專利名稱：一種催化二酰甘油酰基化的酶的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于酶蛋白技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種催化二酰甘油?；拿?。
背景技術(shù)：
隨著全球能源消耗量的不斷上升，能源短缺的危機(jī)越發(fā)棘手。而生物柴油由于其良好的環(huán)保性、潤(rùn)滑性及安全性，作為一種新的可再生能源逐漸受到關(guān)注。但目前阻礙生物柴油商業(yè)化的主要原因是生產(chǎn)成本高，傳統(tǒng)的生物柴油制備工藝復(fù)雜且產(chǎn)物純度低，不利于大規(guī)模生產(chǎn)；因此通過(guò)基因工程技術(shù)改造產(chǎn)油微藻成為一種必然的趨勢(shì)。而在產(chǎn)油微藻篩選實(shí)驗(yàn)中，假微型海鏈藻(T. pseudonana)的中性脂含量最高(王金娜等，2010)，而生物柴油的主要原料為中性脂，因此進(jìn)一步提高假微型海鏈藻(T. pseudonana)的含脂量，降低生物柴油的生產(chǎn)成本，具有重要意義。二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(diacylgycerol acyltransferase, DGAT)催化二酰甘油 (DAG)?；瘡亩扇８视?TAG)，是Kermey途徑的最后一步關(guān)鍵限速酶(kttlage S B, et al，JA0CS，75，7 :775-781)，對(duì)微藻的油脂合成具有重要的影響作用。近年來(lái)已發(fā)現(xiàn)該酶存在的類型為四種DGAT1、DGAT2、WS/DGAT和胞質(zhì)內(nèi)DGAT。其中前兩者蛋白主要結(jié)合在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，是一種微粒體酶，后兩者目前研究較少。目前對(duì)于假微型海鏈藻 (T. pseudonana) 二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT)的研究仍屬于空白階段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種來(lái)自于假微型海鏈藻中負(fù)責(zé)催化二酰甘油?；拿?，并可將所分離的酶用于遺傳工程來(lái)制備高產(chǎn)油微藻，以彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明提供一種催化二酰甘油?；拿?，其特征在于a、所述酶的氨基酸序列為SEQ ID NO 1 ；b、在a中的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有a中所述酶的活性的，由a衍生的酶。本發(fā)明還提供一種核苷酸，用于編碼上述的催化二酰甘油?；拿浮Ｋ龅暮塑账岬男蛄袨镾EQ ID NO :2。本發(fā)明還提供一種重組質(zhì)粒，用于表達(dá)本發(fā)明篩選出的催化二酰甘油?；拿福撝亟M質(zhì)粒攜帶的基因的序列為SEQ ID NO :2。上述的酶用于生物柴油的生產(chǎn)。本發(fā)明獲得的來(lái)自于假微型海鏈藻中負(fù)責(zé)二酰甘油?；牡鞍捉?jīng)真核表達(dá)后得到的重組蛋白相對(duì)于其他?；D(zhuǎn)移酶，具有明顯促進(jìn)擬南芥合成三酰甘油的作用，可應(yīng)用于生物柴油的生產(chǎn)。本發(fā)明的二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶可應(yīng)用于基因工程微藻的改造，能夠更好地提高工程藻的產(chǎn)油量，大大減少生物柴油的生產(chǎn)成本。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明的方法做進(jìn)一步說(shuō)明。但實(shí)例僅限于說(shuō)明，并不限于此。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通?？砂闯Ｒ?guī)條件，如J.薩姆布魯克(Sambrook) 等編寫的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件運(yùn)行。實(shí)施例1 本發(fā)明的二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因的全長(zhǎng)cDNA獲取本發(fā)明首先利用RACE技術(shù)擴(kuò)增二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因的全長(zhǎng)cDNA，具體步驟為1,3' RACE操作及序列分析總RNA的提取和cDNA合成離心獲取假微型海鏈藻的藻泥并濾干，參照 invitrogen公司Trizol抽提試劑說(shuō)明書進(jìn)行RNA提取。3'端基因片段的擴(kuò)增采用Takara 公司3' -Full RACE Core Set Ver. 2. O試劑盒進(jìn)行第一鏈的合成，得到10 μ IcDNA第一鏈產(chǎn)物。套式PCR反應(yīng)根據(jù)假微型海鏈藻二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因的核心片段設(shè)計(jì)特異性弓丨物 Si，S2(S1 :5 ‘ -ATCATATCCTCCCTCGAAG-3 ‘ SEQ ID NO 3 ；S2 5' -TTGGGTCGATCTGATATCC-3‘ SEQ ID NO 4)。取 cDNA 2 μ 1 用于 Outer PCR 反應(yīng)，體系 50 μ 1。反應(yīng)條件為 94°C 3min ；94°C 30sec,60°C 30sec，72°C 2min 共 30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0 取1st PCR產(chǎn)物Iul用于^mer PCR反應(yīng)，體系50 μ 1，反應(yīng)條件相同。擴(kuò)增得到的片段約 1500bp，取割膠回純后的DNA 2μ1用于連接反應(yīng)，體系5μ1，全部用于轉(zhuǎn)化。取200 μ 1轉(zhuǎn)化液涂板，培養(yǎng)過(guò)夜。隨機(jī)挑選10個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行鑒定，活化后送至irwitrogen公司測(cè)序鑒定。二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶3'端基因片段的序列分析生物信息學(xué)分析顯示所測(cè)的二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶3'端基因片段序列為136^p，包括終止密碼子共編碼455個(gè)氨基酸。2,5' RACE操作及序列分析總RNA的提取和cDNA合成離心獲取假微型海鏈藻藻泥并濾干，參照invitrogen 公司Trizol抽提試劑說(shuō)明書進(jìn)行RNA提取。5'端基因片段的擴(kuò)增采用Clontech公司 SMARTer RACE cDNA Amplification Kit 試劑盒進(jìn)行第一鏈的合成，得到 10 μ 1 cDNA 第
一鏈產(chǎn)物。嵌套式PCR反應(yīng)根據(jù)假微型海鏈藻二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶3'端基因片段的序列設(shè)計(jì)特異性引物 Pl，P2(P1 :5' -GGCTCCCTTCTTTGACATACCGAC-3‘ SEQ ID NO 5 ；P2 5'-CGACACCTCCGAAGCATTCCACC-3‘ SEQ ID NO :6)。取 cDNA 2μ1 用于 Outer PCR 反應(yīng)，體系 50 μ 1。反應(yīng)條件為 94°C 3min ；94°C 30sec，65°C 30sec，72°C 2min 共 30 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin0 取1st PCR產(chǎn)物Iul用于hner PCR反應(yīng)，體系50 μ 1，反應(yīng)條件相同。擴(kuò)增得到包括二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶開放閱讀框的片段約2500bp，取割膠回純后的DNA2y 1用于連接反應(yīng)，體系5μ1，全部用于轉(zhuǎn)化。取200 μ 1轉(zhuǎn)化液涂板，培養(yǎng)過(guò)夜。隨機(jī)挑選10個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行鑒定，活化后送至invitrogen公司測(cè)序鑒定。二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶5'端基因片段的序列分析生物信息學(xué)分析顯示所測(cè)的二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶5'端基因片段序列為1200bp，包括起始密碼子共編碼400個(gè)氨基酸，其中有390個(gè)堿基與3'端基因片段重疊。3、二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶全長(zhǎng)cDNA的獲取及序列分析總RNA的提取和cDNA合成離心獲取假微型海鏈藻藻泥并濾干，參照invitrogen公司Trizol抽提試劑說(shuō)明書進(jìn)行RNA提取。采用Takara公司試劑盒進(jìn)行第一鏈的合成， 得到10 μ 1 cDNA第一鏈產(chǎn)物。
DGAT全長(zhǎng)cDNA的擴(kuò)增根據(jù)二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶5 ‘端和3'端基因片段的序列設(shè)計(jì)引物E1，E2(E1 :5' -TGCGAGCTCATGGACTCTACCCCCAGCG-3' SEQID NO 7 ；E2 5' -GACG GTACCTTATAACTCGGAATGGGCAC-3 ‘ SEQ ID NO 8)。取 cDNA 2 μ 1 并用高保真酶進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，體系 50μ 1，。反應(yīng)條件為 98°C 3min ；94°C 30sec,65°C 30sec,72°C 2min 共 30 個(gè)循環(huán)； 72°C IOmin0擴(kuò)增得到包括二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶開放閱讀框的片段約2500bp，取割膠回純后的DNA 2 μ 1用于連接反應(yīng)，體系5 μ 1，全部用于轉(zhuǎn)化。取200 μ 1轉(zhuǎn)化液涂板，培養(yǎng)過(guò)夜。 隨機(jī)挑選10個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行鑒定，活化后送至invitrogen公司測(cè)序鑒定。
生物信息學(xué)分析顯示假微型海鏈藻二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因的全長(zhǎng)cDNA開放閱讀框長(zhǎng)2175bp，預(yù)測(cè)其編碼一個(gè)含7 個(gè)氨基酸殘基，核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 1所述，其對(duì)應(yīng)基因的核苷酸序列為SEQ ID NO :2。
本發(fā)明的假微型海鏈藻中負(fù)責(zé)二酰甘油酰基化的蛋白前體肽和成熟肽均可以是通過(guò)化學(xué)合成、基因重組表達(dá)獲得的產(chǎn)物。
實(shí)施例2 假微型海鏈藻二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶全長(zhǎng)cDNA的異源表達(dá)。
以真核表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)假微型海鏈藻二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶的重組蛋白，具體步驟如下
1、重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定根據(jù)假微型海鏈藻二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因的全長(zhǎng) cDNA序列，在其兩端分別弓I入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)McI和KpnI位點(diǎn)，擴(kuò)增本發(fā)明的假微型海鏈藻二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶，亞克隆進(jìn)真核表達(dá)質(zhì)粒PCAMBIA1300，測(cè)序確定為正確的插入基因載體。
2、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)，在YEB (含50mg/L卡那霉素和125mg/L利福平)平板中培養(yǎng)2-3d，篩選轉(zhuǎn)化子。挑取轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌單菌落接種于YEB液體培養(yǎng)基(含50mg/L卡那霉素和125mg/L利福平)中，28°C 220rpm搖培16小時(shí)，用菌液做PCR。 PCR 條件-MV 5min ；94°C 30sec，65°C lmin,72°C 2min，共；35 個(gè)循環(huán)；72°C IOmin 后完成擴(kuò)增。1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
3、擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化取含陽(yáng)性克隆的菌液0. Iml接至50ml新鮮YEB液體培養(yǎng)基 (含50mg/L卡那霉素和125mg/L利福平)中，28°C 220rpm培養(yǎng)2_4h，使OD值達(dá)到0. 8左右。 取上述菌液Iml于EP管中，室溫22°C 5500g，離心15min，棄去上清，用轉(zhuǎn)化介質(zhì)(V2MS大量，1 X 鐵鹽，1 X 微量，1 X 有機(jī)，5%蔗糖，0. 03% silwetL-77，20mg/L 乙酰丁香酮，0. Oyg/ ml芐氨基嘌呤(BAP)，KOH調(diào)pH值至5. 7)重懸沉淀至OD值達(dá)到0. 8左右。將待轉(zhuǎn)化的三棵擬南芥植株平放，將其花蕾部分插入2mlEP管中，加入上述轉(zhuǎn)化液后浸染5min。甩掉浸液并做上標(biāo)記。
4、轉(zhuǎn)基因擬南芥的培養(yǎng)與觀察在箱底撒水保濕，然后將花盆平放到箱子中，并用塑料袋罩住箱子暗培養(yǎng)過(guò)夜后，將擬南芥放置于塑料培養(yǎng)池內(nèi)，并澆足horgland營(yíng)養(yǎng)液使其恢復(fù)正常培養(yǎng)。同類的三棵正常擬南芥植株作為空白對(duì)照與其同條件培養(yǎng)。
5、轉(zhuǎn)基因擬南芥和空白組擬南芥種子的三酰甘油(TAG)含量分析采用對(duì)擬南芥種子的總脂進(jìn)行甲基化并進(jìn)行氣相色譜分析的方法。取擬南芥成熟種子和用刀片刮下的硅膠板上與三酰甘油標(biāo)準(zhǔn)樣對(duì)應(yīng)的TAG條帶，裝入事先盛有17:0脂肪酸內(nèi)標(biāo)的帶塞試管中。在試管中加入1.5ml硫酸甲醇溶液(5%硫酸+95%甲醇)，充氮?dú)饷芊?。將試管?5°C水浴1小時(shí)，冷卻后加入1. 5ml正戊烷和Iml水中止甲基化反應(yīng)，振蕩后2500rpm離心lOmin， 收集上清液，氮?dú)獯蹈珊蠹尤?0 μ 1重蒸的正己烷，取1 μ 1樣進(jìn)行氣相色譜分析。三酰甘油(TAG)含量計(jì)算根據(jù)氣相色譜分析結(jié)果，不同脂肪酸所對(duì)應(yīng)的峰值與17:0脂肪酸內(nèi)標(biāo)作比較計(jì)算出總脂肪酸的量，再根據(jù)三酰甘油(TAG)的分子式推算出三酰甘油(TAG)含量。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥種子中的三酰甘油含量明顯高于空白組。 本發(fā)明分離的二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶，還包括在序列為SEQ ID NO 1 ；的氨基酸中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，且具有二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶的活性，由本發(fā)明的酶衍生的酶。例如，將279位的酪氨酸替換為脯氨酸獲得的序列為SEQ ID N0:9的酶，將觀9 位的酪氨酸替換為組氨酸獲得的序列為SEQ ID NO: 10的酶，將356位的賴氨酸替換為色氨酸獲得的序列為SEQ ID NO :11的酶，將388位的色氨酸替換為蛋氨酸獲得的序列為SEQ ID NO :12的酶，將414位的酪氨酸替換為苯丙氨酸獲得的序列為SEQ ID N0:13的酶，將討3位的亮氨酸替換為半胱氨酸獲得的序列為SEQ ID NO :14的酶，將576位的谷氨酸替換為蘇氨酸獲得的序列為SEQ ID NO :15的酶，將666位的異亮氨酸替換為蛋氨酸獲得的序列為SEQ ID NO 16的酶，這些酶用實(shí)施例2中的方法進(jìn)行功能檢測(cè)，結(jié)果顯示衍生的酶也具有使轉(zhuǎn)基因擬南芥種子中的三酰甘油含量提高的功能，從而證明衍生的酶也具有序列SEQ ID NO 1酶的功能。
權(quán)利要求
1.一種催化二酰甘油?；拿?，其特征在于a、所述酶的氨基酸序列為SEQID NO 1 ；b、在a中的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，且具有a中所述酶的活性的由a衍生的酶。
2.如權(quán)利要求1所述的催化二酰甘油酰基化的酶，其特征在于所述的酶是從假微型海鏈藻中分離的。
3.一種核苷酸，其特征在于，所述的核苷酸用于編碼權(quán)利要求1所述的催化二酰甘油酰基化的酶。
4.如權(quán)利要求3所述的核苷酸，其特征在于所述的核苷酸的序列為SEQIDNO :2。
5.一種重組質(zhì)粒，用于表達(dá)權(quán)利要求1所述的催化二酰甘油酰基化的酶。
6.如權(quán)利要求5所述的重組質(zhì)粒，其攜帶的核苷酸序列為SEQID NO :2。
7.權(quán)利要求1所述的酶在生物柴油生產(chǎn)領(lǐng)域中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種催化二酰甘油?；拿?，是從假微型海鏈藻中分離的，其氨基酸序列為SEQ ID NO1。本發(fā)明獲得的來(lái)自于假微型海鏈藻中負(fù)責(zé)二酰甘油?；牡鞍捉?jīng)真核表達(dá)后得到的重組蛋白相對(duì)于其他酰基轉(zhuǎn)移酶，具有明顯促進(jìn)擬南芥合成三酰甘油的作用，可應(yīng)用于生物柴油的生產(chǎn)。本發(fā)明的二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶可應(yīng)用于基因工程微藻的改造，能夠更好地提高工程藻的產(chǎn)油量，大大減少生物柴油的生產(chǎn)成本。
文檔編號(hào)C12P7/62GK102492672SQ20111038278
公開日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2011年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月26日
發(fā)明者嚴(yán)小軍, 劉必謙, 蔣瑜 申請(qǐng)人:寧波大學(xué)