專利名稱：乙型肝炎病毒突變體、突變擴增試劑盒及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及乙型肝炎病毒的新突變、突變擴增試劑盒及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
目前全球估計有3. 5億慢性乙肝病毒(HBV)攜帶者，有三分之一的人口感染過 HBV0在我國，乙型肝炎是最為嚴重、最廣泛的傳染病之一，感染率高達60%，約有1. 2億人攜帶HBV。乙型肝炎的發(fā)病率居傳染病首位，死亡數(shù)居傳染病第三位。
根據(jù)臨床表現(xiàn)的不同HBV感染可分為多種類型無癥狀攜帶狀態(tài)，急性自限性肝炎，慢性肝炎，暴發(fā)型肝炎(fulminant h印atitits，F(xiàn)H)。母嬰傳播是HBV的重要傳播途徑，患者通常處于免疫耐受狀態(tài)的，對HBV不發(fā)生應(yīng)答，但是往往絕大部分無癥狀攜帶者會發(fā)生肝炎，甚至有一部分最終發(fā)展為ra。乙型肝炎重癥化的機制一直未明確，目前認為是由宿主免疫和病毒兩方面的作用所致。關(guān)于HBV變異和重肝的發(fā)生仍存在爭議，尚沒有一個基因變異可以作為重型乙型肝炎的標志性變異。而且大量的研究表明HBV在病人體內(nèi)時以準種形式存在的，要研究病毒突變與肝炎的關(guān)系，必須考慮到HBV的準種特性。目前大多數(shù)研究采用的PCR-克隆-測序的方法研究HBV準種。因此，找到與肝炎加重密切相關(guān)的基因位點，將會為HBV的臨床早期診斷和干預(yù)提供幫助。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供與肝炎加重密切相關(guān)的乙肝病毒突變體，突變擴增試劑盒，及應(yīng)用，為HBV的臨床早期診斷和干預(yù)提供幫助。
本發(fā)明一方面公開了一種乙型肝炎病毒(簡稱乙肝病毒或HBV)突變體，包括乙肝病毒基因組，所述乙型肝炎病毒突變體的突變發(fā)生在乙型肝炎病毒基因組序列第216位和 /或第285位，所述第216位發(fā)生的突變?yōu)閴A基T突變?yōu)镃 (216T — C)，所述第285位發(fā)生的突變?yōu)閴A基G突變?yōu)锳 (285G — A)。
較優(yōu)的，所述乙型肝炎病毒基因組的核苷酸序列選自SEQ ID NO =USEQ ID NO 10 或 SEQ ID NO :11ο
進一步的，所述乙肝病毒突變體HBV基因組序列的互補序列上，與基因組第216位對應(yīng)位點的突變?yōu)锳突變?yōu)镚，與基因組第285位對應(yīng)位點的突變?yōu)镃突變?yōu)棣场?br> 較優(yōu)的，所述乙型肝炎病毒突變體編碼的S蛋白與正常的乙肝病毒S蛋白相比，其氨基酸序列第21位和/或第44位發(fā)生突變，第21位氨基酸的突變是由亮氨酸(L)突變?yōu)榻z氨酸(S)，第44位氨基酸的突變是由甘氨酸(G)突變?yōu)楣劝彼?E)。
更優(yōu)的，所述正常的乙肝病毒S蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO :12。
MENTTSGFLGPLLVLQAGFFLLTRILTIPQSLDSWWTSLNFLGGAPTCPGQNSQSPTSNHSPTSCPPIC PGYRWMCLR
RFIIFLFILLLCLIFLLVLLDYQGMLPVCPLLPGTSTTSTGPCKTCTIPAQGTSMFPSCCCTKPSDGNCTCIPIPSSWAFARFLWEWASVRFSffLSLLVPFVQffFVGLSPTVffLSVIWMMWYffGPSLYNILSPFLPLLPIFFCLffVY I(SEQ IDNO 12)本發(fā)明第二方面公開了一種擴增乙肝病毒基因組序列第216位和觀5位基因片段的HBV突變擴增試劑盒，包括引物、dNTP、PCR緩沖液、DNA聚合酶、ddH20，所述引物包括上游引物和下游引物，所述引物特異性擴增包括乙肝病毒基因組序列第216位和第285位的基因片段。較優(yōu)的，所述DAN聚合酶為高保真DNA聚合酶；更優(yōu)的，所述高保真DNA聚合酶為 Prime Star。較優(yōu)的，PCR緩沖溶液為 5 XPrime Star buffer。較優(yōu)的，所述上游引物和下游引物序列如下
引物序列
上游弓丨物 5，-ggagcgggagcattcgg-3 ‘(SEQ IDΝ0:8)下游弓丨物 5，_ataaaacgccgcagasacatccagc3，(SEQ IDΝ0:9)
本發(fā)明試劑盒PCR體系如下
權(quán)利要求
1.一種乙型肝炎病毒突變體，包括乙肝病毒基因組，所述乙型肝炎病毒突變體的突變發(fā)生在乙型肝炎病毒基因組序列第216位和/或第285位，所述第216位發(fā)生的突變?yōu)閴A基T突變?yōu)镃，所述第285位發(fā)生的突變?yōu)閴A基G突變?yōu)锳。
2.如權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒突變體，其特征在于，所述乙型肝炎病毒基因組的核苷酸序列選自 SEQ ID NO =USEQ ID NO: 10 或 SEQ ID NO: 11。
3.如權(quán)利要求1所述的乙型肝炎病毒突變體，其特征在于，所述乙型肝炎病毒突變體編碼的S蛋白與正常的乙肝病毒S蛋白相比，其氨基酸序列第21位和/或第44位發(fā)生突變，第21位氨基酸的突變是由亮氨酸突變?yōu)榻z氨酸，第44位氨基酸的突變是由甘氨酸突變?yōu)楣劝彼帷?br> 4.如權(quán)利要求3所述的乙型肝炎病毒突變體，其特征在于，所述正常的乙肝病毒S蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO 12。
5.一種擴增乙肝病毒基因組序列第216位和觀5位基因片段的HBV突變擴增試劑盒， 包括引物、dNTP、PCR緩沖液、DNA聚合酶、ddH20，所述引物包括上游引物和下游引物，其特征在于，所述引物特異性擴增包括乙肝病毒基因組序列第216位和第285位的基因片段。
6.如權(quán)利要求5所述的HBV突變擴增試劑盒，其特征在于，所述引物序列為SEQID NO 8 9。
7.如權(quán)利要求5所述的HBV突變擴增試劑盒，其特征在于，所述DNA聚合酶為高保真 DNA聚合酶。
8.如權(quán)利要求7所述的HBV突變擴增試劑盒，其特征在于，所述高保真DNA聚合酶為 PrimeStar0
9.如權(quán)利要求5所述的HBV突變擴增試劑盒，其特征在于，所述PCR緩沖溶液為 5XPrimeStar buffer。
10.如權(quán)利要求5-9任一權(quán)利要求所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒的擴增程序為預(yù)變性 94°C 3min，然后 94°C 30s, 57°C 15s，72°C 2min 45 個循環(huán)，72°C延伸 IOmin0
11.權(quán)利要求5-10任一權(quán)利要求所述的試劑盒的使用方法，步驟如下DDNA模板的制備抽取外周靜脈血并提取HBV基因組作為DNA模板；2)PCR擴增通過權(quán)利要求5-10任一權(quán)利要求所述HBV突變擴增試劑盒，對步驟1)制備的DNA模板經(jīng)擴增程序進行PCR擴增反應(yīng)；3)純化PCR產(chǎn)物。
12.如權(quán)利要求11所述的使用方法，其特征在于，所述擴增程序為預(yù)變性94°C3min, 然后 94°C 30s, 57°C 15s，72°C 2min 45 個循環(huán)，72°C延伸 lOmin。
13.如權(quán)利要求1-4任一權(quán)利要求所述的乙型肝炎病毒突變體或權(quán)利要求5-10任一權(quán)利要求所述的HBV突變擴增試劑盒在制備重癥乙型肝炎疾病早期診斷及預(yù)防試劑中的應(yīng)用。
14.一種重癥乙型肝炎疾病早期診斷及預(yù)防的方法，為檢測對象血液中是否含有權(quán)利要求1-4任一權(quán)利要求所述的乙型肝炎病毒突變體。
15.如權(quán)利要求14所述重癥乙型肝炎疾病早期診斷及預(yù)防的方法，所述檢測對象血液中是否含有所述乙型肝炎病毒突變體的步驟如下DDNA模板的制備抽取檢驗對象外周靜脈血并提取HBV基因組作為DNA模板；2)PCR擴增將步驟1)制備的DNA模板加入到PCR反應(yīng)體系中，擴增包括乙肝病毒基因組序列第216位和第285位的基因片段；3)純化PCR產(chǎn)物；4)PCR產(chǎn)物測序?qū)⒉襟E幻純化獲得的PCR產(chǎn)物通過基因測序技術(shù)進行測序；5)結(jié)果分析將步驟4)的測序結(jié)果與SEQID NO :1、SEQ ID NO 10或SEQ ID NO 11 的序列進行比對，確認PCR產(chǎn)物對應(yīng)的乙肝病毒基因組序列第216位和/或285位是否存在突變。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，步驟2)中所述的PCR反應(yīng)體系包括引物、 dNTP、PCR緩沖液、DNA聚合酶、ddH20 ；所述引物包括上游引物和下游引物。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述引物序列為SEQID NO :8 9。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述DNA聚合酶為I^rimeStar,所述PCR 緩沖溶液為 5Xft~ime Star buffer
19.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，步驟2)中所述PCR反應(yīng)體系的擴增程序為預(yù)變性 94°C 3min，然后 94°C 30s, 57°C 15s，72°C 2min 45 個循環(huán)，72°C延伸 IOmin0
20.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，步驟4)中所述的基因測序技術(shù)為sanger 測序技術(shù)或solexa測序技術(shù)。
21.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，步驟5)中所述的PCR產(chǎn)物對應(yīng)的乙肝病毒基因組序列第216位發(fā)生的突變?yōu)閴A基T突變?yōu)镃，所述的PCR產(chǎn)物對應(yīng)的乙肝病毒基因組序列第285位發(fā)生的突變?yōu)閴A基G突變?yōu)锳。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種乙型肝炎病毒突變體、突變擴增試劑盒及應(yīng)用。本發(fā)明的HBV突變體在乙型肝炎病毒基因組序列第216位和/或第285位發(fā)生突變，所述第216位發(fā)生的突變?yōu)閴A基T突變?yōu)镃，所述第285位發(fā)生的突變?yōu)閴A基G突變?yōu)锳。這兩個突變與乙型肝炎炎癥加重密切相關(guān)。本發(fā)明還提供了檢測前述突變的HBV突變擴增試劑盒、試劑盒的使用方法及應(yīng)用，從而為重型乙肝的臨床早期診斷和干預(yù)提供幫助，為深入研究HBV基因突變引起的功能改變提供參考依據(jù)。
文檔編號C12Q1/68GK102492660SQ20111038473
公開日2012年6月13日 申請日期2011年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月28日
發(fā)明者徐航娣, 樓園華, 陳智 申請人:浙江大學(xué)