專利名稱：以魷魚內臟為原料提取得到的蛋白酶及其提取方法與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于水產(chǎn)領域，涉及水產(chǎn)廢棄物綜合利用，特別涉及一種以魷魚內臟為原料提取得到的蛋白酶及其提取方法與應用。
背景技術：
一般來說，魷魚經(jīng)加工取得可食部分后剩余的內臟、皮、鰭部和墨汁等組成的加工副產(chǎn)物約占總比例的30%。加工副產(chǎn)物的成分組成為水分63%、粗脂肪22.5%、粗蛋白 13. 5%、其它1 %。對這些廢棄物，國內有一部分加工成魷溶漿，還有一部分被當做垃圾就地掩埋。這不但是對漁業(yè)資源的巨大浪費，而且還存在著環(huán)境污染的隱患。隨著現(xiàn)代海洋加工業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，魷魚廢棄物的綜合利用越來越受到重視。有關魷魚內臟的利用，國內外已有一些相關研究，如袁亞輝等利用魷魚內臟生產(chǎn)海味素(利用魷魚內臟生產(chǎn)海味素的研究.《漁業(yè)現(xiàn)代化》2002年第01期)；徐偉等對以魷魚加工廢棄物發(fā)酵魷魚醬油過程中的生物胺變化做了一些研究(魷魚加工廢棄物低鹽魚醬油速釀工藝及生化特性研究.中國海洋大學博士學位論文)；Y，Z，LEE etal(1982) 報道了魷魚肌肉和內臟(主要是肝臟和胰臟)含有豐富的活性較高的組織蛋白酶C，該酶具有二肽轉移酶和二肽水解酶活力，利用其水解魷魚蛋白可提高水解物的鮮美味(Lee YZ, Simpson BK, HaardNF. supplementation Of squid fermentation with proteolytic enzymes. Journal of FoodBiochemistryl982 年第 06 期)；童軍鋒 QOOl)提出魷魚內臟可采用自身酶解發(fā)酵法，可作為制造魚醬油的原料(加強魷魚資源的加工和綜合利用技術研究.《海洋學研究》2001年第04期)。迄今為止，國內外尚未有利用魷魚內臟提取蛋白酶的技術出現(xiàn)。

發(fā)明內容
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術的缺點與不足，提供一種以魷魚內臟為原料提取蛋白酶的方法。實現(xiàn)了對魷魚內臟的增值利用，可提高漁業(yè)生產(chǎn)附加值，而且還可避免環(huán)境污染。本發(fā)明的另一目的在于提供通過上述方法得到的魷魚蛋白酶，增加了商品蛋白酶的品種。本發(fā)明的再一目的在于提供所述的魷魚蛋白酶的應用。本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn)一種以魷魚內臟為原料提取蛋白酶的方法，是以新鮮或者冰凍的魷魚內臟為原料，魷魚內臟經(jīng)破碎后，用水或食鹽溶液進行提取， 通過控制提取過程中食鹽溶液濃度、固液比、溫度、提取時間得到較高的蛋白酶回收率；然后通過等電點沉淀法和添加絮凝劑沉淀等方法去除雜蛋白，提高酶的純度；最后經(jīng)濃縮、添加穩(wěn)定劑、防腐劑等成為液體魷魚內臟蛋白酶酶制劑；或者添加填料后經(jīng)干燥、粉碎，得固體魷魚內臟蛋白酶制劑。具體包含以下步驟(1)破碎魷魚內臟；
(2)在破碎了的魷魚內臟中加入水或食鹽溶液提取，去除浮于上層的脂肪，得到提取液；(3)將提取液除去沉淀，得到粗酶液；(4)將粗酶液的pH值調節(jié)為4. 0 5. 0，靜置并除去沉淀，得到上清液；(5)向步驟(4)得到的上清液中加入絮凝劑沉淀雜蛋白；除去沉淀，得到上清液；(6)步驟(5)中的上清液經(jīng)濃縮后添加穩(wěn)定劑和防腐劑，得到液體狀的魷魚內臟蛋白酶酶制劑；或者添加填料后經(jīng)干燥、粉碎，得固體狀的魷魚內臟蛋白酶制劑。步驟(1)中所述的魷魚內臟為新鮮或凍藏的，不能使用干燥過的；步驟(1)中所述的破碎優(yōu)選為使用組織搗碎機搗碎至泥狀；步驟⑵中所述的食鹽溶液的濃度為1.0% (質量百分濃度)以下，優(yōu)選為0.3 0.5% (質量百分濃度)；步驟⑵中所述的魷魚內臟與所述的食鹽溶液優(yōu)選按固液比(g/ml) 1 0. 5 10 配比，優(yōu)選按固液比1 1.5 1 2配比；步驟O)中所述的提取的條件優(yōu)選為于4 40°C提取15 120min ；更優(yōu)選為于 20°C 提取 60min ；步驟(3)、(4)和(5)中所述的除去沉淀的方式為離心或過濾；所述的離心的條件優(yōu)選為3000r/min以上，離心時間IOmin以上；所述的過濾可采用工業(yè)上常用的各種過濾機進行過濾；步驟⑷中所述的pH值優(yōu)選為4. 5，調pH的試劑為各種可食用酸；步驟(5)中所述的絮凝劑優(yōu)選為硫酸鐵、硫酸鋁、三氯化鐵、明礬等等各種常見的絮凝劑，絮凝劑的濃度為(質量體積比g/ml)，添加的比例為粗酶液與絮凝劑3 1 10 1 (V/V)；優(yōu)選采用硫酸鐵，添加比例為4 1(V/V)或是硫酸鋁，添加比例為5 KV/ V)；步驟(5)中所述的絮凝劑添加后，靜置30 60min，使雜蛋白絮凝沉淀下來，離心或過濾去沉淀，分離出上清液，即為提取的蛋白酶溶液；步驟(6)中所述的濃縮的方法可以采用真空減壓濃縮、薄膜濃縮、冷凍濃縮、超濾濃縮等方法；步驟(6)中的穩(wěn)定劑、防腐劑、填料等均采用酶制劑工業(yè)常用的材料；所述的穩(wěn)定劑可采用海藻糖、黃原膠、多元醇類物質；所述的多元醇優(yōu)選為甘露醇；所述的防腐劑采用苯甲酸及其鹽類、山梨酸及其鹽類，對羥基苯甲酸酯類等；所述的填料可采用碳酸鈣、硫酸鈣、硫酸鎂、纖維素、淀粉等物質。步驟(6)中所述的干燥的方法可采用噴霧干燥、鼓風干燥、流化床干燥、滾筒干燥、真空干燥等各種干燥方法。 一種魷魚內臟蛋白酶制劑，通過上述方法制備得到。 本發(fā)明提取的魷魚內臟蛋白酶可用于水解各種食品蛋白，如魚肉、蟹肉、雞肉、牛肉、豬肉、大豆蛋白等等。例如，蟹肉產(chǎn)品生產(chǎn)中會產(chǎn)生大量蟹腳等廢棄物，蟹腳中殘留的蟹肉目前無法利用，如預先將蟹腳粉碎，然后采用此魷魚內臟蛋白酶水解蟹腳中殘留的蟹肉， 可獲得風味鮮美的蟹肉風味的水解蛋白類調味品。此外，水解牛骨、雞骨等上面殘留的少量肉類，也可以得到相應的牛肉風味、雞肉風味的水解蛋白類調味品。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術具有如下的優(yōu)點及效果(1)本發(fā)明以魷魚內臟為原料提取蛋白酶，實現(xiàn)了對魷魚內臟的增值利用，可提高漁業(yè)生產(chǎn)附加值。(2)本發(fā)明可減少魷魚制品生產(chǎn)對環(huán)境的污染。(3)本發(fā)明制備得到的魷魚內臟蛋白酶的比酶活達到9400U/g(規(guī)定在37°C、pH 7. 0的條件下，水解酪蛋白每分鐘產(chǎn)生l.Oyg酪氨酸的酶量為一個活力單位)，提取率為 80%，其能作為水解各種食品蛋白質的酶制劑，從而增加了商品蛋白酶的品種。(4)本發(fā)明提取的魷魚內臟蛋白酶在pH3 7范圍內穩(wěn)定性較好，將該蛋白酶在 300C pH3條件下放置證后，蛋白酶的比酶活由9400U/g變?yōu)?500U/g，可見較為穩(wěn)定。(5)本發(fā)明提取的魷魚內臟蛋白酶具有一定的耐熱性，在60°C以下蛋白酶活力較穩(wěn)定。
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例1本實施例利用魷魚內臟提取蛋白酶，其具體步驟如下(1)取IOOg新鮮的魷魚內臟，用勻漿機攪碎至泥狀。(2)加入150mL 0.5% (質量百分濃度)NaCl溶液在常溫下提取，提取時間為 60min，得到提取液。(3) 3000r/min離心IOmin去除提取液的沉淀和表面的油脂，取上清液。(4)用食用醋酸調節(jié)上清液pH值為4. 5左右，離心，條件同上，去除沉淀，取用上清液。(5)將步驟(4)得到上清液與(質量百分濃度)硫酸鐵溶液按體積比為4 1 的比例混合均勻后靜置沉淀30min，3000r/min離心IOmin去沉淀，上清液即為蛋白酶溶液。(6)向上述蛋白酶溶液中加1.5g海藻糖，采用真空濃縮，濃縮至體積減少至1/3左右后，加IOg淀粉，再真空干燥、然后粉碎，即得固體魷魚內臟蛋白酶制劑(除去食鹽和添加的海藻糖、淀粉的質量得到的固體魷魚內臟蛋白酶為6. 2g)。酶活力的測定采用孫君社等編著的《酶與酶工程及其應用》(北京化學工業(yè)出版社，2006)書中的紫外分光光度法測定(在37°C、pH 7. 0的條件下，水解酪蛋白每分鐘產(chǎn)生 l.Oyg酪氨酸的酶量為一個活力單位)。將其進行換算，不含穩(wěn)定劑、填料等成分時的比酶活為 9400U/g。實施例2(1)取IOOg的新鮮的魷魚內臟，用勻漿機攪碎至泥狀。(2)加入200mL 0. 3 % (質量百分濃度)NaCl溶液在常溫下提取，提取時間為 60min，得到提取液。(3) 3000r/min離心15min去除提取液的沉淀和表面的油脂，取上清液。(4)用食用醋酸將步驟(3)得到的上清液的PH值調節(jié)為4. 5左右，離心，條件同步驟(3)，去除沉淀，取用上清液。
(5)將步驟(4)得到上清液與(質量百分濃度)硫酸鋁溶液按體積比為5 1 的比例混合均勻后靜置沉淀60min，離心，條件同步驟(3)，所得上清液即為蛋白酶溶液。(6)向上述蛋白酶溶液中加2g甘露醇，采用真空濃縮，濃縮至體積減少至1/3左右后，加IOg纖維素粉末，再真空干燥、然后粉碎，即得固體魷魚內臟蛋白酶制劑(除去食鹽和添加的甘露醇、纖維素粉末的質量得到的固體魷魚內臟蛋白酶為6. Og)。酶活力的測定采用孫君社等編著的《酶與酶工程及其應用》(北京化學工業(yè)出版社，2006)書中的紫外分光光度法測定(規(guī)定在37°C、pH 7. 0的條件下，水解酪蛋白每分鐘產(chǎn)生1. 0 μ g酪氨酸的酶量為一個活力單位)。將其進行換算，不含穩(wěn)定劑、填料等成分時的比酶活為9200U/g。對比例1(1)取IOOg新鮮的魷魚內臟，用勻漿機攪碎至泥狀。(2)加入200mL 2. 0 % (質量百分濃度)NaCl溶液在常溫下提取，提取時間為 60min，得到提取液。(3) 3000r/min離心IOmin去除提取液的沉淀和表面的油脂，取上清液。(4)用食用醋酸調節(jié)上清液pH值為4. 5左右，離心，條件同上，去除沉淀，取用上清液。(5)將步驟(4)得到上清液與(質量百分濃度)硫酸鐵溶液按體積比為4 1 的比例混合均勻后靜置沉淀30min，3000r/min離心IOmin去沉淀，上清液即為蛋白酶溶液。(6)向上述蛋白酶溶液中加1.5g海藻糖，采用真空濃縮，濃縮至體積減少至1/3左右后，加IOg淀粉，再真空干燥、然后粉碎，即得固體魷魚內臟蛋白酶制劑8. 5g(除去食鹽和添加的海藻糖、淀粉的質量)。酶活力的測定采用孫君社等編著的《酶與酶工程及其應用》(北京化學工業(yè)出版社，2006)書中的紫外分光光度法測定(規(guī)定在37°C、pH 7. 0的條件下，水解酪蛋白每分鐘產(chǎn)生1. 0 μ g酪氨酸的酶量為一個活力單位)。將其進行換算，不含穩(wěn)定劑、填料等成分時的比酶活為2200U/g?？梢娐然c濃度過高，提取到的魷魚內臟蛋白酶的活力遠低于實施例1和2中所得蛋白酶的比活力。對比例2(1)取IOOg新鮮的魷魚內臟，用勻漿機攪碎至泥狀。(2)加入150mL 0.5% (質量百分濃度)NaCl溶液在常溫下提取，提取時間為 60min，得到提取液。(3) 3000r/min離心IOmin去除提取液的沉淀和表面的油脂，取上清液。(4)用食用醋酸調節(jié)上清液pH值為4. 5左右，離心，條件同上，去除沉淀，取用上清液。(5)步驟(4)得到上清液中直接加1. 5g海藻糖，采用真空濃縮，濃縮至體積減少至 1/3左右后，加IOg淀粉，再真空干燥、然后粉碎，即得固體魷魚內臟蛋白酶制劑9. Ig(除去食鹽和添加的海藻糖、淀粉的質量)。酶活力的測定采用孫君社等編著的《酶與酶工程及其應用》(北京化學工業(yè)出版社，2006)書中的紫外分光光度法測定(規(guī)定在37°C、pH 7. 0的條件下，水解酪蛋白每分鐘產(chǎn)生1. 0 μ g酪氨酸的酶量為一個活力單位)。將其進行換算，不含穩(wěn)定劑、填料等成分時的比酶活為6500U/g?？梢姴挥眯跄齽?，提取到的魷魚內臟蛋白酶的活力明顯低于實施例1和2中所得蛋白酶的比活力。上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種以魷魚內臟為原料提取蛋白酶的方法，其特征在于包含以下步驟(1)破碎魷魚內臟；(2)在破碎了的魷魚內臟中加入水或食鹽溶液提取，去除浮于上層的脂肪，得到提取液；(3)將提取液除去沉淀，得到粗酶液；(4)將粗酶液的pH值調節(jié)為4.0 5. 0，靜置并除去沉淀，得到上清液；(5)向步驟(4)得到的上清液中加入絮凝劑沉淀雜蛋白；除去沉淀，得到上清液；(6)步驟(5)中的上清液經(jīng)濃縮后添加穩(wěn)定劑和防腐劑，得到液體狀的魷魚內臟蛋白酶酶制劑；或者添加填料后經(jīng)干燥、粉碎，得固體狀的魷魚內臟蛋白酶制劑。
2.根據(jù)權利要求1所述的以魷魚內臟為原料提取蛋白酶的方法，其特征在于步驟⑴ 中所述的魷魚內臟為新鮮或凍藏的；步驟(1)中所述的破碎為使用組織搗碎機搗碎至泥狀。
3.根據(jù)權利要求1所述的以魷魚內臟為原料提取蛋白酶的方法，其特征在于步驟(2) 中所述的食鹽溶液的濃度為質量百分比1.0%以下；步驟O)中所述的魷魚內臟與所述的食鹽溶液按質量體積比1 0. 5 10配比； 步驟O)中所述的提取的條件為于4 40°C提取15 120min。
4.根據(jù)權利要求3所述的以魷魚內臟為原料提取蛋白酶的方法，其特征在于步驟⑵ 中所述的食鹽溶液的濃度為質量百分比0. 3 0. 5% ；步驟O)中所述的魷魚內臟與所述的食鹽溶液按質量體積比1 1.5 1 2配比； 步驟O)中所述的提取的條件為于20°C提取60min。
5.根據(jù)權利要求1所述的以魷魚內臟為原料提取蛋白酶的方法，其特征在于步驟 (3)、(4)和(5)中所述的除去沉淀的方式為離心或過濾；步驟⑷中所述的PH值為4.5;步驟(5)中所述的絮凝劑為硫酸鐵、硫酸鋁、三氯化鐵或明礬中的至少一種； 所述的絮凝劑的濃度為質量體積比1%，添加的量為粗酶液與絮凝劑按體積比3 1 10 1計算；所述的絮凝劑添加后，靜置30 60min，使雜蛋白絮凝沉淀下來。
6.根據(jù)權利要求1所述的以魷魚內臟為原料提取蛋白酶的方法，其特征在于步驟(6) 中所述的濃縮的方法為真空減壓濃縮、薄膜濃縮、冷凍濃縮或超濾濃縮；步驟(6)中所述的穩(wěn)定劑為海藻糖、黃原膠或多元醇類物質；步驟(6)中所述的防腐劑為苯甲酸及其鹽類、山梨酸及其鹽類或對羥基苯甲酸酯類；步驟(6)中所述的填料為碳酸鈣、硫酸鈣、硫酸鎂、纖維素或淀粉；步驟(6)中所述的干燥的方法為噴霧干燥、鼓風干燥、流化床干燥、滾筒干燥或真空干O
7.—種魷魚內臟蛋白酶制劑，通過權利要求1 6任一項所述的以魷魚內臟為原料提取蛋白酶的方法制備得到。
8.權利要求7所述的魷魚內臟蛋白酶制劑在水解食品蛋白中的應用。
9.根據(jù)權利要求8所述的魷魚內臟蛋白酶制劑在水解食品蛋白中的應用，其特征在于所述的食品蛋白為魚肉、蟹肉、雞肉、牛肉、豬肉或大豆蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以魷魚內臟為原料提取得到的蛋白酶及其提取方法與應用。本發(fā)明以新鮮或者冰凍的魷魚內臟為原料，魷魚內臟經(jīng)破碎后，用水或食鹽溶液進行提取，通過控制提取過程中食鹽溶液濃度、固液比、溫度、提取時間得到較高的蛋白酶回收率；然后通過等電點沉淀法和添加絮凝劑沉淀等方法去除雜蛋白，提高酶的純度；最后經(jīng)濃縮、添加穩(wěn)定劑、防腐劑等成為液體魷魚內臟蛋白酶酶制劑；或者添加填料后經(jīng)干燥、粉碎，得固體魷魚內臟蛋白酶制劑。本發(fā)明實現(xiàn)了對魷魚內臟的增值利用，提高漁業(yè)生產(chǎn)附加值，減少魷魚制品生產(chǎn)對環(huán)境的污染，而且制備得到的魷魚蛋白酶作為水解各種食品蛋白質的酶制劑，增加了商品蛋白酶的品種。
文檔編號C12N9/64GK102392010SQ20111039616
公開日2012年3月28日 申請日期2011年12月2日 優(yōu)先權日2011年12月2日
發(fā)明者尹青春, 段杉 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學