專利名稱：一種斜帶石斑魚抗菌肽的原核表達(dá)產(chǎn)物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中的魚類基因工程表達(dá)，尤其是涉及一種斜帶石斑魚抗菌肽H印cidin3的表達(dá)載體和表達(dá)產(chǎn)物及其構(gòu)建制備方法。
背景技術(shù)：
抗菌肽(Antimicrobial peptides, AMPs)是魚類先天免疫系統(tǒng)的重要組成成分， 魚類可分泌產(chǎn)生多種抗菌肽來抵抗水生環(huán)境中大量的病原微生物的侵襲，這些病原微生物包括多種細(xì)菌、真菌和病毒等等。利用分子生物學(xué)技術(shù)，在體外獲得大量的、有活性的抗菌肽產(chǎn)品，進(jìn)一步應(yīng)用這些抗菌肽產(chǎn)品可能增強(qiáng)水產(chǎn)動物的免疫力，提高養(yǎng)殖產(chǎn)量，并對解決海水養(yǎng)殖中面臨的由于長期濫用抗生素而引起的細(xì)菌耐藥性、水產(chǎn)品藥物殘留和水環(huán)境污染等問題具有重要的科學(xué)、現(xiàn)實和經(jīng)濟(jì)意義。斜帶石斑魚(Epinephelus coioides，orange-spotted grouper)俗禾爾青斑，是暖水性中下層魚類，主要分布于印度洋、紅海、地中海、北太平洋西部和東南亞地區(qū)。其肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富、抗逆性強(qiáng)、生長快、體色艷麗，市場價格高且穩(wěn)定，目前斜帶石斑魚已成為世界上育苗量和人工養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的石斑魚類，也是我國福建、廣東、海南、臺灣四省重要的海水養(yǎng)殖魚類之一。但是近年來，由于致病性微生物引起的魚病爆發(fā)，使得斜帶石斑魚養(yǎng)殖業(yè)承受著巨大的經(jīng)濟(jì)損失(1.林建輝.斜帶石斑魚的生物學(xué)特性及養(yǎng)殖技術(shù)[J].齊魯漁業(yè)，2008，25⑵:22-23 ；2.黃瑞芳.斜帶石斑魚溶藻弧菌病的研究[J]·水產(chǎn)科學(xué)，2005， 24(6) 1-3 ；3.梅冰，周永燦，徐先棟，王世峰，謝珍玉.斜帶石斑魚爛尾病病原菌的分離與鑒定[J].熱帶海洋學(xué)報，2010，四(6) :118-124) 0本申請人在前期研究中從青石斑魚(Epin印helus awoara)中克隆獲得了 1個成熟肽具有4個半胱氨酸殘基的h印cidin基因，繼而從福建漳浦的養(yǎng)殖斜帶石斑魚中克隆得到了另1個新的成熟肽含有4個半胱氨酸殘基的h印cidin基因，與已報道的另外2個在斜帶石斑魚中發(fā)現(xiàn)的h印cidin基因EC-h印cidinl和EC_h印cidin2具有同源性，推測是其變體，故命名為EC-h印cidin3。已發(fā)現(xiàn)人工合成的EC-h印cidinl和EC_h印cidin2的成熟肽具有抗菌、抗病毒白勺作用(4. Jing-Geng Zhou, Jing-Guang Wei, Dan Xu, Hua-Chun Cui, Yang Yan, Zheng-Liang Ou-Yang, Xiao-Hong Huang, You-Hua Huang, Qi-ffei Qin. Molecular cloning and characterization of two novel hepcidins from orange-spotted grouper, Epinephelus coioides[J]· Fish&Shellfish Immunology,2011,30 :559-568)。同其他已發(fā)現(xiàn)的魚類h印cidin結(jié)構(gòu)一樣，EC-h印cidin3包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶向的位于N端的信號肽，前導(dǎo)肽和位于C端的成熟肽，其中前導(dǎo)肽和成熟肽共同構(gòu)成前體肽 (propeptide of EC_hepcidin3, EC-proHep3)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在提供一種斜帶石斑魚抗菌肽的原核表達(dá)產(chǎn)物及其制備方法。本發(fā)明構(gòu)建的一種含有EC-h印cidin3基因的表達(dá)載體可在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，并通過高效純化表達(dá)產(chǎn)物而在體外獲得大量的表達(dá)產(chǎn)品。所述含有EC-h印cidin3基因的表達(dá)載體，是在原核表達(dá)載體pETISa+中插入EC-h印cidin3前體肽基因序列所構(gòu)成的重組表達(dá)載體pEI^8a/EC-h印cidin3。本發(fā)明所述在體外獲得的表達(dá)產(chǎn)物，是重組表達(dá)載體pET28a/EC_h印cidin3在大腸桿菌中經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)以及純化后獲得的重組蛋白EC-proH印3。所述EC-h印cidin3前體肽的基因序列如序列表第1序列所示。所述EC-h印cidin3前體肽的氨基酸序列如序列表第2序列所示。所述重組蛋白EC-proH印3的制備方法包括以下步驟1)構(gòu)建重組表達(dá)載體；2)將步驟1)所得重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，獲得可表達(dá)EC-proH印3的基因工程菌菌株；3)發(fā)酵培養(yǎng)已得到的基因工程菌菌株并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得表達(dá)產(chǎn)物；4)分離純化步驟幻所得的表達(dá)產(chǎn)物，獲得重組蛋白EC-proH印3。在步驟1)中，所述表達(dá)載體可為ρΕΤ48ει+等。在步驟幻中，所述宿主細(xì)胞可為大腸桿菌E. coli Rosette等。在步驟幻中，所述表達(dá)產(chǎn)物為先通過離心收集表達(dá)菌體，將表達(dá)菌體重懸并超聲破碎后再離心收集得到的上清液。在步驟4)中，所述分離純化可采用親和層析法純化。本發(fā)明借助分子生物學(xué)技術(shù)，利用原核表達(dá)載體pETjSa+和原核表達(dá)菌株E. coli Rosette,成功在體外表達(dá)了可溶的、易純化分離的、具有抗菌活性的重組蛋白EC-proH印3。重組蛋白EC-proH印3具有廣譜的抗菌活性，對革蘭氏陽性菌如溶壁微球菌 (Micrococcus lysodeikticus Fleming)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum) 和金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus)，對革蘭氏陰性菌如施氏假單胞菌 (Pseudomonas stutzeri)和熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)都具有明顯的抑制作用。重組蛋白EC-proH印3的基因工程表達(dá)產(chǎn)品將在斜帶石斑魚養(yǎng)殖業(yè)中研發(fā)抗病原微生物新藥、飼料添加劑和免疫增強(qiáng)劑等方面具有重要的應(yīng)用價值。本發(fā)明構(gòu)建的一種含有EC-h印cidin3基因的表達(dá)載體可在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，并通過高效純化表達(dá)產(chǎn)物而在體外獲得大量的表達(dá)產(chǎn)物。所述含有EC-h印cidin3基因的表達(dá)載體，是在原核表達(dá)載體PETjSa+中插入EC-h印cidin3前體肽基因序列所構(gòu)成的重組表達(dá)載體pEI^8a/EC-h印cidin3。本發(fā)明所述在體外獲得的表達(dá)產(chǎn)物，是重組表達(dá)載體pET28a/EC_h印cidin3在大腸桿菌中經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)以及純化后獲得的重組蛋白EC-proH印3。


圖1為PCR擴(kuò)增斜帶石斑魚抗菌肽H印cidin3前體肽基因序列結(jié)果電泳圖。在圖 1中，1為PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物；M為DL2000DNA Marker。圖2為PETjSa+載體酶切處理后的電泳圖。在圖2中，bp代表堿基對數(shù)目；M為 DL2000DNA Marker ；1為未進(jìn)行酶切的pET48a+載體，2為使用NcoI和BioI進(jìn)行雙酶切后的pET48a+載體。圖3為檢測蛋白表達(dá)情況的SDS-PAGE電泳圖。在圖3中，KDa代表蛋白質(zhì)的分子量(千道爾頓)；Ml為蛋白質(zhì)Marker ； 1為pET28a/EC_h印cidin3重組表達(dá)載體誘導(dǎo)前菌體總蛋白樣品；2為pET28a/EC-h印cidin3重組表達(dá)載體誘導(dǎo)后菌體總蛋白樣品。圖4為表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析的SDS-PAGE電泳圖，在圖4中，KDa代表蛋白質(zhì)的分子量(千道爾頓)；M2為蛋白質(zhì)Marker ； 1為超聲破碎表達(dá)菌體并離心后收集的上清液樣品；2為為超聲破碎表達(dá)菌體并離心后收集的沉淀樣品。圖5為親和層析法純化重組蛋白EC-proH印3的純化圖。在圖5中，橫坐標(biāo)為流經(jīng)純化柱的溶液體積Volume (ml)；縱坐標(biāo)為流出純化柱后的溶液在280nm波長下的紫外吸收值A(chǔ)bsorbance (mAU) ；a為流出組分，b為洗脫組分。圖6為重組蛋白EC-proH印3純化后的SDS-PAGE電泳圖。在圖6中，1為純化過程中流出組分樣品；2為純化過程中洗脫組分樣品；M2為蛋白質(zhì)Marker ；KDa代表蛋白質(zhì)的分子量(千道爾頓)。
具體實施例方式以下通過實施例結(jié)合附圖詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)方案。實施例1斜帶石斑魚抗菌肽H印cidin3重組表達(dá)載體的構(gòu)建1)斜帶石斑魚抗菌肽H印cidin3前體肽基因的獲得根據(jù)pET18a+載體上的多克隆位點以及斜帶石斑魚抗菌肽H印cidin3基因序列， 設(shè)計合成特異性上、下游引物，PCR擴(kuò)增斜帶石斑魚抗菌肽H印cidin3前體肽基因序列。在上游引物ECH-exp-Sl的端加上NcoI酶切位點，在下游引物ECH-exp-Al的端添加》ιοΙ酶切位點，終止密碼子和6 X Hi s組氨酸標(biāo)簽下游引物采用BioI酶切位點ECH-exp-Sl GCG CCATGG GCTTACCCGTCACTGGAGTAG ，斜體并標(biāo)注下劃線部分表示引入的NcoI酶切位點。
權(quán)利要求
1.EC-hepcidin3前體肽的基因序列如序列表第1序列所示。
2.EC-hepcidin3前體肽的氨基酸序列如序列表第2序列所示。
3.重組蛋白EC-proH印3的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)構(gòu)建重組表達(dá)載體；2)將步驟1)所得重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，獲得可表達(dá)EC-proH印3的基因工程菌菌株；3)發(fā)酵培養(yǎng)已得到的基因工程菌菌株并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得表達(dá)產(chǎn)物；4)分離純化步驟幻所得的表達(dá)產(chǎn)物，獲得重組蛋白EC-proH印3。
4.如權(quán)利要求3所述的重組蛋白EC-pr0Hep3的制備方法，其特征在于在步驟1)中，所述表達(dá)載體為ρΕΤ48ει+。
5.如權(quán)利要求3所述的重組蛋白EC-proH印3的制備方法，其特征在于在步驟幻中，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌E. coli Rosette0
6.如權(quán)利要求3所述的重組蛋白EC-proH印3的制備方法，其特征在于在步驟幻中，所述表達(dá)產(chǎn)物為先通過離心收集表達(dá)菌體，將表達(dá)菌體重懸并超聲破碎后再離心收集得到的上清液。
7.如權(quán)利要求3所述的重組蛋白EC-proH印3的制備方法，其特征在于在步驟4)中，所述分離純化采用親和層析法純化。
全文摘要
一種斜帶石斑魚抗菌肽的原核表達(dá)產(chǎn)物及其制備方法，涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中的魚類基因工程表達(dá)。提供一種斜帶石斑魚抗菌肽的原核表達(dá)產(chǎn)物及其制備方法。構(gòu)建的含有EC-hepcidin3基因的表達(dá)載體可在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，并通過高效純化表達(dá)產(chǎn)物而在體外獲得大量的表達(dá)產(chǎn)品。含有EC-hepcidin3基因的表達(dá)載體是在原核表達(dá)載體pET-28a+中插入EC-hepcidin3前體肽基因序列所構(gòu)成的重組表達(dá)載體pET28a/EC-hepcidin3。在體外獲得的表達(dá)產(chǎn)物，是重組表達(dá)載體pET28a/EC-hepcidin3在大腸桿菌中經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)以及純化后獲得的重組蛋白EC-proHep3。
文檔編號C12N1/21GK102433341SQ20111038642
公開日2012年5月2日 申請日期2011年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月28日
發(fā)明者曲海東, 王克堅, 陳貝 申請人:廈門大學(xué)