專利名稱：一種昆蟲基因檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種昆蟲基因檢測方法，更具體地涉及一種基于昆蟲卵的基因檢測方法。
背景技術(shù)：
昆蟲是動物界中無脊椎動物的節(jié)肢動物門昆蟲綱的動物，是所有生物中種類及數(shù)量最多的一群，是世界上最繁盛的動物，至今已發(fā)現(xiàn)100多萬種。昆蟲之所以能夠長久興旺的存在于地球之上，與其基因突變個體的大量存在不無關(guān)系?；蛲蛔儌€體的大量存在給昆蟲生存提供機會，但也給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來麻煩。由于昆蟲個體變異迅速，造成農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常用的農(nóng)藥在使用過程中由于抗藥性個體的迅速出現(xiàn)，而大大縮短了該種農(nóng)藥的使用壽命。 在抗蟲植物的推廣過程中也存在同樣的問題。對昆蟲基因突變個體實時監(jiān)測，有利于延長農(nóng)藥和抗蟲植物的使用年限。現(xiàn)在對昆蟲基因突變個體的監(jiān)測一般通過生物測定和分子檢測技術(shù)，相對于分子檢測，生物測定技術(shù)耗時耗力?，F(xiàn)如今的分子檢測一般通過PCR檢測或芯片技術(shù)。使用PCR 技術(shù)首先要提取昆蟲的基因組DNA，設(shè)計基因檢測引物，使用昆蟲的基因組DNA作為模板進行PCR反應(yīng)，對PCR產(chǎn)物進行分析，根據(jù)擴增片段的大小或序列測定進行昆蟲基因變異情況的判斷?；蛐酒侵竿ㄟ^微電子技術(shù)和微加工技術(shù)將大量特定序列的DNA探針(片段) 有序地固定在載體表面，從而形成貯存有大量信息的DNA芯片。與待測樣品DNA作用后，即可在短時間內(nèi)快速準(zhǔn)確地獲取樣品中的基因突變信息?；蛐酒枰獙Ｓ玫膬x器設(shè)備，價格昂貴，且對技術(shù)要求較高。這些技術(shù)都需要提取DNA，由于昆蟲卵相對較小，DNA含量低， DNA提取十分困難，所以DNA提取過程中一般使用昆蟲的幼蟲或成蟲。而提取DNA的時候要殺死昆蟲，造成該品系昆蟲無法繼續(xù)繁殖后代，影響對該品系昆蟲的其他方面研究。因此，有必要提供一種成本低、靈敏度高的用于大規(guī)模昆蟲基因檢測的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種昆蟲基因檢測方法，其使用昆蟲卵作為檢測對象，以雜交膜為載體，利用Southern雜交技術(shù)，使用標(biāo)記的目標(biāo)探針檢測昆蟲卵中的DNA。本發(fā)明所述的昆蟲基因檢測方法包括以下步驟(1)將單個或多個昆蟲卵分別破碎于雜交膜上；(2)使用裂解液處理步驟(1)獲得的雜交膜上的破碎的昆蟲卵；(3)將步驟⑵獲得的雜交膜在2 X SSC溶液中清洗；(4)將步驟(3)獲得的雜交膜烘干以固定DNA ；(5)將步驟(4)獲得的雜交膜置于雜交袋中，作標(biāo)記，將預(yù)熱的雜交液加入雜交袋中，將雜交袋內(nèi)的空氣排空并將雜交袋密封，然后將密封的雜交袋放入雜交爐中預(yù)雜交 0. 5-4小時；(6)對步驟( 獲得的雜交膜根據(jù)目標(biāo)探針標(biāo)記類型進行Southern雜交檢測。
3
上述昆蟲基因檢測方法中，步驟(1)所述雜交膜可為尼龍膜，所述多個昆蟲卵可通過施加機械壓力的方式被破碎于所述雜交膜上。步驟(2)所述的裂解液包括氯化鈉100mmol/L、Tris-HCl 10mmol/L、EDTA 50mmol/L、SDS 0.5% (w/v)、蛋白酶K 2-%ig/ml，所述裂解液的pH值為7. 4。步驟O)的處理溫度可為65°C，處理時間可為0. 5-2小時(優(yōu)選1小時)。步驟(3)所述2XSSC溶液包括氯化鈉0. 3mol/L、檸檬酸鈉0.03mol/L，所述 2XSSC溶液的pH值為7.0。步驟(3)的清洗次數(shù)可為2次，每次10分鐘，并于清洗時不斷
搖動雜交膜。步驟的烘干方式可包括以下方式的任意一種于烘箱中在120°C下烘30分鐘，在80°C下于真空中烘2小時，經(jīng)254nm紫外光照射2分鐘。步驟(5)所述的雜交液包括6XSSC，5XDenhardt，0. 5% (w/v) SDS 和 100 μ g/ml 的鮭魚精DNA，所述雜交液加入雜交袋的比例可為8-12mL/100cm2 (優(yōu)選lOmL/lOOcm2)，所述預(yù)熱溫度可為42°C，所述密封的雜交袋在雜交爐內(nèi)的預(yù)雜交溫度可為42°C。步驟(6)所述目標(biāo)探針用帶有標(biāo)記物的脫氧尿嘧啶核苷三磷酸標(biāo)記，步驟(6)包括用酶化學(xué)法檢測所述Southern雜交的結(jié)果。本發(fā)明所述的昆蟲基因檢測方法成本低、靈敏度高，可用于大規(guī)模的昆蟲DNA檢測。由于昆蟲產(chǎn)卵量十分高，且根據(jù)孟德爾遺傳規(guī)律推斷，每只雌蟲的卵中都可能有數(shù)粒遺傳基因相同的卵存在，因此，直接使用昆蟲卵作為檢測對象，就可以保證與檢測卵具有相同遺傳背景的昆蟲繼續(xù)存活，從而可以繼續(xù)繁殖，繼續(xù)對其研究。之所以能夠使用昆蟲卵作為研究對象，是因為本發(fā)明不需要直接提取昆蟲卵的DNA，而是通過特殊的裂解液直接將昆蟲卵DNA裂解到雜交膜上，這種特殊裂解液是針對昆蟲卵的特殊性，根據(jù)已有的細胞裂解液改進而來，因為尼龍膜帶有正電荷，釋放的DNA將被雜交膜直接吸附。而且本發(fā)明所使用技術(shù)是比較成熟的Southern雜交技術(shù)，成本低，對技術(shù)條件無特殊要求。使用本方法無需直接提取昆蟲卵的DNA，而是將單粒卵或多粒卵的DNA直接固定于雜交膜上，結(jié)合Southern雜交技術(shù)，使用標(biāo)記的目標(biāo)探針檢測昆蟲卵中的DNA，從而判斷該品系昆蟲中的基因變異情況。本發(fā)明僅使用昆蟲卵作為檢測對象，可以方便的進行大規(guī)模昆蟲DNA檢測。本發(fā)明使用Southern雜交技術(shù)，檢測靈敏度高，克服了昆蟲卵小、DNA難以提取的難題，且每條探針可以重復(fù)使用，大大減少了檢測成本。本發(fā)明僅用數(shù)粒昆蟲卵即可推斷出該品系昆蟲基因變異情況，不影響該品系的正
常飼養(yǎng)繁殖。總之，本發(fā)明所述的昆蟲基因檢測方法具有如下優(yōu)點1.操作簡單，結(jié)果穩(wěn)定。本發(fā)明使用的Southern雜交技術(shù)是傳統(tǒng)的分子生物學(xué)技術(shù)，技術(shù)成熟，檢測靈敏度高。2.應(yīng)用廣泛，方便大規(guī)模檢測。本發(fā)明幾乎可以檢測所有昆蟲的卵，每張雜交膜可同時檢測數(shù)百粒卵。3.成本低。本發(fā)明中所用的檢測探針可以重復(fù)利用，大大減小了檢測成本。


圖1所示為雜交膜(尼龍膜)上卵破碎位置的顏色反應(yīng)結(jié)果。
具體實施例方式下面將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的詳細描述，以使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)嵺`本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)理解，可以采用其他實施方式，并且可以做出適當(dāng)?shù)母淖兌黄x本發(fā)明的精神或范圍。為了避免對于使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)嵺`本發(fā)明來說不必要的細節(jié)，說明書可能省略了對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說已知的某些信息。因此，以下詳細描述不應(yīng)以限制性的意義來理解，且本發(fā)明的范圍僅由所附權(quán)利要求界定。實施例1使用河南安陽中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所室內(nèi)飼養(yǎng)的敏感品系棉鈴蟲所產(chǎn)的卵進行基因檢測，以對本發(fā)明的方法的靈敏性進行測試，分別使用敏感品系棉鈴蟲新產(chǎn)的卵和孵化5天的卵。具體方法如下(1)破碎使用圓頭組織研磨杵施加機械壓力使單個昆蟲卵破碎于尼龍膜上，按同樣方法使多個昆蟲卵分別破碎于尼龍膜上。并使用敏感品系棉鈴蟲DNA(從敏感品系棉鈴蟲個體提取出的DNA)作為陽性對照。(2)裂解使用裂解液于65°C的溫度下處理尼龍膜上的破碎的昆蟲卵1小時，所述裂解液包括氯化鈉 100mmol/L、Tris-HCl 1 Ommo 1/L、EDTA50mmol/L、SDS 0. 5% (w/v)、蛋白酶K 2mg/ml，所述裂解液的pH值為7. 4。(3)洗膜將處理后的尼龍膜放入2XSSC溶液(氯化鈉0. 3mol/L，檸檬酸鈉 0. 03mol/L, ρΗ7· 0)中清洗2次，每次lOmin，不斷搖動。(4)固定將清洗后的尼龍膜置于烘箱中在120°C的溫度下烘30分鐘來固定DNA。(5)預(yù)雜交將處理好的待雜交的尼龍膜小心置于雜交袋中，作好標(biāo)記，將預(yù)熱至 42°C 的雜交液(6X SSC, 5XDenhardt, 0. 5% (w/v) SDS 禾口 100 μ g/ml 的鮭魚精 DNA)，按照 lOmL/lOOcm2的比例加入雜交袋中，將雜交袋內(nèi)的空氣排空，并用封口機將雜交袋密封，然后將密封的雜交袋放入雜交爐中于42°C的溫度下預(yù)雜交3小時。(6)檢測將預(yù)雜交后的雜交膜根據(jù)目標(biāo)探針標(biāo)記類型進行Southern雜交檢測。根據(jù)Yang et al. (2007) (Applied and Environmental Microbiology，2007年第 21期)的報道，鈣粘蛋白基因由于部分片段缺失而造成棉鈴蟲對Bt殺蟲蛋白產(chǎn)生抗性，而敏感品系棉鈴蟲DNA中含有這段基因片段。以敏感品系棉鈴蟲DNA作對照，在敏感品系棉鈴蟲卵中的DNA應(yīng)該也含有該基因片段。新產(chǎn)的棉鈴蟲卵含有的DNA較少，隨著卵的孵化， 細胞不斷分化，DNA含量也越來越多。根據(jù)是否能在敏感品系棉鈴蟲新產(chǎn)的卵中檢測到該基因片段，可以對本發(fā)明方法的靈敏度進行測試。針對鈣粘蛋白缺失片段，設(shè)計PCR引物在敏感品系的DNA中擴增出這段DNA序列， 純化后使用羅氏地高辛標(biāo)記試劑盒(Roche，產(chǎn)品目錄號1174583四10)中提供的帶有地高辛標(biāo)記物的脫氧尿嘧啶核苷三磷酸對DNA序列進行標(biāo)記。將地高辛標(biāo)記的探針煮沸5分鐘變性，迅速置于冰浴，從雜交爐中取出雜交袋，從一角剪開小口，加入5 μ L相應(yīng)的探針，重新封口，再放入雜交爐中，于42°C的溫度下雜交過夜。
將雜交后的雜交膜在室溫下用IOmL含有0. 1% SDS的2 X SSC (氯化鈉0. 3mol/L， 檸檬酸鈉0. 03mol/L, pH7. 0)溶液清洗，洗膜2次，每次5分鐘；再將雜交膜在68°C的溫度下用IOmL含有0. 1 % SDS的0. 1 X SSC (氯化鈉15mmol/ L，檸檬酸鈉1. 5mmol/L, pH7. 0)溶液清洗，洗膜2次，每次15分鐘，不斷搖動；再用IOOmL漂洗液(馬來酸緩沖液，含有0. 3% Tween-20,短暫洗滌5分鐘，然后將尼龍膜放入IOOmL的的Blocking solution (Roche公司產(chǎn)品，目錄號11745832910) (封閉液和馬來酸溶液以1 10混合)溶液中，并于室溫下放置30分鐘；然后將雜交膜放入到20mL抗體復(fù)合物溶液(Roche公司產(chǎn)品，目錄號 11745832910)(每次使用前將Anti-Dig-Ap以IOOOOrpm離心5分鐘，取上清液用封閉液進行1 5000倍稀釋)中，并于室溫下放置30分鐘；將尼龍膜放入IOOmL 洗液(0. IM 順丁烯二酸，0. 15M NaCl ；pH7. 5 ；0. 3 % (ν/ν) Tween-20)中洗滌2次，每次15分鐘；再將尼龍膜夾入20mL檢測液(0. IM Tris-HCl,0. IM NaCl，pH9. 5)中進行平衡2-5 分鐘；棄檢測液，在黑暗條件下，加入IOmL新配的酶化學(xué)顯色液(Roche公司產(chǎn)品，目錄號1174583^10)顯色6小時以上，不要搖動；用50mL雙蒸水(ddH20)洗膜5分鐘終止顯色反應(yīng)，根據(jù)尼龍膜上卵破碎位置的顏色反應(yīng)判斷結(jié)果，有顏色變化且顏色變深證明含有缺失區(qū)DNA，為敏感品系棉鈴蟲；未發(fā)生顏色變化證明不含有缺失區(qū)DNA，為Bt抗性棉鈴蟲。上述顏色變化僅在顯色反應(yīng)后才出現(xiàn)， 在顯色反應(yīng)之前的所有步驟，尼龍膜上的卵破碎位置不發(fā)生顏色變化。結(jié)果參見圖1，顯示 4粒孵化后5天的卵和5粒新產(chǎn)的卵都能觀察到顏色變化，與預(yù)期結(jié)果一致，證明本發(fā)明的方法具有較高的靈敏度。實施例2采用于2010年7月份從河南安陽中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所東試驗場棉田采集的32粒棉鈴蟲卵進行基因檢測，具體方法如下(1)破碎使用圓頭組織研磨杵施加機械壓力使單個昆蟲卵破碎于尼龍膜上，按同樣方法使多個昆蟲卵分別破碎于尼龍膜上。并使用敏感品系棉鈴蟲DNA(從敏感品系棉鈴蟲個體提取出的DNA)作為陽性對照。(2)裂解使用裂解液于65°C的溫度下處理尼龍膜上的破碎的昆蟲卵1小時，所述裂解液包括氯化鈉 100mmol/L、Tris-HCl 1 Ommo 1/L、EDTA50mmol/L、SDS 0.5%、蛋白酶 K ang/ml，所述裂解液的pH值為7. 4。(3)洗膜將處理后的尼龍膜放入2XSSC溶液(氯化鈉0. 3mol/L，檸檬酸鈉 0. 03mol/L, ρΗ7· 0)中清洗2次，每次lOmin，不斷搖動。(4)固定將清洗后的尼龍膜置于烘箱中在120°C的溫度下烘30分鐘來固定DNA。(5)預(yù)雜交將處理好的待雜交的尼龍膜小心置于雜交袋中，作好標(biāo)記，將預(yù)熱至 42°C 的雜交液(6X SSC, 5XDenhardt, 0. 5% (w/v) SDS 禾口 100 μ g/ml 的鮭魚精 DNA)，按照 lOmL/lOOcm2的比例加入雜交袋中，將雜交袋內(nèi)的空氣排空，并用封口機將雜交袋密封，然后將密封的雜交袋放入雜交爐中于42°C的溫度下預(yù)雜交3小時。(6)檢測將預(yù)雜交后的雜交膜根據(jù)目標(biāo)探針標(biāo)記類型進行Southern雜交檢測。
IHig Yang et al. (2007) (Applied and Environmental Microbiology, 2007ipH 21期)的報道，鈣粘蛋白基因由于部分片段缺失而造成棉鈴蟲對Bt殺蟲蛋白產(chǎn)生抗性，而敏感品系中含有該基因片段。根據(jù)棉鈴蟲是否含有這段序列，可以判斷該棉鈴蟲是敏感品系還是Bt抗性品系。針對鈣粘蛋白缺失片段，設(shè)計PCR引物在敏感品系的DNA中擴增出缺失區(qū)DNA序列，純化后使用羅氏地高辛標(biāo)記試劑盒(Roche，產(chǎn)品目錄號1174583四10)中提供的帶有地高辛標(biāo)記物的脫氧尿嘧啶核苷三磷酸對DNA序列進行標(biāo)記。將地高辛標(biāo)記的探針煮沸5分鐘變性，迅速置于冰浴，從雜交爐中取出雜交袋，從一角剪開小口，加入5 μ L相應(yīng)的探針，重新封口，再放入雜交爐中，于42°C的溫度下雜交過夜。將雜交后的雜交膜在室溫下用IOmL含有0. 1% SDS的2 X SSC (氯化鈉0. 3mol/L， 檸檬酸鈉0. 03mol/L, pH7. 0)溶液清洗，洗膜2次，每次5分鐘；再將雜交膜在68°C的溫度下用IOmL含有0. 1 % SDS的0. 1 X SSC (氯化鈉15mmol/ L，檸檬酸鈉1. 5mmol/L, pH7. 0)溶液清洗，洗膜2次，每次15分鐘，不斷搖動；再用IOOmL漂洗液(馬來酸緩沖液，含有0. 3% Tween-20)短暫洗滌5分鐘，然后將尼龍膜放入IOOmL的的Blocking solution (Roche公司產(chǎn)品，目錄號11745832910) (封閉液和馬來酸溶液以1 10混合)溶液中，并于室溫下放置30分鐘；然后將雜交膜放入到20mL抗體復(fù)合物溶液(Roche公司產(chǎn)品，目錄號 11745832910)(每次使用前將Anti-Dig-Ap以IOOOOrpm離心5分鐘，取上清液用封閉液進行1 5000倍稀釋)中，并于室溫下放置30分鐘；將尼龍膜放入IOOmL 洗液(0. IM 順丁烯二酸，0. 15M NaCl ；pH7. 5 ；0. 3 % (ν/ν) Tween-20)中洗滌2次，每次15分鐘；再將尼龍膜夾入20mL檢測液(0. IM Tris-HCl,0. IM NaCl，pH9. 5)中進行平衡2-5 分鐘；棄檢測液，在黑暗條件下，加入IOmL新配的酶化學(xué)顯色液(Roche公司產(chǎn)品，目錄號1174583^10)顯色6小時以上，不要搖動；用50mL雙蒸水(ddH20)洗膜5分鐘終止顯色反應(yīng)，根據(jù)尼龍膜上卵破碎位置的顏色反應(yīng)判斷結(jié)果，有顏色變化且顏色變深證明含有缺失區(qū)DNA，為敏感品系棉鈴蟲；未發(fā)生顏色變化證明不含有缺失區(qū)DNA，為Bt抗性棉鈴蟲。結(jié)果參見圖1，顯示32粒卵都能觀察到顏色變化，說明32粒卵都含有缺失區(qū)DNA，證明田間采集的32粒卵都為Bt敏感品系，沒有對Bt抗性的個體。綜上所述，以上僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并非用于限定本發(fā)明的保護范圍， 因此，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種昆蟲基因檢測方法，其特征在于，所述方法使用昆蟲卵作為檢測對象，所述方法包括以下步驟(1)將單個或多個昆蟲卵分別破碎于雜交膜上；(2)使用裂解液處理步驟(1)獲得的雜交膜上的破碎的昆蟲卵；(3)將步驟( 獲得的雜交膜在2X SSC溶液中清洗；(4)將步驟(3)獲得的雜交膜烘干以固定DNA；(5)將步驟(4)獲得的雜交膜置于雜交袋中，作標(biāo)記，將預(yù)熱的雜交液加入雜交袋中， 將雜交袋內(nèi)的空氣排空并將雜交袋密封，然后將密封的雜交袋放入雜交爐中預(yù)雜交0. 5-4 小時；(6)對步驟( 獲得的雜交膜根據(jù)目標(biāo)探針標(biāo)記類型進行Southern雜交檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的昆蟲基因檢測方法，其中步驟(1)所述雜交膜是尼龍膜，所述多個昆蟲卵是通過施加機械壓力的方式被破碎于所述雜交膜上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的昆蟲基因檢測方法，其中步驟(2)所述的裂解液包括氯化鈉 100mmol/L、Tris-HCl 1 Ommo 1/L、EDTA 50mmol/L、SDS 0. 5% (w/v)、蛋白酶 K2_4mg/ml，所述裂解液的PH值為7.4。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的昆蟲基因檢測方法，其中步驟(2)的處理溫度為65°C，處理時間為0. 5-2小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的昆蟲基因檢測方法，其中步驟C3)所述2X SSC溶液包括氯化鈉0. 3mol/L、檸檬酸鈉0. 03mol/L，所述2XSSC溶液的pH值為7. 0。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的昆蟲基因檢測方法，其中步驟(3)中清洗次數(shù)為2次，每次 10分鐘，并于清洗時不斷搖動所述雜交膜。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的昆蟲基因檢測方法，其中步驟的烘干方式包括以下方式的任意一種于烘箱中在120°C下烘30分鐘，在80°C下于真空中烘2小時，經(jīng)254nm紫外光照射2分鐘。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的昆蟲基因檢測方法，其中步驟(5)所述的雜交液包括 6 X SSC, 5 XDenhardt, 0. 5% (w/v) SDS和100 μ g/ml的鮭魚精DNA，所述雜交液加入雜交袋的比例為8-12mL/100cm2，所述預(yù)熱溫度為42°C，所述密封的雜交袋在雜交爐內(nèi)的預(yù)雜交溫度為42°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的昆蟲基因檢測方法，其中步驟(6)所述目標(biāo)探針用帶有標(biāo)記物的脫氧尿嘧啶核苷三磷酸標(biāo)記。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的昆蟲基因檢測方法，其中步驟(6)包括用酶化學(xué)法檢測所述 Southern雜交的結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種昆蟲基因檢測方法，其使用昆蟲卵作為檢測對象，以雜交膜為載體，結(jié)合Southern雜交技術(shù)，使用標(biāo)記的目標(biāo)探針檢測昆蟲卵中的DNA。所述方法成本低、靈敏度高，可以方便的進行大規(guī)模昆蟲DNA檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102392078SQ20111038510
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月28日
發(fā)明者呂麗敏, 崔金杰, 張帥, 王春義, 蔣偉麗, 雒珺瑜, 馬艷 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所