專(zhuān)利名稱(chēng)：一種重組溶葡萄球菌素位點(diǎn)特異性整合載體及其構(gòu)建的重組細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物技術(shù)領(lǐng)域，涉及轉(zhuǎn)基因克隆胚的核供體細(xì)胞的構(gòu)建，特別涉及一種重組溶葡萄球菌素位點(diǎn)特異性整合載體及其構(gòu)建的重組細(xì)胞。
背景技術(shù)：
奶牛乳房炎(mastitis)又名奶牛乳腺炎，主要由環(huán)境中的病原微生物感染引起的，是給奶牛養(yǎng)殖者帶來(lái)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的主要疾病之一，嚴(yán)重影響奶牛養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。有資料報(bào)道美國(guó)每年因?yàn)槟膛Ｈ榉垦自斐傻哪坍a(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量下降等損失達(dá)到350萬(wàn)美元。奶牛乳房炎分為臨床型乳房炎和亞臨床型乳房 炎。引起奶牛乳房炎可能有多種因素，包括牛本身的狀況、治病的微生物和影響奶牛和微生物環(huán)境因素。其中治病的微生物種類(lèi)很多，金黃色葡萄球菌是奶牛乳房炎最主要的病原菌，該菌可引起急性、慢性和亞臨床性(隱性乳房炎)乳房炎，給奶業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)巨大損失，不僅產(chǎn)量下降，還增加治療和給奶牛醫(yī)療月艮務(wù)的費(fèi)用(Gill, J. et al, 2006. Efficacy and pharmacokinetics of bacteriophagetherapy in treatment of subclinical Staphylococcus aure—us mastitis inlactating dairy cattle. Antimicrob. Agents Chemother. 50，2912-2918)。多年來(lái)，治療奶牛乳房炎都是采用廣譜抗生素治療的方法，盡管有效，但是治愈率不足50%。廣譜抗生素的應(yīng)用也導(dǎo)致了嚴(yán)重的耐藥菌株的產(chǎn)生，增加了治療的難度(D. Ferber. Antibiotic resistance-Livestock feed ban preserves drugs' power. [J].Science 2002;295:27-28)。因此，使用病原菌特異的抗生素有望減少抗性產(chǎn)生的機(jī)率。為了減少?gòu)V譜抗生素的使用，避免對(duì)抗生素有抗性的菌株的出現(xiàn)，我們通過(guò)轉(zhuǎn)基因奶牛的乳腺分泌病原菌特異的抗菌素，從而避免大量使用抗生素所引起的問(wèn)題，抵抗奶牛乳房炎(D. E. Kerr and 0. Wellnitz Mammary expression of new genes to combatmastitis [J] Anim Sci 2003.81:38-47)。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的生產(chǎn)從20世紀(jì)70年代中葉開(kāi)始，用原核顯微注射生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物持續(xù)了 20 多年(BOWEN RA, REED ML, SCHNIEKE A, et al. Transgenic cattle resultingfrom biopsied embryos !expression of c_ski in a transgenic calf[J]. Biol Reprod,1994,50 :664-8),但這種技術(shù)的廣泛應(yīng)用有一定的局限性，外源基因往往是隨機(jī)整合。在家畜上，胚胎干細(xì)胞還沒(méi)有建系(SHIM H，GUTIERREZ-ADAN A, CHEN LR, et al. Isolationof pluripotent stem cells from cultured porcine primordial germ cells [J]. BiolReprod, 1997, 57 :1089)。而應(yīng)用體細(xì)胞克隆技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物已表現(xiàn)出強(qiáng)大的生命力(G00 J, BHUIYAN M. M. U. , HYUN Y J, et al. An approach for producing transgeniccloned cows by nuclear transfer of cells transfected with human alphaI-antitrypsin gene [J]. Theriogenology, 2006,65 (9) :1800-1812.)，其突出的優(yōu)點(diǎn)是直接利用已確定的整合有目的基因的體細(xì)胞為核供體進(jìn)行體細(xì)胞核移植(SCNT)，將基因轉(zhuǎn)移步驟提前到體細(xì)胞培養(yǎng)階段，這樣只需在體細(xì)胞核移植前選擇狀態(tài)最佳的供體細(xì)胞，不但可以提高轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的出生率還可以降低其生產(chǎn)成本。溶葡萄球菌素(Lysostaphin)是模仿葡萄球菌(staphylococcus simulans)分泌的ー種金屬蛋白酶，具有水解葡萄球菌細(xì)胞壁肽聚糖五肽橋聯(lián)的催化活性，對(duì)金葡菌有強(qiáng)大的溶菌作用(Recsei P A,GrussA D,Novick R P. Cloning, sequence, and expression ofthe lysostaphin gene from S taphylococcus simulans[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1987,84(5) :1127-1131) 天然溶葡萄球菌素基因編碼ー種蛋白前體，產(chǎn)生的菌先表達(dá)蛋白前體，分泌到胞外后經(jīng)巰基蛋白酶作用切去N端多個(gè)13aa重復(fù)序列而成為成熟的溶葡萄球菌素，成熟溶葡萄球菌素比蛋白前體的活性約高4. 5倍(Thumm G,Gotz F. Studies onP rolysostaphin p rocessing and characterization οι the Lysostapmn immunityfactor (Lif)of Staphylococcus simulans biovar staphylolyticus[J]. MolMicrobiol,1997,23(6) :125ト1265)。國(guó)外有關(guān)成功轉(zhuǎn)lysostaphin基因的動(dòng)物研究有通過(guò)轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺表達(dá)Lysostaphin抗葡萄球菌感 染，結(jié)果表明通過(guò)遺傳工程的方法增強(qiáng)泌乳動(dòng)物健康降低乳房炎的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)是ー種有效的策略(David E. Kerri, Karen Plaut, A. JohnBramley, etal Lysostaphin expression in mammary glanas comers protectionagainst staphylococcal infection in transgenic mice[J]. Nat Biotechnol 2001 ；
19:66-70)。2005年攜帶Lysostaphin基因的轉(zhuǎn)基因牛出生，提高奶?？蛊咸亚蚓腥镜娜榉垦椎哪芰?Wall RJ, Powell AM, Paape MJ, etal. Genetically enhanced cowsresist intramammary Staphylococcus aureus infection. Nat Biotechnol 2005 ；23 445-451.)。國(guó)內(nèi)對(duì)lysostaphin的研究只見(jiàn)于作為抗生素治療外傷感染，奶牛乳房炎和子宮內(nèi)膜炎的治療，取得了很好的效果。但是，以lysostaphin作為目的基因，以動(dòng)物細(xì)胞為宿主細(xì)胞，特別是奶牛的體細(xì)胞為宿主細(xì)胞的表達(dá)載體，還少報(bào)道；也沒(méi)有以lysostaphin作為目的基因構(gòu)建基因克隆胚的核供體細(xì)胞細(xì)胞系的報(bào)道。OC31特異性整合酶可以介導(dǎo)基因的單向插入，發(fā)生位點(diǎn)特異性重組后產(chǎn)生的位點(diǎn)由于細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有其他輔助因子存在，重組后的位點(diǎn)不再是整合酶的識(shí)別底物，與Cre和FLP等整合酶相比有效率上的優(yōu)勢(shì)。在很多動(dòng)植物中均發(fā)現(xiàn)有假attP位點(diǎn)，并且他們大多位于基因間或內(nèi)含子中，只有少量位于外顯子中。在牛的基因組中已經(jīng)定位了 4個(gè)整合位點(diǎn)(Ou H L, Huang Y, Zeng Y T,et al. Φ C31integrase_mediated integration hotspotin favor of transgene expression exists in the bovine genomelJ」· FEBS J,2009,276(1) :155-63)其中一個(gè)位點(diǎn)整合效率達(dá)到74%，是已知位點(diǎn)中效率最高的。這就說(shuō)明在Φ〇31特異性整合酶的介導(dǎo)下，外源基因的插入不會(huì)影響宿主基因組及外源基因自身的正常表達(dá)。將帶有attB位點(diǎn)的載體與表達(dá)Φ031位點(diǎn)特異性整合酶的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，這種方法是ー種效率上更有保證的轉(zhuǎn)基因策略。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問(wèn)題在于提供一種重組溶葡萄球菌素位點(diǎn)特異性整合載體及其構(gòu)建的重組細(xì)胞，以重組細(xì)胞作為核供體細(xì)胞，為制備抗金黃色葡萄球菌乳房炎的轉(zhuǎn)基因奶牛提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)一種重組溶葡萄球菌素基因，其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示。
所述的重組溶葡萄球菌素基因在其5'端連接如SEQ. ID. NO. 2所示的CSN5調(diào)控元件，在其3'端連接如SEQ. ID. NO. 3所示的CSN3調(diào)控元件。在CSN5調(diào)控元件的Y端還連接有如SEQ. ID. NO. 4所示的att B序列，在att B序列的上下游還分別設(shè)有絕緣子序列。所述的絕緣子序列為如SEQ. ID. NO. 5所示的雞@ -乳球蛋白絕緣子序列。在重組溶葡萄球菌素基因的在上游還連接有熒光標(biāo)記基因，下游還連接有抗生素篩選基因。所述的熒光標(biāo)記基因與重組溶葡萄球菌素基因之間設(shè)有終止子或絕緣子序列，在抗生素篩選基因的上下游連接有Ioxp序列。 包括SEQ. ID. NO. I所示的重組溶葡萄球菌素基因，其5'端連接如SEQ. ID. NO. 2所示的CSN5調(diào)控元件，在其3'端連接如SEQ. ID. NO. 3所示的CSN3調(diào)控元件；CSN5調(diào)控元件的5'端還依次設(shè)有熒光標(biāo)記基因及啟動(dòng)子，在CSN3調(diào)控元件與啟動(dòng)子之間設(shè)有抗生素篩選基因。在熒光標(biāo)記基因與CSN5調(diào)控元件之間還設(shè)有att B序列，在att B序列的上下游還分別設(shè)有絕緣子序列；在抗生素篩選基因的上下游連接有Ioxp序列?；谒龅闹亟M溶葡萄球菌素的乳腺特異性表達(dá)載體構(gòu)建的重組細(xì)胞，以荷斯坦奶牛胎兒成纖維細(xì)胞為宿主細(xì)胞，將線(xiàn)性化的重組溶葡萄球菌素的乳腺特異性表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中。所述的重組細(xì)胞作為核移植構(gòu)建轉(zhuǎn)基因克隆胚的核供體細(xì)胞的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果I、本發(fā)明構(gòu)建了一種重組溶葡萄球菌素基因，在其成熟肽編碼序列中進(jìn)行了糖基化突變保證能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生具有生物活性的溶葡萄球菌素；其次將溶葡萄球菌素基因成熟肽連接到?！?乳球蛋白信號(hào)肽后面組成重組溶葡萄球菌素基因，使溶葡萄球菌素基因在乳腺細(xì)胞中表達(dá)后分泌到乳汁中；最后用CSN5、CSN3作為調(diào)控元件指導(dǎo)重組溶葡萄球菌素基因在牛的乳腺組織中特異性高效表達(dá)。2、本發(fā)明將目的基因及其調(diào)控元件還通過(guò)attB序列，在OC31整合酶的介導(dǎo)下實(shí)現(xiàn)特異位點(diǎn)的整合，在構(gòu)建的重組細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果顯示目的基因被整到到預(yù)期是位點(diǎn)；將乳腺特異性表達(dá)載體pEGFP-ClMAB與OC31整合酶的表達(dá)載體pCMVINT共轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細(xì)胞，構(gòu)建轉(zhuǎn)溶葡萄其菌素基因的牛胎兒成纖維細(xì)胞系。將其熒光顯微觀察標(biāo)記基因EGFP的表達(dá)情況，并經(jīng)G418篩選獲得陽(yáng)性細(xì)胞，提取陽(yáng)性細(xì)胞基因組，并進(jìn)行PCR和Southernbloting鑒定證實(shí)目的基因重組溶葡萄球菌素整合到牛胎兒成纖維細(xì)胞的基因組。而進(jìn)一步在抗生素篩選標(biāo)記基因neo的上下游設(shè)計(jì)Loxp序列，通過(guò)Loxp序列重組剪切掉neo基因。3、本發(fā)明構(gòu)建了的乳腺特異性表達(dá)載體pEGFP-ClMAB，還在P -酪蛋白基因的5'調(diào)控區(qū)的前端和EGFP編碼框的下游各添加了一個(gè)含兩個(gè)雞P -乳球蛋白絕緣子序列拷貝數(shù)的元件，插入基因組后保護(hù)目的基因和EGFP不受插入位點(diǎn)基因組附近沉默子的影響，目的基因和標(biāo)記基因可以正常表達(dá)。4、以包含目的基因重組溶葡萄球菌素的牛胎兒成纖維細(xì)胞作為核移植構(gòu)建轉(zhuǎn)基因克隆胚的核供體細(xì)胞，通過(guò)SCNT獲得轉(zhuǎn)基因克隆胚，將這些胚胎移入受體牛的子宮有望生產(chǎn)出轉(zhuǎn)重組溶葡萄球菌素基因的奶牛。


圖I是乳腺特異性表達(dá)載體pEGFP-ClMAB的質(zhì)粒圖譜。圖2是乳腺特異性表達(dá)載體pEGFP-ClMAB的構(gòu)建流程示意圖。圖3是雞β -乳球蛋白絕緣子擴(kuò)增流程示意圖。圖4是EcoRl 1091單酶切載體pE GFP-ClMAB的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖。圖5是Mlu I和Xho I雙酶切載體pEGFP-ClMAB的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖。圖6是熒光顯微鏡觀察pEGFP-ClMAB載體陽(yáng)性表達(dá)的牛胎兒成纖維細(xì)胞的報(bào)告基因EGFP表達(dá)的結(jié)果圖。圖7是對(duì)pEGFP-ClMAB載體陽(yáng)性表達(dá)的牛胎兒成纖維細(xì)胞基因組的重組溶葡萄球菌素基因擴(kuò)增之后的瓊脂糖凝膠電泳的檢測(cè)結(jié)果圖。圖8是對(duì)pEGFP-ClMAB載體陽(yáng)性表達(dá)的牛胎兒成纖維細(xì)胞基因組的反向PCR結(jié)果圖。圖9是對(duì)pEGFP-ClMAB載體陽(yáng)性表達(dá)的牛胎兒成纖維細(xì)胞基因組的反向PCR測(cè)序結(jié)果與NCBI中牛的基因組的比對(duì)結(jié)果圖。圖10是對(duì)pEGFP-ClMAB載體陽(yáng)性表達(dá)的牛胎兒成纖維細(xì)胞基因組的重組溶葡萄球菌素的Southern bloting結(jié)果圖。圖11是包含重組溶葡萄球菌素基因的重組胚的囊胚發(fā)育圖；圖12是對(duì)包含重組溶葡萄球菌素基因的重組胚胎基因組的重組溶葡萄球菌素基因擴(kuò)增之后的瓊脂糖凝膠電泳的檢測(cè)結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明首先構(gòu)建含有重組溶葡萄球菌素和綠色熒光蛋白(EGFP)基因的乳腺特異性表達(dá)載體PEGFP-C1MAB，可以使重組溶葡萄球菌素基因在乳腺組織中特異性表達(dá)，其次在表達(dá)OC31位點(diǎn)特異性整合酶的質(zhì)粒pCMVInt介導(dǎo)下，用Fugen HD將乳腺特異表達(dá)載體pEGFP-ClMAB轉(zhuǎn)染高產(chǎn)奶牛胎兒成纖維細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察標(biāo)記基因EGFP的表達(dá)情況，并經(jīng)G418篩選獲得陽(yáng)性細(xì)胞，進(jìn)行PCR和Southern bloting鑒定，證實(shí)目的基因重組溶葡萄球菌素整合到牛胎兒成纖維細(xì)胞的基因組中。最后，將轉(zhuǎn)染重組溶葡萄球菌素基因的牛胎兒成纖維細(xì)胞作為核供體移入牛去核卵母細(xì)胞中，獲得轉(zhuǎn)基因克隆胚，并進(jìn)行PCR鑒定。下面結(jié)合附圖和實(shí)驗(yàn)對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步的詳細(xì)說(shuō)明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。I、乳腺特異性表達(dá)載體pEGFP-ClMAB的構(gòu)建乳腺特異性表達(dá)載體pEGFP-ClMAB的質(zhì)粒圖譜如圖I所示，該載體包括目的基因?yàn)橹亟M溶葡萄球菌素基因，其5'端連接如CSN5調(diào)控元件，在3'端連接所示的CSN3調(diào)控元件；CSN5調(diào)控元件的上游還依次設(shè)有熒光標(biāo)記基因及啟動(dòng)子，在CSN3調(diào)控元件與啟動(dòng)子之間設(shè)有抗生素篩選基因neo,在抗生素篩選基因的上下游連接有Ioxp序列；在熒光標(biāo)記基因與CSN5調(diào)控元件之間還設(shè)有att B序列，在att B序列的上下游還分別設(shè)有絕緣子序列。乳腺特異性表達(dá)載體pEGFP-ClMAB是經(jīng)過(guò)多次中間載體的拼接和剪切而構(gòu)成的，下面結(jié)合圖2所示的構(gòu)建流程圖來(lái)具體說(shuō)明其構(gòu)建過(guò)程。I. I目的基因的克隆葡萄球菌素基因成熟肽的定點(diǎn)突變對(duì)溶葡萄球菌素基因成熟肽做點(diǎn)突變，成熟肽的蛋白第125、232位的N點(diǎn)突變?yōu)镼，即蛋白質(zhì)是Asn點(diǎn)突變?yōu)镚in。在DNA序列上是將AAT突變成CAG，在序列的373 375、694 696位分別做點(diǎn)突變，以恢復(fù)表達(dá)的 溶葡萄球菌素蛋白在真核細(xì)胞中的生物活性，經(jīng)真核細(xì)胞表達(dá)分泌，突變后的溶葡萄球菌素成熟肽可以維持其生物活性。根據(jù)GenBank ID :M15686所公布的Iysostaphin基因序列設(shè)計(jì)成熟肽點(diǎn)突變引物。以人工合成Iysostaphin全基因(XAFW021，TaKaRa編號(hào)CAG593)為模板，利用重疊延伸PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)成熟肽點(diǎn)突變，引物序列如下TBl gctgcaacac atgaacattc agcacTB2 gatcttgggc agttgactgt gaaaatgaat taacTB3 gttaattcat tttcacagtc aactgcccaa gatccaatgc cTB4 tcactttata gttccccaaa gaacacctaa agtattagta gatttctgcc atgttcttacaggTB5 tcactttata gttccccaaa gaacacctaa ag50 ii L 的 PCR 反應(yīng)體系為5 X Prime S TAR Buffer (Mg2+plus) 10uL,dNTP Mixture (各 2. 5mM) :4 u L, TBl(10u mol/L) 1u L, TB2(10umol/L) 1 u L,PrirneSTAR HS DNAPolymerase (2. 5U/ u L)) :0. 5 y L，模板 I y L，加滅菌超純水至50 u L ；反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，64°C退火15s，72°C延伸25s，30個(gè)PCR循環(huán)，72°C再延伸7min。首先利用引物TB1，TB2擴(kuò)增溶葡萄球菌素基因成熟肽序列的前391bp，PCR產(chǎn)物命名為片段1，該片段突變了序列的373 375位的密碼子，同時(shí)也就突變了蛋白的第125個(gè)
氨基酸；其次再用引物TB3，TB4，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同上，擴(kuò)增溶葡萄球菌素基因成熟肽序列的后384bp。PCR產(chǎn)物命名為片段2，該片段突變了序列694 696位的密碼子。同時(shí)也就突變了蛋白的第232個(gè)氨基酸；最后再用引物TBl和TB5，以片斷I和片段2等比例的混合物為模板，反應(yīng)體系同上。PCR反應(yīng)條件為94°0預(yù)變性51^11，941變性308，621退火158，721延伸458，30個(gè)？0 循環(huán)，72°C再延伸IOmin結(jié)束之后在反應(yīng)的產(chǎn)物里面加入0.5 ii L rTaq DNA聚合酶，0. 5 y LTBl和0.5 ii L TB5，放入PCR儀里，72°C反應(yīng)10分鐘(這個(gè)反應(yīng)的目的是在上一步所得到的擴(kuò)增產(chǎn)物兩端加上A便于下一步完成TA克隆)。將所擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物純化回收后做TA克隆，連接到PMD-18T Vector，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E. coli DH5 a，通過(guò)a -互補(bǔ)的藍(lán)白斑篩選挑選重組子，經(jīng)BamH I酶切鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒并送交上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，結(jié)果顯示溶葡萄球菌素基因與公布的序列一致，且在預(yù)定的位點(diǎn)成功實(shí)現(xiàn)溶葡萄球菌素成熟肽的點(diǎn)突變，將所得載體稱(chēng)為重組質(zhì)粒plys。
牛β -乳球蛋白信號(hào)肽長(zhǎng)度為48bp，GenBank ID U31361. I。然后通過(guò)PCR的方法在點(diǎn)突變的溶葡萄球菌素基因序列的5'添加牛β_乳球蛋白信號(hào)肽得到融合溶葡萄球菌素基因，加β -乳球蛋白信號(hào)肽的目的是使溶葡萄球菌素基因在乳腺細(xì)胞中表達(dá)后分泌到乳汁中。在進(jìn)行PCR上下游引物是添加BamH I酶切位點(diǎn)，具體設(shè)計(jì)如下LysBGHS ggatccatga agtgcctcct gcttgccctg gccctcactt gtggcgcccaggccgctgcaacacatgaac attcLysB GHA ggatcctcac tttatagttc cccaaagaac acc50μ L 的 PCR 反應(yīng)體系為10 X PCR Buffer 5μ L, dNTPs (2. 5mmol/L) :4 μ L，上游引物(10ymol/L) :lyL，下游引物(10μπιο1 /υ :lyL，LAtaq 聚合酶(5U/ μ L) 0. 5μ L,|l板為點(diǎn)突變后的溶葡萄球菌素PCR產(chǎn)物I μ L，加超純水至50 μし將克隆的帶有牛乳球蛋白信號(hào)肽的重組溶葡萄球菌素基因與PMD-20TVector 4°C連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E. coli DH5 α，通過(guò)α -互補(bǔ)的藍(lán)白斑篩選挑選重組子，經(jīng)BamH I酶切鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒并送交上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果所示與預(yù)期設(shè)計(jì)一致，成功實(shí)現(xiàn)重組的溶葡萄球菌素基因的克隆，所得載體稱(chēng)為Plys載體。所構(gòu)建的重組溶葡萄球菌素基因，其具體的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示。I. 2調(diào)控序列的擴(kuò)增和表達(dá)載體構(gòu)建利用牛β -酪蛋白基因的調(diào)控序列來(lái)調(diào)控重組的溶葡萄球菌素在牛乳腺上皮細(xì)胞中特異性的表達(dá)，具體在目的基因的5'端連接酪蛋白基因的調(diào)控序列，稱(chēng)為CSN5作為調(diào)控元件，其功能是使重組溶葡萄球菌素基因在乳腺中特異性表達(dá)；在目的基因3,連接酪蛋白基因的調(diào)控序列，稱(chēng)為CSN3作為調(diào)控元件，其功能是使重組溶葡萄球菌素基因能夠在乳腺細(xì)胞中能夠正常的終止轉(zhuǎn)錄及翻譯。根據(jù)GenBank ID Μ55158. I公布的牛β -酪蛋白的基因序列，擴(kuò)增該蛋白起始密碼子之前的大約2. Skb的調(diào)控序列。上游添加X(jué)ho I酶切位點(diǎn)。引物如下CbN5F ctcgagtgag aaaagggaaa tgttgaatgg gCSN5R atgcctaatg ttatctcccc tttgtcc50μ L 的 PCR 反應(yīng)體系為10 X PCR Buffer 5μ L, dNTPs (2. 5mmol/L) :4 μ L，上游引物(10ymol/L) :lyL，下游引物(10ymol/L) :1 μ L，LATaq 聚合酶(5U/ μ L) 0. 5μ L,iE常?；蚪MI μ L,加超純水至50 μしPCR 反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 30s，63°C退火 45s，72°C延伸 lmin，35個(gè)PCR循環(huán)，72°C再延伸7min。所擴(kuò)增的CSN5的核苷酸序列具體如SEQ. ID. NO. 2所示。根據(jù)GenBank ID M55158. I公布的牛β -酪蛋白的基因序列，擴(kuò)增該蛋白終止密碼子620bp的V調(diào)控區(qū)，上游添加酶切位點(diǎn)BamH I，下有添加酶切位點(diǎn)Acc65I。引物如下CSN3F aatgattcca agtaagccga tgCSN3R ggtaccacgc gttccaattt taattttcca cagc50μ L 的 PCR 反應(yīng)體系為10 X PCR Buffer 5μ L, dNTPs (2. 5mmol/L) :4 μ L，上游引物(10ymol/L) :lyL，下游引物(10ymol/L) :1 μ L，LATaq 聚合酶(5U/ μ L) 0. 5μ L,iE常牛基因組I μ L,加超純水至50 μし
PCR 反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 30s，59°C退火 45s，72°C延伸 lmin，35個(gè)PCR循環(huán)，72°C再延伸7min。所擴(kuò)增的CSN3的核苷酸序列具體如SEQ. ID. NO. 3所示。分別將PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物連接pMD20-T載體，酶切鑒定并測(cè)序得到正確的質(zhì)粒，分別命名為 pCSN5、pCSN3。用BamH I和Acc65I分別雙酶切pCSN5、pCSN3質(zhì)粒，回收pCSN5的大片段和pCSN3的小片段，經(jīng)T4DNA連接酶4°C連接過(guò)夜，重組子轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E. coli DH5 a，經(jīng)BamH I和Acc65I酶切鑒定正確的重組子命名為pCSN53。再BamH I酶切質(zhì)粒pCSN53和質(zhì)粒plys，回收pCSN53和plys的小片段，T4DNA連接酶4°C連接過(guò)夜，重組子轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E. coli DH5 a，酶切鑒定正確的重組子并測(cè)序，命名為 pCSN531ys。 1.3attB位點(diǎn)和雞P球蛋白絕緣子的克隆根據(jù)GenBank ID :X60952公布的attB的基因序列，以包含attB序列的載體作為擴(kuò)增模板。所用引物如下attBS gtcgacgatg taggtcacgg ；attBA gtcgacatgc ccgccgt ；50 ii L 的 PCR 反應(yīng)體系為5XPCR Buffer 10u L, dNTPs (2. 5mmol/L) 4u L,attBS (10 u mol/L) I u L, attBA (10 u mol/L) I u L, primestar 聚合酶(5U/ u L) :0. 5 y L,模板I U L,加超純水至50 u L0PCR 反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 30s，60°C退火 30s，72°C延伸 lmin，31個(gè)PCR循環(huán)，72°C再延伸7min ；PCR反應(yīng)后在體系中添加0. 5 ii L的rTaq聚合酶，72°C延伸30min，完成加A過(guò)程。加A后的PCR產(chǎn)物與pMD-20T Vector 4°C連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E. coliDH5ci，通過(guò)a-互補(bǔ)的藍(lán)白斑篩選挑選重組子，經(jīng)酶切鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒pattB并送交上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。所擴(kuò)增的attB的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 4所示。根據(jù)GenBank ID :U78775. 2公布的雞P球蛋白絕緣子的基因序列，用重疊PCR的方法擴(kuò)增兩個(gè)帶有不同酶切位點(diǎn)的含有兩個(gè)重復(fù)的絕緣子元件，以保護(hù)目的基因和EGFP不受插入位點(diǎn)基因組附近沉默子的影響，目的基因和標(biāo)記基因可以正常表達(dá)。在其上游引物和下游引物分別添加Spe I、Nde I和BamH I、EcoR I兩組酶切位點(diǎn)。參見(jiàn)圖3所示的絕緣子擴(kuò)增流程，設(shè)計(jì)兩組引物。第一組所用引物如下Insulor21S gacagaatca tagaacggcc gaaaagaagc aggctttcctInsulor21A catatgggcc gttctatgat tctgtcInsulor22S actagtgaaa agaagcaggc tttcctInsulor22A aggaaagcct gcttcttttc ggccgttcta tgattctgtc第二組所用引物如下twoInsulor21S gacagaatca tagaacggcc gaaaagaagc aggctttccttwoInsulor21A gaattcggcc gttctatgat tctgtc
twoInsulor22S ggatccgaaa agaagcaggc tttccttwoInsulor22A aggaaagcct gcttcttttc ggccgttcta tgattctgtc50μ L 的 PCR第一階段反應(yīng)體系為10XPCR Buffer 5μ L, dNTPs (2. 5mmol/L)4 μ L,上游引物(10 μ mol/L) S :1 μ L,下游引物(10 μ mol/L) A 1 μ L, primestar 聚合酶(5U/ μ L) :0. 5 μ L，雞血基因組:1 μ L，加超純水至50 μしPCR 反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 30s，63°C退火 30s，72°C延伸 lmin，31個(gè)PCR循環(huán)，72°C再延伸IOmin。第一階段擴(kuò)增得到的Insulor21、Insulor22 片段和 twoInsulor21、twoInsulor22片段；以Insulor21、Insulor22片段為模板，上下游引物分別為Insulor22S和Insulor21A,進(jìn)行 plnsulator 序列的擴(kuò)增；以 twoInsulor21 和 twoInsulor22 片段為模板，上下游引物分別為twoInsulor22S和t woInsulor21A,進(jìn)行ptwolnsulator序列的擴(kuò)增；反應(yīng)體系及反應(yīng)程序如下50μ L 的 PCR 反應(yīng)體系為5XPCR Buffer :10 μ L，dNTPs (2. 5mmol/L) 4μ L, ±游引物(10 μ mol/L) :1 μ L,下游引物(10 μ mol/L) :1 μ L, primestar 聚合酶(5U/μ L)0. 5 μ L,模板I μ L,加超純水至50 μしPCR 反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 30s，63°C退火 30s，72°C延伸 lmin，33個(gè)PCR循環(huán)，72°C再延伸lOmin。PCR反應(yīng)后在體系中添加0. 5 μ L的rTaq聚合酶，72°C延伸30min，完成加A過(guò)程。加A 后的兩組 PCR 產(chǎn)物(plnsulator、ptwolnsulator)與 pMD_20T Vector4°C連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E. coli DH5ci，通過(guò)α-互補(bǔ)的藍(lán)白斑篩選挑選重組子，經(jīng)酶切鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒plnsulator和ptwolnsulator并送交上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。用Spe I和Nde I雙酶切plnsulator、pattB質(zhì)粒，回收pattB的大片段和plnsulator的小片段，經(jīng)T4DNA連接酶4°C連接過(guò)夜，重組子轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E. coliDH5a,經(jīng)Spe I和Nde I酶切鑒定正確的重組子命名為pattBInsulatorl。再BamH I和EcoRI 酶切質(zhì)粒 ptwolnsulator 和 pattBInsulatorl,回收 pattBInsulatorl 和 ptwolnsulator的小片段，T4DNA連接酶4°C連接過(guò)夜，重組子轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E. coli DH5 α，酶切鑒定正確的重組子并測(cè)序，命名為pattBInsulatorl2。其中所擴(kuò)增的兩個(gè)重復(fù)的雞β球蛋白絕緣子Insulator 12的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 5所示。I. 4抗生素篩選基因及Ioxp序列的克隆根據(jù)載體pEGFP-Cl的序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增包含抗生素篩選基因neo的第1642bp到8bp的序列，在上游引物前加上34bp的Ioxp序列和酶切位點(diǎn)Ase I，在下游引物前加上34bp的Ioxp序列和酶切位點(diǎn)Mlu I。擴(kuò)增產(chǎn)物的兩處Ioxp序列方向一致。Loxp序列為tattgaagca tattacatac gatatgcttc aata。引物設(shè)計(jì)如下neoloxp21S acgcgttatt gaagcatatt acatacgata tgcttcaata aaattgtaagcgttaatattttgttaaaat tcg ；neoloxp21A attaattatt gaagcatatc gtatgtaata tgcttcaata aactaatgcatggcggtaatacgg ；
50ii L 的 PCR 反應(yīng)體系為5XPCR Buffer :10 y L，dNTPs (2. 5mmol/L) :4 y L，neoloxp21S (10 u mol/L) I u L, neoloxp21A (10 u mol/L) I u L, primestar 聚合酶(5U/U L) 0. 5 u L,模板I u L,加超純水至50 u L。PCR反應(yīng)后在體系中添加0. 5 ii L的rTaq聚合酶，72°C延伸30min，完成加A過(guò)程。加A后的PCR產(chǎn)物與pMD-20T Vector 4°C連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E. coliDH5a，通過(guò)a -互補(bǔ)的藍(lán)白斑篩選挑選重組子，經(jīng)酶切鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒pneoloxp3100并送交上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。用Ase I 和 Mlu I 雙酶切 pEGFP-Cl、pneoloxp3100 質(zhì)粒，回收 pEGFP-Cl 的大片段和pneoloxp3100的大片段，經(jīng)T4DNA連接酶4°C連接過(guò)夜，重組子轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5a，經(jīng)Spe I和Nde I酶切鑒定正確的重組子命名為pEGFP-Clloxp。將質(zhì)粒pEGFP-Clloxp轉(zhuǎn)化JMllO感受態(tài)細(xì)胞中，重新提取質(zhì)粒。
再用BspE I和Xba I酶切質(zhì)粒pEGFP-Clloxp，回收大片段，用Klenow酶補(bǔ)平粘性末端，用solution I進(jìn)行自連，4°C連接過(guò)夜，成環(huán)后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E. coli DH5 a，酶切鑒定正確并測(cè)序，命名為pEGFPloxp-plus。以引物的形式合成含有用Spe I、EcoR I、Xho I 3個(gè)酶切位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)，兩端是Mlu I的粘性末端，Spe I—側(cè)緊挨粘性末端的第一個(gè)堿基由T變成A，具體序列如下，MCS2F cgcgactagtgaattcctcgagaMC S2R :cgcgtctcgaggaattcactagt用Mlu I單酶切質(zhì)粒pEGFPloxp-plus，回收片段，經(jīng)T4DNA連接酶將合成的多克隆位點(diǎn)與酶切回收產(chǎn)物4°C連接過(guò)夜，重組子轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E. coli DH5a，經(jīng)Mlu I酶切鑒定正確的重組子，命名為pEGFP-ClM.用Spe I 和 EcoR I 酶切 pEGFP-ClM 和 pattBInsulorl2，回收 pEGFP-ClM 的片段和pattBInsulorl2的小片段，經(jīng)T4DNA連接酶4°C連接過(guò)夜，重組子轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E. coliDH5 a，酶切鑒定正確并測(cè)序，命名為pEGFP-ClMA。用Xho I 和 Mlu I 酶切 pEGFP-ClMA 和 pCSN531ys，回收 pEGFP-ClMA 片段和pCSN531ys的大片段，經(jīng)T4DNA連接酶4°C連接過(guò)夜，重組子轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E. coli DH5 a，酶切鑒定正確并測(cè)序，命名為pEGFP-ClMAB。對(duì)于pEGFP-ClMAB載體首先用EcoRl 1091單酶切鑒定，檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，可以看到一條約IOOOObp的目標(biāo)條帶,條帶大小與原載體大小一致,說(shuō)明質(zhì)粒沒(méi)有問(wèn)題。然后再用Mlu I和Xho I雙酶切鑒定，檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，可以看到兩條目標(biāo)條帶，表明質(zhì)粒沒(méi)有問(wèn)題，符合原質(zhì)粒的大小特點(diǎn)。用Promega公司的去內(nèi)毒素的質(zhì)粒純化試劑盒提取質(zhì)粒后用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定質(zhì)粒的濃度和純度，經(jīng)測(cè)定，質(zhì)粒的濃度為600ng/iil，0D260/280為I. 90，說(shuō)明質(zhì)粒較
純，可用于轉(zhuǎn)染。2、pEGFP-ClMAB表達(dá)載體轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細(xì)胞并篩選核供體細(xì)胞系2. I、牛胎兒成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)從液氮中取一管荷斯坦奶牛的牛胎兒成纖維細(xì)胞(< 3代)于38°C解凍，加0.8ml的DMEM(Dulbecco' s Modified Eagle Media)細(xì)胞培養(yǎng)液離心，棄上清，加細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液加10%胎牛血清)重懸，取3ml細(xì)胞懸浮液接種于直徑6cm的培養(yǎng)皿中，置于CO2培養(yǎng)箱中38. 5°C條件下培養(yǎng)。待牛胎兒成纖維細(xì)胞達(dá)到80%匯合吋，吸棄培養(yǎng)液，用無(wú)Ca2+、Mg2+的PBS沖洗細(xì)胞，加入胰酶與EDTA混合消化液，消化細(xì)胞。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，待大多數(shù)細(xì)胞回縮、變圓、細(xì)胞間隙擴(kuò)大時(shí)，用含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，用移液器吹打后，離心收集，懸浮，按I : 3的比例接種于24孔板，放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以G418作為篩選藥物，由于表達(dá)載體pEGFP-CIMAB的骨架上有G418抗性基因neor,外源基因nec/得到表達(dá)，使得牛胎兒成纖維細(xì)胞能夠在含有一定濃度G418的培養(yǎng)液中存活下來(lái)，而未轉(zhuǎn)染的正常細(xì)胞會(huì)在該濃度下死亡，因此需要確定正常細(xì)胞G418的最小致死濃度來(lái)作為篩選濃度。
G418最小致死濃度的測(cè)定在牛胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中分別加入濃度梯度的G418篩選I周，測(cè)定正常細(xì)胞的G418最小致死濃度。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)液中G418的濃度彡600 μ g/ml時(shí)，在顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞全部死亡，所以G418的最小致死濃度為600μ g/ml。2. 2、pEGFP-CIMAB表達(dá)載體轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細(xì)胞本發(fā)明具體采用FuGen HD(Roche)轉(zhuǎn)染試劑在有血清存在的條件下，共轉(zhuǎn)染pEGFP-ClMAB和OC31整合酶的表達(dá)載體pCMVINT與牛胎兒成纖維細(xì)胞。用FuGen HD轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移與其它方法相比，操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、不受DNA大小限制、無(wú)組織特異性和免疫原性,不需要血清饑餓,對(duì)細(xì)胞損傷小。具體操作如下接種前一天，將第2代牛胎兒成纖維細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)過(guò)夜使細(xì)胞達(dá)到70-80%匯合。對(duì)于每孔細(xì)胞，分別將2 μ g pEGFP-CIMAB表達(dá)載體和2 μ g的OC31整合酶的表達(dá)載體pCMVINT與8 μ I的FuGen HD轉(zhuǎn)染試劑加入到Opti-MEM培養(yǎng)液中，終體積為200 μ 1，室溫孵育15min后，緩慢將其加入到含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中，24h后轉(zhuǎn)換為含血清的正常DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。2. 3、pEGFP-CIMAB載體陽(yáng)性細(xì)胞篩選在不含轉(zhuǎn)染試劑的培養(yǎng)液(含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞24小時(shí)之后，在熒光顯微鏡下觀察報(bào)告基因EGFP的表達(dá)情況，并在含10%血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中添加600 μ g/ml G418篩選陽(yáng)性細(xì)胞；以未轉(zhuǎn)染的牛胎兒成纖維細(xì)胞為陰性對(duì)照，其細(xì)胞培養(yǎng)液加有同樣濃度的G418(600l·! g/ml)。在熒光顯微鏡下觀察報(bào)告基因EGFP的表達(dá)情況，結(jié)果如圖6所示，在熒光顯微鏡下可以看到轉(zhuǎn)基因的牛胎兒成纖維細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，說(shuō)明pEGFP-ClMAB已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞并且陽(yáng)性表達(dá)；pEGFP-ClMAB轉(zhuǎn)染細(xì)胞7d后，對(duì)照組的細(xì)胞全部死亡，將包含pEGFP-ClMAB轉(zhuǎn)染陽(yáng)性的細(xì)胞組的G418濃度減半持續(xù)篩選直到細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)皿底，可見(jiàn)到陽(yáng)性細(xì)胞形成島嶼狀細(xì)胞群，在熒光顯微鏡下仍然可以看到綠色熒光；然后消化細(xì)胞用不加G418的正常培養(yǎng)液擴(kuò)大培養(yǎng)。所篩選的陽(yáng)性細(xì)胞都是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-ClMAB的細(xì)胞，目的基因整合到細(xì)胞的基因組上，而不是游離于基因組之外；在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的過(guò)程中，在Φ031位點(diǎn)特異性整合酶的介導(dǎo)下，質(zhì)粒pEGFP-ClMAB上攜帯的基因會(huì)整合到宿主細(xì)胞的基因組特定的假attP位置上；通過(guò)G418篩選7天再半劑量持續(xù)篩選來(lái)達(dá)到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的目的，表現(xiàn)為報(bào)告基因在被轉(zhuǎn)染的陽(yáng)性細(xì)胞內(nèi)持續(xù)表達(dá)，因此篩選的陽(yáng)性細(xì)胞持續(xù)發(fā)出綠色熒光并呈現(xiàn)G418抗性。2. 4、pEGFP-CIMAB載體陽(yáng)性細(xì)胞的PCR鑒定
取傳到第八代的pEGFP-ClMAB陽(yáng)性表達(dá)的牛胎兒成纖維細(xì)胞，提取細(xì)胞基因組DNA,以基因組DNA為模板，PCR鑒定重組溶葡萄球菌素基因是否整合到細(xì)胞基因組中，陰性對(duì)照為未轉(zhuǎn)染的正常牛胎兒成纖維細(xì)胞，PCR鑒定所用引物對(duì)為Pl和P2 ；Platgaagtgcc tcctgcttgc ccP2 tcactttata gttccccaaa gaacaccPCR 反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 30s，63°C退火 30s，72°C延伸 lmin，30個(gè)PCR循環(huán)，72°C再延伸7min ;回收PCR產(chǎn)物進(jìn)行0. 8 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖7所示，其中，泳道M為DNAMarker,泳道2為未轉(zhuǎn)染的牛胎兒成纖維細(xì)胞,泳道I為pEGFP-ClMAB轉(zhuǎn)染的牛胎兒成纖維細(xì)胞，泳道I與2相比，明顯可以看到一條約800bp左右的條帶，目的基因?yàn)?89bp。而作為陰性 對(duì)照的泳道I并沒(méi)有看到，說(shuō)明目的基因整合到了宿主細(xì)胞牛胎兒成纖維細(xì)胞的基因組。重組溶葡萄球菌素基因整合到了宿主細(xì)胞牛胎兒成纖維細(xì)胞的基因組，與之相連的牛P酪蛋白基因的5'調(diào)控區(qū)和3'調(diào)控區(qū)與目的基因也會(huì)一起整合到牛胎兒成纖維細(xì)胞的基因組。2. 5、pEGFP-ClMAB載體陽(yáng)性細(xì)胞整合位點(diǎn)的檢測(cè)用BamH I酶切pEGFP-ClMAB載體陽(yáng)性細(xì)胞基因組，12小時(shí)后回收酶切產(chǎn)物并用50 ii L水洗脫液洗脫，加入50 ii L solution I配成100 y L的連接體系，過(guò)夜連接，直接以連接產(chǎn)物為模板進(jìn)行方向PCR.引物如下P2Scgatgtaggt cacggtctcg aag ；P2A cgcagtcaat tctgtggaat aggg ；50 ii L 的 PCR 反應(yīng)體系為10XPCR Buffer 5u L, dNTPs (2. 5mmol/L) :4yL，反IS (10 u mol/L) : I ii L，反 IA (10 ii mol/L) 1 u L, LA Taq 聚合酶(5U/ u L) :0. 5 y L，模板Iu L，加超純水至50 u L0PCR 反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性 5min，94°C變性 30s，60°C退火 45s，72°C延伸 lmin，38個(gè)PCR循環(huán)，72°C再延伸7min ;回收PCR產(chǎn)物，以PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行同樣程序的PCR反應(yīng)，并用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖8所示，其中，泳道M為T(mén)ranslOObpMarker,泳道I為未轉(zhuǎn)染的母?；蚪M，泳道2為pEGFP-ClMAB轉(zhuǎn)染的牛胎兒成纖維細(xì)胞基因組，泳道2與I相比，明顯可以看到一條約500bp左右的條帶。而作為陰性對(duì)照的泳道I并沒(méi)有看到。說(shuō)明陽(yáng)性細(xì)胞基因組與反向引物結(jié)合，擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，同時(shí)說(shuō)明目的基因的插入按照0C31整合酶的插入原理進(jìn)行定點(diǎn)整合的。將第二次PCR產(chǎn)物送交上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI中牛的基因組進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果如圖9所示，結(jié)果顯示目的基因插入到牛的9號(hào)染色體中。2. 6、pEGFP-ClMAB 載體陽(yáng)性細(xì)胞的 Southern blotting 檢測(cè)以陽(yáng)性細(xì)胞基因組DNA JjjSouthern blotting檢測(cè)目的基因是否完全整合到牛胎兒成纖維細(xì)胞的基因組中。所用的探針序列Tl和T2如下Tltggtcaaata atcggttggt ctgT2 ccaaacatga ccgtcttgtt teaSouthern blotting的實(shí)驗(yàn)操作按照Roche公司提供的實(shí)驗(yàn)方案完成,用限制性?xún)?nèi)切酶HindIII過(guò)夜酶切陽(yáng)性細(xì)胞基因組，檢測(cè)結(jié)果如圖10所示，表示目的基因已經(jīng)插入到了基因組中。3、以上述基因組整合了重組溶葡萄球菌素基因的牛胎兒成纖維細(xì)胞作為核供體細(xì)胞，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因克隆胚胎。3. I、卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)卵巢采自西安市牛屠宰場(chǎng)，無(wú)菌采取荷斯坦奶牛卵巣，2-3小時(shí)內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，抽取3 8mm直徑的卵泡，收集卵母細(xì)胞卵丘復(fù)合體，實(shí)體顯微鏡下挑選具有完整的三層以上卵丘細(xì)胞，胞質(zhì)均勻的卵母細(xì)胞用于成熟培養(yǎng)。卵母細(xì)胞的成熟培養(yǎng)液為T(mén)CM199 (Gibaco)加10%胎牛血清，10ng/ml的表皮生長(zhǎng)因子，培養(yǎng)條件為38. 5°C，5% C02、95%空氣的氣體環(huán)境，飽和濕度；成熟培養(yǎng)20h后用O. 2%透明質(zhì)酸酶去除卵丘細(xì)胞，以第一極體排放作為卵母細(xì)胞成熟的判定標(biāo)準(zhǔn)，挑選成熟卵母 細(xì)胞用于核移植試驗(yàn)。3. 2轉(zhuǎn)基因克隆胚的構(gòu)建本發(fā)明采用體細(xì)胞核移植(SCNT)技術(shù)將供體核轉(zhuǎn)移到去除細(xì)胞核的成熟卵母細(xì)胞中，其中，整合有外源基因的供體細(xì)胞控制到10代以?xún)?nèi)，這主要考慮減少體外培養(yǎng)導(dǎo)致的突變?cè)谂囵B(yǎng)過(guò)程中的積累。核移植具體為顯微操作液為含10% FBS, 5 μ g/ml細(xì)胞松弛素B的PBS，用內(nèi)徑20 μ m的去核管在顯微操作儀上吸出第一極體及部分胞質(zhì)，以10 μ g/mlHoechst 33342染色lOmin，在熒光顯微鏡下挑出完全去核的卵母細(xì)胞；完全去除第一極體及染色體的卵母細(xì)胞被用于核移植。卵母細(xì)胞的注核與融合，具體過(guò)程如下0. 25%胰蛋白酶消化接觸抑制3d的6 10代的轉(zhuǎn)染PBELS的荷斯坦牛胎兒成纖維細(xì)胞用作供核細(xì)胞。用去核管將供體細(xì)胞注入去核成功的卵母細(xì)胞透明帶下。核質(zhì)復(fù)合體在電融合液中平衡3min，用微電極法進(jìn)行融合，用與顯微操作儀連接的微電極尖部排列重組體，使膜接觸面與兩電極的連線(xiàn)垂直，用微電極尖輕輕壓住重組體，給予電脈沖進(jìn)行電融合。融合電壓為28V，融合時(shí)間為10 μ m。融合后的重組體放入10% FBS的M199中，38. 5°C>5% CO2、飽合濕度下培養(yǎng)，2h后觀察融合情況。3. 3、轉(zhuǎn)基因克隆胚的激活及體外培養(yǎng)融合的重組胚(細(xì)胞-卵胞質(zhì)重組體)在含10% FBS的M199中平衡2h后，用含5 μ mol/L離子霉素(Ionomycin，購(gòu)自SIGMA公司)的mSOFaa培養(yǎng)液(購(gòu)自SIGMA公司)處理5min，然后在含2mmol/L ニ甲基氨基嘌呤(6-DMAP)的mSOFaa培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)5h，洗3次后轉(zhuǎn)移到mSOF aa微滴中培養(yǎng)，培養(yǎng)密度為5yL每個(gè)重組胚，在38. 5°C、5% CO2、飽和濕度下培養(yǎng)，每48h半量換液I次，第7 9天檢查囊胚發(fā)育情況，如圖11所示，克隆胚正常發(fā)育至囊胚。3. 4、轉(zhuǎn)基因克隆胚PCR鑒定目的基因重組胚胎基因組DNA的提取將重組胚胎樣品放入100μ I滅菌的離心管中，加入
20μ I滅菌雙蒸水，煮沸5m in后稍離心，置于-20°C保存或直接用于PCR。以提取的重組克隆胚的基因組為模板，PCR鑒定重組溶葡萄球菌素基因，PCR反應(yīng)反應(yīng)體系和過(guò)程同步驟2. 4。以未轉(zhuǎn)基因的克隆胚為陰性對(duì)照。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0. 8%瓊脂糖凝膠電泳，獲得了大小為SOObp左右的擴(kuò)增帶，與預(yù)期大小相符，如圖12所示，其中，泳道M為IOObp DNALadder,泳道I為未轉(zhuǎn)基因的克隆胚，泳道2為重組克隆胚，泳道2與I相比，明顯可以看到一條789bp左右的條帶。說(shuō)明目的基因lysostaphin整合到胚胎基因組中。4、轉(zhuǎn)基因克隆胚的胚胎移植和妊娠鑒定第7天的囊胚用非手術(shù)法移入自然發(fā)情后第七天的荷斯坦受體牛子宮內(nèi)，每個(gè)受體牛移植2枚囊胚。受體牛移植后觀察其返情情況，對(duì)未返情的在移植后60d用B超做懷孕檢查。以后每隔一月檢查一次，以觀察妊娠維持情況。本發(fā)明共移植轉(zhuǎn)重組溶葡萄球菌素基因克隆胚胎到100頭同期發(fā)情的受體奶牛體內(nèi)，兩個(gè)月后有48頭建立妊娠， 3個(gè)月后有30頭維持妊娠并將繼續(xù)被監(jiān)測(cè)。
權(quán)利要求
1.一種重組溶葡萄球菌素基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示。
2.如權(quán)利要求I所述的重組溶葡萄球菌素基因，其特征在于，在其5'端連接如SEQ.ID. NO. 2所示的CSN5調(diào)控元件，在其3'端連接如SEQ. ID. NO. 3所示的CSN3調(diào)控元件。
3.如權(quán)利要求2所述的重組溶葡萄球菌素基因，其特征在于，在CSN5調(diào)控元件的5'端還連接有如SEQ. ID. NO. 4所示的att B序列,在att B序列的上下游還分別設(shè)有絕緣子序列。
4.如權(quán)利要求3所述的重組溶葡萄球菌素基因，其特征在于，所述的絕緣子序列為如SEQ. ID. NO. 5所示的雞β -乳球蛋白絕緣子序列。
5.如權(quán)利要求I 4任何一項(xiàng)所述的重組溶葡萄球菌素基因，其特征在于，在重組溶葡萄球菌素基因的在上游還連接有熒光標(biāo)記基因，下游還連接有抗生素篩選基因。
6.如權(quán)利要求5所述的重組溶葡萄球菌素基因，其特征在于，所述的熒光標(biāo)記基因與重組溶葡萄球菌素基因之間設(shè)有終止子或絕緣子序列，在抗生素篩選基因的上下游連接有Ioxp序列。
7.—種重組溶葡萄球菌素基因的乳腺特異性表達(dá)載體，其特征在干，包括SEQ.ID. NO. I所示的重組溶葡萄球菌素基因，其5'端連接如SEQ. ID. NO. 2所示的CSN5調(diào)控元件，在其3!端連接如SEQ. ID. NO. 3所示的CSN3調(diào)控元件； CSN5調(diào)控元件的5'端還依次設(shè)有突光標(biāo)記基因及啟動(dòng)子,在CSN3調(diào)控元件與啟動(dòng)子之間設(shè)有抗生素篩選基因。
8.如權(quán)利要求7所述的ー種重組溶葡萄球菌素基因的乳腺特異性表達(dá)載體，其特征在于，在熒光標(biāo)記基因與CSN5調(diào)控元件之間還設(shè)有att B序列，在att B序列的上下游還分別設(shè)有絕緣子序列；在抗生素篩選基因的上下游連接有Ioxp序列。
9.基于權(quán)利要求8所述的重組溶葡萄球菌素的乳腺特異性表達(dá)載體構(gòu)建的重組細(xì)胞，其特征在于，以荷斯坦奶牛胎兒成纖維細(xì)胞為宿主細(xì)胞，將線(xiàn)性化的重組溶葡萄球菌素的乳腺特異性表達(dá)載體與Φ031整合酶的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中。
10.權(quán)利要求8所述的重組細(xì)胞作為核移植構(gòu)建轉(zhuǎn)基因克隆胚的核供體細(xì)胞的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種重組溶葡萄球菌素位點(diǎn)特異性整合載體及其構(gòu)建的重組細(xì)胞，重組溶葡萄球菌素基因由牛生長(zhǎng)激素信號(hào)肽加上突變的溶葡萄球菌素成熟肽組成，在他的5′端和3′端加入酪蛋白基因的調(diào)控序列，在酪蛋白5′端和EGFP的終止密碼子后各添加一個(gè)雞β乳球蛋白的絕緣子元件。用整合了目的基因的牛胎兒成纖維細(xì)胞作為核移植構(gòu)建轉(zhuǎn)基因克隆胚的核供體細(xì)胞，通過(guò)SCNT獲得轉(zhuǎn)基因克隆胚胎。通過(guò)胚胎移植技術(shù)將發(fā)育正常的轉(zhuǎn)基因克隆胚胎，有望生產(chǎn)出轉(zhuǎn)重組溶葡萄球菌素基因的抗乳房炎的高產(chǎn)奶牛。
文檔編號(hào)C12N15/57GK102676559SQ20111039090
公開(kāi)日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2011年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月30日
發(fā)明者上官陶, 張勃偉, 張涌, 權(quán)富生, 黃欣 申請(qǐng)人:楊凌科元克隆股份有限公司, 西北農(nóng)林科技大學(xué)