn)樣品f，備用；將45°C的瓊脂培養(yǎng)基溶液內(nèi)加入金黃色葡萄球菌，混合均勻，使瓊脂培養(yǎng)基溶液內(nèi)金黃色葡萄球菌的濃度為106CFU/ml，將含有金黃色葡萄球菌的瓊脂培養(yǎng)基溶液注入培養(yǎng)皿內(nèi)，瓊脂培養(yǎng)基的厚度為6cm，放置30分鐘，制的含有金黃色葡萄球菌的瓊脂培養(yǎng)基， 在瓊脂培養(yǎng)基上打7個(gè)直徑為4mm，厚度為5mm的試驗(yàn)孔，分別在7個(gè)試驗(yàn)孔內(nèi)加入試驗(yàn)樣品a、試驗(yàn)樣品b、試驗(yàn)樣品C、試驗(yàn)樣品d、試驗(yàn)樣品e、試驗(yàn)樣品f和表達(dá)產(chǎn)物抗菌肽 Metnikowin- II H，將培養(yǎng)基置于37°C培養(yǎng)內(nèi)，培養(yǎng)12小時(shí)，測量7個(gè)試驗(yàn)孔四周的抑菌圈， 并繪制抑菌圈變化曲線圖；結(jié)果顯示試驗(yàn)樣品e在100°C條件下加熱30min時(shí)，其抑菌圈為23mm，驗(yàn)樣品f在 100°C條件下加熱60min時(shí)，其抑菌圈為17mm，表明抗菌肽Metnikowin- II H經(jīng)過100°C加熱時(shí)有抑菌活性，具有熱穩(wěn)定性；2)對純化后不同pH值的表達(dá)產(chǎn)物抗菌肽Metnikowin-II H進(jìn)行不同pH值緩沖液穩(wěn)定性測定分別在11個(gè)1. 5ml離心管內(nèi)加入100 μ 1純化后的表達(dá)產(chǎn)物抗菌肽Metnikowin- II H， 然后在1. 5ml離心管q內(nèi)加入100 μ 1的pH值為1的PBS溶液，混合均勻，形成試驗(yàn)樣品g、 依照試驗(yàn)樣品g的制備方法，在剩余的1. 5ml離心管內(nèi)依次分別加入100 μ 1的pH值為2— 11的PBS溶液，混合均勻，形成試驗(yàn)樣品h、試驗(yàn)樣品i、試驗(yàn)樣品j、試驗(yàn)樣品k、試驗(yàn)樣品 1、試驗(yàn)樣品m、試驗(yàn)樣品η、試驗(yàn)樣品O、試驗(yàn)樣品P、試驗(yàn)樣品q，備用；將45。C的瓊脂培養(yǎng)基溶液內(nèi)加入金黃色葡萄球菌，混合均勻，使瓊脂培養(yǎng)基溶液內(nèi)金黃色葡萄球菌的濃度為106CFU/ml，將含有金黃色葡萄球菌的瓊脂培養(yǎng)基溶液注入培養(yǎng)皿內(nèi)，瓊脂培養(yǎng)基的厚度為6cm，放置30分鐘，制的含有金黃色葡萄球菌的瓊脂培養(yǎng)基，在瓊脂培養(yǎng)基上打13個(gè)直徑為4mm，厚度為5mm的試驗(yàn)孔，分別在13個(gè)試驗(yàn)孔內(nèi)加入試驗(yàn)樣品 g、試驗(yàn)樣品h、試驗(yàn)樣品i、試驗(yàn)樣品j、試驗(yàn)樣品k、試驗(yàn)樣品1、試驗(yàn)樣品m、試驗(yàn)樣品η、試驗(yàn)樣品O、試驗(yàn)樣品ρ和試驗(yàn)樣品q，將培養(yǎng)基置于37°C培養(yǎng)內(nèi)，培養(yǎng)12小時(shí)，測量13個(gè)試驗(yàn)孔四周的抑菌圈，并繪制抑菌圈變化曲線圖；結(jié)果顯示試驗(yàn)樣品g的抑菌圈為20mm，試驗(yàn)樣品k、試驗(yàn)樣品1和試驗(yàn)樣品m的抑菌22圈均為24mm，試驗(yàn)樣品q的抑菌圈為18mm，表明抗菌肽Metnikowin- II H在酸性溶液或是中性溶液中，其抑菌活性高，而堿性溶液其抑菌效果低；
3)對純化后的表達(dá)產(chǎn)物抗菌肽Metnikowin- II H進(jìn)行抑菌活性測定在純化后的表達(dá)產(chǎn)物抗菌肽Metnikowin- II H中加入蘋果果汁，形成含有濃度為 0. 44 μ g/ml抗菌肽Metnikowin- II H的試驗(yàn)樣品s，含有濃度為0. 87 μ g/ml抗菌肽 Metnikowin- II H的試驗(yàn)樣品t和含有濃度為1. 74 μ g/ml抗菌肽Metnikowin- II H的試驗(yàn)樣品u和濃度為0. 05%的山梨酸鉀，通過平板菌落計(jì)數(shù)法對試驗(yàn)樣品S、試驗(yàn)樣品t和試驗(yàn)樣品u進(jìn)行抑菌活性測定，計(jì)算抑菌率
結(jié)果顯示含有濃度為1. 74 μ g/ml抗菌肽Metnikowin- II H的試驗(yàn)樣品u在M小時(shí)時(shí)的抑菌率在70%，而含有濃度為0. 87 μ g/ml抗菌肽Metnikowin- II H的試驗(yàn)樣品t在M 小時(shí)時(shí)的抑菌率在60%，而含有濃度為0. 44 μ g/ml抗菌肽Metnikowin- II H的試驗(yàn)樣品t 在M小時(shí)時(shí)的抑菌率在50%，濃度為0. 05%的山梨酸鉀在M小時(shí)時(shí)的抑菌率在30%，表明濃度為1. 74 μ g/ml抗菌肽Metnikowin- II H可以抑制蘋果果汁中腐敗菌的生長；
在本發(fā)明中所述的巴斯德畢赤酵母X-33菌和大腸桿菌JM109為普通未變異的巴斯德畢赤酵母X-33菌和大腸桿菌JM109，通過實(shí)驗(yàn)室提取或市場購買均能得到；而本發(fā)明中的巴斯德畢赤酵母X-33菌購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心和大腸桿菌JM109購于中國普通微生物菌種保藏管理中心；
所述的載體為酵母表達(dá)載體PPICZ-α-A，在市場上即可購買得到，在本發(fā)明中酵母表達(dá)載體pPICZ-α-A購于上海英俊生物技術(shù)有限公司，其產(chǎn)品為(GLD195)
所述的含有濃度為5(^g/ml博來霉素的LB培養(yǎng)固體培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比含有濃度為5(^g/ml博來霉素的LB培養(yǎng)固體培養(yǎng)基中含有1%的胰蛋白胨、0. 5%的博來霉素、0. 5%的酵母提取物、1%的氯化鈉、1. 5%的瓊脂粉，余量為水；
所述的含有濃度為50μβ/πι1博來霉素的LB液體培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比含有濃度為5(^g/ml博來霉素的LB液體培養(yǎng)基中含有1%的胰蛋白胨、0. 5%的博來霉素、0. 5% 的酵母提取物、1%的氯化鈉，余量為水；
所述的LB培養(yǎng)固體培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比含有濃度為LB培養(yǎng)固體培養(yǎng)基中含有1%的胰蛋白胨、0. 5%的酵母提取物、1%的氯化鈉、1. 5%的瓊脂粉，余量為水；
所述的LB液體培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比LB液體培養(yǎng)基中含有1%的胰蛋白胨、0. 5%的酵母提取物、1%的氯化鈉，余量為水；
所述PBS溶液組成成份按重量百分比PBS溶液中含有0. 8%的氯化鈉、0. 024%的磷酸二氫鉀、0. 02%的氯化鉀、0. 144%的磷酸氫二鈉，余量為水；
所述三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶液的組成成份每升三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶液中含有IOmmol的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、Immol的乙二胺四乙酸，余量為水；
所述的DNA純化結(jié)合液的組成成份每升DNA純化結(jié)合液中含有25mmol的葡萄糖、10 mmol的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、5mmol的乙二胺四乙酸，余量為水；
所述的洗滌液的組成成份按重量百分比洗滌液中含有8%的十二烷基磺酸鈉，余量為
水；
所述的洗脫液的組成成份按重量百分比洗脫液中含有40%的濃度lOmol/L的乙酸鈉、8. 5%的冰醋酸，余量為水；
所述的YPDS固體培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比YPDS固體培養(yǎng)基中含有1%的酵母提取物、洲的胰蛋白胨、2%的葡萄糖、2%的瓊脂粉，余量為水；
所述的YPDS液體培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比YPDS液體培養(yǎng)基中含有1%的酵母提取物、2%的胰蛋白胨、2%的葡萄糖，余量為水；
所述的含有濃度為lOOPg/ml博來霉素的YPDS固體培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比含有濃度為lOOPg/ml博來霉素的YPDS固體培養(yǎng)基中含有1%的酵母提取物、2%的胰蛋白胨、1%的山梨糖醇、1%的博來霉素、2%的葡萄糖、2%的瓊脂粉，余量為水；
所述的含有濃度為50(^g/ml博來霉素的YPDS固體培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比含有濃度為50(^g/ml博來霉素的YPDS固體培養(yǎng)基中含有1%的酵母提取物、2%的胰蛋白胨、5%的博來霉素、2%的葡萄糖、2%的瓊脂粉，余量為水；
所述的含有濃度為lOOOPg/ml博來霉素的YPDS固體培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比含有濃度為lOOOPg/ml博來霉素的YPDS固體培養(yǎng)基中含有1%的酵母提取物、2%的胰蛋白胨、10%的博來霉素、2%的葡萄糖、2%的瓊脂粉，余量為水；
所述的含有濃度為lOOPg/ml博來霉素的YPDS液體培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比含有濃度為lOOPg/ml博來霉素的YPDS液體培養(yǎng)基中含有1%的酵母提取物、2%的胰蛋白胨、1%的山梨糖醇、1%的博來霉素、2%的葡萄糖，余量為水；
所述的MM固體培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比MM固體培養(yǎng)基中含有1. 34%的無氨基酸酵母氮源、4xl0_5%的生物素、0. 5%的甲醇、1. 5%的瓊脂粉，余量為水；
所述的BMMY液體培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比BMMY液體培養(yǎng)基中含有1%的酵母提取物、2%的胰蛋白胨、1. 34%的無氨基酸酵母氮源、0. 4%的生物素、0. 5%的甲醇、1. 0%的磷酸鹽緩沖液，余量為水；
所述的BMGY液體培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比BMGY液體培養(yǎng)基中含有1%的酵母提取物、洲的胰蛋白胨、1. 34%的無氨基酸酵母氮源、0. 4%的生物素、1%的甘油、1. 0%的磷酸鹽緩沖液，余量為水；
所述的瓊脂培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比瓊脂培養(yǎng)基中含有1%的蛋白胨0. 3%的牛肉膏、0. 5%的氯化鈉、1. 5—2. 0%的瓊脂，余量為水；
所述的溶液II的組成成份按重量百分比溶液II中含有0. 06%濃度為lOmmol/L的氫氧化鈉、10%的十二烷基磺酸鈉，余量為水；
所述的溶液III的組成成份按重量百分比溶液III中含有60%的濃度5 mol/L的乙酸鉀、 11. 5%的冰醋酸，余量為水；
所述酚與氯仿混合液的組成成分按體積比酚與氯仿混合液中含有25份的酚和M份的氯仿；
1倍連接緩沖液的組成成分按摩爾比每升1倍連接緩沖液中含有20mmol的三羥甲基氨基甲烷，500mmol的NaCl，5mmol的咪唑，IOmmol的甘油，余量為水；
1倍電極緩沖液的組成成分按摩爾比每升1倍電極緩沖液中含有50mmol的MCl2，余量為水。
2權(quán)利要求
1. 一種新型食品防腐劑抗菌肽的制備方法，其特征在于步驟一、抗菌肽Metnikowin- II H基因的設(shè)計(jì)與合成1)根據(jù)全球公共序列數(shù)據(jù)庫Genebank中記載序列號為P80409的抗菌肽 Metnikowin- II的核苷酸序列為模板，在抗菌肽Metni kowin- II的核苷酸序列后端加入6個(gè)組氨酸，即加入6個(gè)cat的核苷酸序列，形成抗菌肽Metnikowin- II H，以抗菌肽Metnikowin- II H的核苷酸序列為模板，依據(jù)畢赤酵母的偏嗜性，分別在抗菌肽 Metnikowin- II H基因的前端加入限制性內(nèi)切酶xho 的酶切位點(diǎn)，后端加入限制性內(nèi)切酶 Xba I的酶切位點(diǎn)，并在限制性內(nèi)切酶)(ba I的酶切位點(diǎn)前端加入終止密碼子UAA，將設(shè)計(jì)好的核苷酸序列進(jìn)行合成；其中抗菌肽Metnikowin- II H的核苷酸序列為GTTGATAAACCAGATCTTAGACCAAGACCATGGCCAAGACCAAATcatcatcatcatcatcat將抗菌肽Metnikowin- II H的核苷酸翻譯為氨基酸，抗菌肽Metnikowin- II H的氨基酸序列為VDKPDLRPRPffPRPNHHHHHH步驟二、抗菌肽Metnikowin- II H基因的酶切、回收1)酶切體系的配制在0.5ml離心管a中加入8. Ομ 抗菌肽Metnikowin- II H基因、 0. 5μ1限制性內(nèi)切酶)(ho I、0·5μ1限制性內(nèi)切酶)(ba 1,2. Ομ 限制性內(nèi)切酶緩沖液和 9. Ομ 去離子水，混合均勻，形成混合物Α，將混合物A放入37°C水浴鍋中，反應(yīng)3小時(shí)，取出，備用；2)利用瓊脂糖凝膠電泳對混合物A進(jìn)行檢測利用瓊脂糖凝膠電泳檢測混合物A，在凝膠成像系統(tǒng)中確認(rèn)混合物A中含有酶切后的抗菌肽Metnikowin- II H基因的目的基因；3)用DNA凝膠回收試劑盒對酶切后的抗菌肽Metnikowin-II H基因進(jìn)行回收、純化取1. 5ml離心管a并稱其重量，在紫外燈下將混合物A從步驟2)中的凝膠上切下，將切下的混合物A放在已稱重的1. 5ml離心管a中，稱取1. 5ml離心管a的總重并計(jì)算出從凝膠上切下來的混合物A的重量，將1. 5ml離心管a中的混合物A搗碎，按每g混合物A 加入ImlDNA純化結(jié)合液的比例加入DNA純化結(jié)合液，混合均勻，將1. 5ml離心管a放置在 50° C水浴中加熱至混合物A完全融解，得到混合液A，將混合液A加入到DNA純化柱a上， DNA純化柱a位于收集管a內(nèi)，將收集管a置于21°C條件下放置1分鐘，后將收集管a放到離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘后，取出含有沉淀的DNA純化柱a，倒掉收集管a內(nèi)的液體，向DNA純化柱a上加入700 μ 1洗滌液，將DNA純化柱a置于收集管a內(nèi)，將收集管a在21°C條件下放置1分鐘，后將收集管a送入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘， 離心1分鐘后，取出含有沉淀的DNA純化柱a，倒掉收集管a內(nèi)的液體，向DNA純化柱a上加入500 μ 1洗滌液，將DNA純化柱a置于收集管a內(nèi)，后將收集管a放入離心機(jī)中，轉(zhuǎn)速為 12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘后，取出含有沉淀的DNA純化柱a，倒掉收集管a中的液體后， 將DNA純化柱a置于收集管a內(nèi)，再將收集管a放入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心 1分鐘，取出DNA純化柱a將其放置于1. 5ml離心管b中，后在DNA純化柱a上加入30 μ 1 洗脫液，使1. 5ml離心管b在21°C條件下放置1分鐘，后放入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速13000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱a得到1. 5ml離心管中b中的液體，該液體就是酶切、回收并純化后的抗菌肽Metnikowin- II H基因，存儲于_20°C條件下，備用；步驟三、酵母表達(dá)載體PPICZ- α -A酶切、回收1)酶切體系的配制在0.5ml離心管b中加入8. Ομ 酵母表達(dá)載體pPICZ- α -Α、0. 5μ1 限制性內(nèi)切酶》ιο I、0. 5μ1限制性內(nèi)切酶)(ba Ι、2. Ομ 限制性內(nèi)切酶緩沖液和9. Ομ 去離子水，混合均勻，形成混合物B，將混合物B放入37° C水浴鍋中，反應(yīng)3小時(shí)，取出，備用；2)利用瓊脂糖凝膠電泳對混合物B進(jìn)行檢測利用瓊脂糖凝膠電泳檢測混合物B，在凝膠成像系統(tǒng)中確認(rèn)混合物B中含有酶切后的酵母表達(dá)載體PPICZ- α -A ；3)用DNA凝膠回收試劑盒對酶切后的酵母表達(dá)載體pPICZ-α -A進(jìn)行回收、純化依據(jù)步驟二中對混合物B即酶切后的抗菌肽Metnikowin- II H基因進(jìn)行回收與純化的方法對酶切后的酵母表達(dá)載體pPICZ-α-A進(jìn)行回收與純化，將回收、純化后的酶切酵母表達(dá)載體pPICZ-α-Α，存儲于_20°C條件下，備用；步驟四、抗菌肽Metnikowin- II H基因和酵母表達(dá)載體pPICZ-α -A的連接連接體系的配制在0. 5ml離心管c中加入2. Ομ 酶切酵母表達(dá)載體pPICZ-α -Α、 6. Ομ 酶切抗菌肽 Metnikowin- II H 基因、1. Ομ 的 Τ4 DNA 連接酶和 1. O μ 110 倍 Τ4 DNA 連接酶緩沖液，混合均勻，后將0. 5ml離心管c放在4°C條件下，放置12小時(shí)，形成混合物 C，備用；步驟五、大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化均在無菌條件下操作，大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞的制備1)在IOml離心管a中加入5mlLB液體培養(yǎng)基和一個(gè)大腸桿菌JM109單菌落，混合均勻，轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘，37°C條件下，培養(yǎng)12小時(shí)，形成混合菌液I，備用；2)在150ml三角瓶中加入Iml混合菌液I和IOOmlLB液體培養(yǎng)基，混合均勻，形成混合菌液II，轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn)/分鐘，370C條件下進(jìn)行培養(yǎng)，待混合菌液II的0D600=0. 4時(shí)停止培養(yǎng)，后將含有混合菌液II的150ml三角瓶置于0°C冰水混合物中，放置10分鐘，備用；3)在1.5ml離心管c中加入步驟2)中放置后的混合菌液II 1ml，將1. 5ml離心管c送入4°C離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄去1. 5ml離心管c內(nèi)沉淀上層的液體，后在1.5ml離心管c內(nèi)加入500μ1的4°C CaCl2溶液，濃度為0. lmol/L，混合均勻，后將1. 5ml離心管c置于0°C冰水混合物中，放置30分鐘，然后1. 5ml離心管c送入4°C離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為4000轉(zhuǎn)/分鐘，離心1分鐘，棄去1. 5ml離心管c內(nèi)沉淀上層的液體，再加入 200μ1的4°C CaCl2溶液，濃度為0. lmol/L，混合均勻，置于4°C條件下，放置12小時(shí)，形成大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，備用；大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化1)在1.5ml離心管d中加入200 μ 1大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞和10 μ 1步驟四中的混合物C，混合均勻，將1. 5ml離心管d置于0°C冰水混合物中，放置30分鐘，后取出將1. 5ml 離心管d置于42°C的水浴鍋內(nèi)，放置90秒，取出，再將1. 5ml離心管d置于0°C冰水混合物中，放置5分鐘后，取出，備用；2)在步驟1)的1.5ml離心管d內(nèi)加入800 μ ILB液體培養(yǎng)基，混合均勻，送入37°C搖床內(nèi)，轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分鐘，離心45分鐘，后送入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為300轉(zhuǎn)/分鐘，離心30秒，棄去1. 5ml離心管d內(nèi)沉淀上層的液體，得到沉淀物I，備用；3)取200 μ 1步驟2)中的沉淀物I，并涂布于含有濃度為5(^g/ml博來霉素的LB固體培養(yǎng)基上，放置20分鐘，后置于37°C條件下，培養(yǎng)16小時(shí)，形成培養(yǎng)菌落，備用；步驟六、重組質(zhì)粒的篩選和酶切鑒定1)在50ml離心管a中加入45ml含有濃度為5(^g/ml博來霉素的LB液體培養(yǎng)基和步驟五中的一個(gè)培養(yǎng)菌落，混合均勻，在37°C條件下，培養(yǎng)12小時(shí)，后將50ml離心管a送入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為300轉(zhuǎn)/分鐘，離心3秒，棄去50ml離心管a內(nèi)沉淀上層的液體，得到沉淀物II，備用；2)在0.5ml離心管d中加入5. Oug沉淀物II、0. 5 μ 1限制性酶切酶々§·_/ II、2. 0 μ 1的 10倍限制性酶切酶ife·/ II緩沖液和12. 5 μ 1去離子水，混合均勻，形成混合物D，后將0. 5ml 離心管d送入37°C水浴鍋內(nèi)，放置3小時(shí)，備用；3)利用瓊脂糖凝膠電泳對混合物D進(jìn)行檢測利用瓊脂糖凝膠電泳檢測混合物D，在凝膠成像系統(tǒng)中確認(rèn)混合物D中含有酶切后的重組質(zhì)粒 pPICZ- α -Metnikowin- II H ；將酶切后的重組質(zhì)粒pPICZ-α -Metnikowin- II H進(jìn)行序列測定，測序完成后利用生物軟件DNAstar進(jìn)行堿基序列比對、同源性分析；步驟七、重組質(zhì)粒pPICZ-α -Metnikowin- II H的線性化1)在0.5ml離心管e中加入混合物D即酶切后的20ug重組質(zhì)粒 pPICZ- α -Metnikowin- II Η、5 μ 1限制性酶切酶Sac I、20 μ 1的10倍限制性酶切酶Sac I 緩沖液和175 μ 1去離子水，混合均勻，形成混合物Ε，后將0. 5ml離心管e置于37°C水浴鍋內(nèi)，放置4小時(shí)，備用；2)利用瓊脂糖凝膠電泳對混合物E進(jìn)行檢測利用瓊脂糖凝膠電泳檢測混合物E，在凝膠成像系統(tǒng)中確認(rèn)混合物E中含有線性化后的重組質(zhì)粒pPICZ-α-Metnikowin- II H，其線性化后的目的片段為3600bp，備用；3)在1.5ml離心管e中加入190μ 1混合物E即線性化的重組質(zhì)粒pPICZ-α-Metnikowin- II H、200 μ 1去離子水和390 μ 1苯酚，混合均勻，形成混合物F，后將1. 5ml離心管e送入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，得到上層澄清液體I，在1. 5ml 離心管f中加入200 μ 1上層澄清液體I和200 μ 1酚與氯仿混合液，混合均勻，后將1. 5ml 離心管f送入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，得到上層澄清液體II，在1. 5ml 離心管g中加入200 μ 1上層澄清液體II、20 μ 1濃度為3mol且pH為5. 2的NaAC和500 μ 1 的0°C無水乙醇，混合均勻，在_20°C條件下放置1小時(shí)，然后將1. 5ml離心管g送入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，棄去1. 5ml離心管g內(nèi)沉淀上層的液體，在含有沉淀的1. 5ml離心管g內(nèi)加入500 μ 1濃度為70%的乙醇，混合均勻，然后將1. 5ml離心管 g送入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，棄去1. 5ml離心管g內(nèi)沉淀上層的液體，后1. 5ml離心管g內(nèi)加入500 μ 1濃度為70%的乙醇，混合均勻，后將1. 5ml離心管g 送入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，棄去1. 5ml離心管g內(nèi)沉淀上層的液體，得到沉淀物III，在含有沉淀物III的1. 5ml離心管g中加入去離子水，形成濃度為Ιμβ/μ1 的 pPICZ- α -Metnikowin- II H 溶液，備用；步驟八、酵母菌Χ-33感受態(tài)細(xì)胞的制備1)巴斯德畢赤酵母X-33菌的活化在YPDS固體培養(yǎng)基中接種巴斯德畢赤酵母X-33菌，將YPDS固體培養(yǎng)基置于30°C 條件下培養(yǎng)72小時(shí)，觀察到白色單個(gè)菌落，備用；2)在無菌條件下制備巴斯德畢赤酵母X-33菌感受態(tài)細(xì)胞①在IOml離心管b中加入5ml的YPDS液體培養(yǎng)基和一個(gè)巴斯德畢赤酵母X_33菌的單菌落，混合均勻，形成混合菌液III，30°C條件下培養(yǎng)12小時(shí)，備用；②在250ml三角瓶中加入0.5ml混合菌液III和50mlYPDS液體培養(yǎng)基，混合均勻，形成混合菌液IV，30°C條件下進(jìn)行培養(yǎng)，待混合菌液IV的0D600=1. 5時(shí)停止培養(yǎng)，形成混合液B， 在50ml離心管b中加入45ml混合液B，將50ml離心管b送入4°C離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為2500 轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄去50ml離心管b內(nèi)沉淀上層的液體，后在50ml離心管b中加入 45ml去離子水，混合均勻，將50ml離心管b送入4°C離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心 5分鐘，得到沉淀，在含有沉淀的50ml離心管b內(nèi)再次加入45ml去離子水，混合均勻，然后將50ml離心管b送入4°C離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，得到沉淀物V，備用；③重復(fù)步驟②的方法一次，后在含有沉淀物V的50ml離心管b中加入IOml濃度為 Imol的0°C D-山梨醇，混合均勻，將50ml離心管b送入4°C離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，得到沉淀物VI，備用；④在含有沉淀物VI的50ml離心管b內(nèi)加入濃度為Imol的D-山梨醇，得到0D600=1. 0 的巴斯德畢赤酵母X-33菌感受態(tài)細(xì)胞，備用；步驟九、陽性重組子的制備及篩選1)在4ml離心管中加入步驟七中10μ 1濃度為l^g/μ 的pPICZ-α - Metnikowin- II H 溶液和80 μ 10D600=1. 0的巴斯德畢赤酵母X-33菌感受態(tài)細(xì)胞，混合均勻，形成混合液C，備用；2)在0°C條件下，將電擊杯放于濃度為70%的乙醇中，浸泡30分鐘后，取出，在電擊杯內(nèi)加入120 μ 1混合液C，將電擊杯放置5分鐘，后將電擊杯放到電轉(zhuǎn)化儀內(nèi)，進(jìn)行電擊，電脈沖為25微法，電壓為1. 5千伏，電阻為200歐姆，電擊時(shí)間為0. 05秒，電擊結(jié)束后，取出含有混合液C的電擊杯，后在電擊杯內(nèi)加入ImlD-山梨醇，混合均勻，得到混合物G，將混合物G加到1. 5ml離心管h中，將1. 5ml離心管h送入30°C搖床中，轉(zhuǎn)速為225轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)2小時(shí)后，取100 μ 1培養(yǎng)后的混合物G，并將其涂布于含有濃度為lOOPg/ml博來霉素的 YPDS固體培養(yǎng)基上，將涂布后的YPDS固體培養(yǎng)基置于30° C培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)4天，得到白色單菌落，備用；4)將步驟3)中得到的全部白色單菌落接種到MM固體培養(yǎng)基上，然后將接種后的MM固體培養(yǎng)基置于30° C的培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)3天，觀察并得到巴斯德畢赤酵母Mut+菌落，備用；5)取步驟4)中的一個(gè)巴斯德畢赤酵母Mut+菌落，并將其接種到含有濃度為IOOOPg/ ml博來霉素的YPDS固體培養(yǎng)基上，將涂布后的YPDS固體培養(yǎng)基置于30°C的培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)3天，觀察到單個(gè)菌落，即得到的陽性重組子，備用；步驟十、對陽性重組子進(jìn)行檢測1)在1. 5ml離心管i中加入一個(gè)陽性重組子和100 μ 1的pH為8. 0的三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶液，混合均勻，形成混合液D，在1. 5ml離心管j中加入100 μ 1混合液D，混合均勻，將1. 5ml離心管j送入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為2500轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄去 1. 5ml離心管j內(nèi)沉淀上層的液體，在1. 5ml離心管j內(nèi)加入500μ 1的PBS溶液，混合均勻， 將1. 5ml離心管j送入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為2500轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄去1. 5ml離心管j 內(nèi)沉淀上層的液體，在1. 5ml離心管j內(nèi)加入100 μ 1 pH為8. 0的三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶液，混合均勻，后將1. 5ml離心管j置于100°C沸水中，加熱10分鐘，后將加熱后的1. 5ml離心管j置于_80°C條件下，放置30分鐘，取出，再將1. 5ml離心管j置于100°C 沸水中，加熱10分鐘，取出，將1. 5ml離心管j送入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為12000轉(zhuǎn)/分鐘，離心 5分鐘，得到上層液體，即得到酵母基因組DNA，備用；2)利用通用鑒定引物5，AOX和3，AOX對步驟7)中的酵母基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定 PCR反應(yīng)液的配制在0. 5ml離心管f中加入2. 5 μ 1酵母基因組DNA,2. 5 μ LlO倍PCR 緩沖液、1 μ 1濃度為2. 5mmol的三磷酸脫氧核糖核苷混合液、1. 5 μ 1濃度為25mmol Mg2+的 PCR緩沖液、0. 25 μ 1的引物5，Α0Χ,0. 25 μ 1的引物3，Α0Χ,0. 25 μ 1的Taq DNA聚合酶禾口 16. 75 μ 1去離子水，混合均勻，PCR反應(yīng)液，備用；PCR程序?qū)CR反應(yīng)液放入PCR儀內(nèi)，PCR擴(kuò)增共30個(gè)循環(huán)，先94°C預(yù)變性5分鐘， 后94°C變性30秒、56°C退火30秒和72°C延伸45秒為一個(gè)循環(huán)，完成30個(gè)循環(huán)后，72°C再次延伸10分鐘，形成PCR產(chǎn)物；利用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，在凝膠成像系統(tǒng)中確認(rèn)PCR產(chǎn)物中含有酵母基因組DNA目的片段，表明抗菌肽Metnikowin- II H基因己整合到酵母菌基因組內(nèi)，即得到含有抗菌肽Metnikowin- II H基因的酵母菌，備用； 步驟十一、陽性酵母重組子的誘導(dǎo)表達(dá)1)取含有抗菌肽Metnikowin- II H基因的酵母菌，將其接種到5ml含有濃度為IOOPg/ ml博來霉素的YPDS液體培養(yǎng)基上，混合均勻，形成培養(yǎng)菌液a，將培養(yǎng)菌液a置于30° C條件下培養(yǎng)12小時(shí)，在50ml離心管c中加入IOml BMGY液體培養(yǎng)基和0. 2ml培養(yǎng)后的培養(yǎng)菌液a，混合均勻，形成培養(yǎng)菌液b，將培養(yǎng)菌液b置于30° C條件下，培養(yǎng)至培養(yǎng)菌液b的 0D600=5時(shí)，將50ml離心管c送入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心3分鐘，得到沉淀物VL在50ml離心管d中加入30mlBMMY液體培養(yǎng)基和IOml沉淀物VL混合均勻，形成培養(yǎng)菌液c，將培養(yǎng)菌液c置于C條件下培養(yǎng)96小時(shí)，在培養(yǎng)過程中每隔24小時(shí)添加2ml濃度為0. 5%的甲醇，培養(yǎng)結(jié)束后，將50ml離心管d送入離心機(jī)內(nèi)，轉(zhuǎn)速為8000轉(zhuǎn)/分鐘，離心10分鐘，得到上層澄清液體，即為表達(dá)后的抗菌肽Metnikowin- II H;所述的含有濃度為5(^g/ml博來霉素的LB固體培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比培養(yǎng)基中含有1%的胰蛋白胨、0. 5%的博來霉素、0. 5%的酵母提取物、1%的氯化鈉、1. 5%的瓊脂粉，余量為水；所述的含有濃度為50μβ/πι1博來霉素的LB液體培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比培養(yǎng)基中含有1%的胰蛋白胨、0. 5%的博來霉素、0. 5%的酵母提取物、1%的氯化鈉，余量為水；所述的LB固體培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比LB固體培養(yǎng)基中含有1%的胰蛋白胨、0. 5%的酵母提取物、1%的氯化鈉、1. 5%的瓊脂粉，余量為水；所述的LB液體培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比LB液體培養(yǎng)基中含有1%的胰蛋白胨、0. 5%的酵母提取物、1%的氯化鈉，余量為水；所述PBS溶液組成成份按重量百分比PBS溶液中含有0. 8%的氯化鈉、0. 024%的磷酸二氫鉀、0. 02%的氯化鉀、0. 144%的磷酸氫二鈉，余量為水；所述三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶液的組成成份每升三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸溶液中含有IOmmol的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、Immol的乙二胺四乙酸，余量為水；所述的DNA純化結(jié)合液的組成成份每升DNA純化結(jié)合液中含有25mmol的葡萄糖、10 mmol的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、5mmol的乙二胺四乙酸，余量為水；所述的洗滌液的組成成份按重量百分比洗滌液中含有8%的十二烷基磺酸鈉，余量為水；所述的洗脫液的組成成份按重量百分比洗脫液中含有40%的濃度lOmol/L的乙酸鈉、 8. 5%的冰醋酸，余量為水；所述的YPDS固體培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比YPDS固體培養(yǎng)基中含有1%的酵母提取物、洲的胰蛋白胨、2%的葡萄糖、2%的瓊脂粉，余量為水；所述的YPDS液體培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比YPDS液體培養(yǎng)基中含有1%的酵母提取物、洲的胰蛋白胨、2%的葡萄糖，余量為水；所述的含有濃度為lOOPg/ml博來霉素的YPDS固體培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比培養(yǎng)基中含有1%的酵母提取物、2%的胰蛋白胨、1%的山梨糖醇、1%的博來霉素、2%的葡萄糖、2%的瓊脂粉，余量為水；所述的含有濃度為lOOOPg/ml博來霉素的YPDS固體培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比培養(yǎng)基中含有1%的酵母提取物、洲的胰蛋白胨、10%的博來霉素、洲的葡萄糖、洲的瓊脂粉，余量為水；所述的含有濃度為lOOPg/ml博來霉素的YPDS液體培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比培養(yǎng)基中含有1%的酵母提取物、2%的胰蛋白胨、1%的山梨糖醇、1%的博來霉素、2%的葡萄糖，余量為水；所述的BMMY液體培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比BMMY液體培養(yǎng)基中含有1%的酵母提取物、2%的胰蛋白胨、1. 34%的無氨基酸酵母氮源、0. 4%生物素、0. 5%甲醇、1. 0%的磷酸鹽緩沖液，余量為水；所述的BMGY液體培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比BMGY液體培養(yǎng)基中含有1%的酵母提取物、2%的胰蛋白胨、1. 34%的無氨基酸酵母氮源、0. 4%生物素、1%甘油、1. 0%的磷酸鹽緩沖液，余量為水；所述的MM固體培養(yǎng)基的組成成份按重量百分比MM固體培養(yǎng)基中含有1. 34%的無氨基酸酵母氮源、4xl0_5 %生物素、0. 5%甲醇、1. 5%的瓊脂粉，余量為水；所述的溶液II的組成成份按重量百分比溶液II中含有0. 06%濃度為lOmmol/L的氫氧化鈉、10%的十二烷基磺酸鈉，余量為水；所述的溶液III的組成成份按重量百分比溶液III中含有60%的濃度5 mol/L的乙酸鉀、 11. 5%的冰醋酸，余量為水；所述的酚與氯仿混合液的組成成分按體積比酚與氯仿混合液中含有25份的酚和M 份的氯仿。
全文摘要
一種新型食品防腐劑抗菌肽的制備方法，用限制性內(nèi)切酶xhoⅠ和限制性內(nèi)切酶XbaⅠ分別對抗菌肽Metnikowin-ⅡH基因和酵母表達(dá)載體pPICZ-α-A進(jìn)行雙酶切，將酶切后的抗菌肽Metnikowin-ⅡH基因與酵母表達(dá)載體pPICZ-α-A進(jìn)行連接，將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109內(nèi)，形成重組質(zhì)粒pPICZ-α-Metnikowin-ⅡH，利用限制性酶切酶SacⅠ將重組質(zhì)粒pPICZ-α-Metnikowin-ⅡH線性化，將線性化的重組質(zhì)粒pPICZ-α-Metnikowin-ⅡH轉(zhuǎn)入巴斯德畢赤酵母X-33菌內(nèi)，形成陽性重組子，后對陽性酵母重組子進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，得到表達(dá)后的抗菌肽Metnikowin-ⅡH；本發(fā)明方法所制備出的表達(dá)后的抗菌肽Metnikowin-ⅡH通過熱穩(wěn)定性能檢測、pH性能值檢測和蘋果果汁抑菌活性，表明制備的食品防腐劑抗菌肽具有抗菌作用且抗菌效果明顯，制備方法簡單，能夠廣泛的應(yīng)用于市場，提高了生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號C12N15/11GK102492689SQ201110379758
公開日2012年6月13日 申請日期2011年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月25日
發(fā)明者侯玉澤, 吉萍, 宮強(qiáng), 李市場, 李翔, 柴樹茂, 牛明福, 王文輝, 王臣, 秦翠麗 申請人:河南科技大學(xué)