專利名稱：鑒定或輔助鑒定小麥新疆拉面品質(zhì)性狀基因的pcr體系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于鑒定或輔助鑒定小麥拉面品質(zhì)性狀基因的PCR體系及其應(yīng)用，特別涉及一種用于鑒定或輔助鑒定待測(cè)新疆冬小麥的面筋品質(zhì)性狀相關(guān)基因和拉面粘性及光滑性相關(guān)基因的多重PCR引物對(duì)組、試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
面條是我國(guó)北方居民的傳統(tǒng)食品，是人們?nèi)粘Ｖ魇持?。?000多年的發(fā)展過程中，面條在不同地域形成了其特色形式。在新疆地區(qū)，拉面是當(dāng)?shù)厝粘Ｖ魇持唬钍苋藗兿矏?。作為鮮濕白鹽面條，新疆拉面以其制作、食用方便，口感彈韌、光滑，拌菜豐富、美味等諸多優(yōu)點(diǎn)，已逐漸走出新疆地區(qū)，被全國(guó)各地的人們所接受和喜愛。據(jù)統(tǒng)計(jì)，新疆地區(qū)小麥面粉年產(chǎn)量的80%用于制作拉面。但是，與新疆拉面在人們?nèi)粘ｏ嬍持腥找嬷匾牡匚幌啾?，新疆拉面品質(zhì)的評(píng)價(jià)仍以傳統(tǒng)儀器分析和成品感官評(píng)價(jià)相結(jié)合的方法為主，直接限制了其發(fā)展。因此，創(chuàng)建微量、快速的優(yōu)質(zhì)拉面評(píng)選方法，對(duì)于拉面專用品種的栽培、選育和優(yōu)質(zhì)拉面的加工、評(píng)價(jià)具有重要意義。近年來，隨著生活水平的提高，人們對(duì)新疆拉面品質(zhì)的要求越來越高，品質(zhì)相關(guān)研究已得到重視。目前研究主要集中于與優(yōu)質(zhì)拉面相關(guān)的磨粉、蛋白質(zhì)、淀粉、面團(tuán)流變學(xué)特性等品質(zhì)品指標(biāo)的篩選，評(píng)價(jià)方法的改良和拉面專用品種的選育方面。因?yàn)樾陆嫫焚|(zhì)構(gòu)成因素較復(fù)雜，與其相關(guān)的指標(biāo)較多，所以通過新疆拉面品質(zhì)評(píng)價(jià)方法的研究，將篩選出的指標(biāo)有效應(yīng)用于其品質(zhì)評(píng)價(jià)，成為新疆拉面品質(zhì)改良的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。新疆拉面評(píng)價(jià)指標(biāo)主要包括面條色澤和感官評(píng)價(jià)兩部分。面條色澤除受小麥出粉率、蛋白質(zhì)含量及面粉顆粒指數(shù)等磨粉品質(zhì)指標(biāo)的影響外，黃色素(YP)含量和多酚氧化酶 (PPO)活性對(duì)其也有顯著影響(胡鳳靈，何中虎，葛建貴，等小麥品種黃色素含量和多酚氧化酶活性基因的分子標(biāo)記檢測(cè).麥類作物學(xué)報(bào)[J]. 2011,31 (1) :47-53.) 0根據(jù)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) (穆培源，桑偉，王亮，等.新疆市售小麥面粉制作新疆拉面的加工品質(zhì)特性及其專用粉品質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)的研究[J].麥類作物學(xué)報(bào)，2007，27 (6) :1034-1041.)，優(yōu)質(zhì)新疆拉面最佳色澤為亮白色，而低的YP含量和PPO活性低的品種，具有較好的白度和顏色性狀。籽?；蛎娣踄P 含量主要受八氫番茄紅素合酶(PSY)基因影響，與面粉和面團(tuán)的白度高度負(fù)相關(guān)(Kruger J EiMatsuo R R,Presten K. A comparison of methods for the prediction of Cantonese noodle colour [J]. Canadian Journal of Plant Science，1992，72 :1021—1029.)，與其黃度高度正相關(guān)，低的YP含量基因型為Psy-Alb和Psy-Blb ；PPO活性主要受Ppo基因影響， 可以解釋面條(團(tuán))顏色褐變變異的50% 70%，是引起面條(團(tuán))顏色變褐的主要原因(Kruger J E,Hatcher D W,De Pauw R. A whole seed assay for polyphenol oxidase in Canadian prairie spring wheats and its usefulnesses a measure of noodle darkening [J], Cereal Chemistry, 1994,71 :324-326.)，籽?；蛎娣鄣偷?PPO 活性基因型為Ppo-Alb和Ppo-Dla。因此，對(duì)低YP含量和PPO低活性目標(biāo)基因型的鑒定，可作為新疆拉面色澤快速預(yù)測(cè)的方法。
拉面感官評(píng)價(jià)主要包括拉面手感、面條質(zhì)地、口感等項(xiàng)目。研究表明，蛋白質(zhì)特性、 淀粉特性和籽粒硬度等品質(zhì)性狀，可通過對(duì)面團(tuán)流變學(xué)特性和淀粉糊化特性的影響在一定程度上決定拉面的感官評(píng)價(jià)結(jié)果(Yun S H,Quail K,Moss R. Physicochemical properties of Australian wheat flours for white salted noodles[J]. Journal of Cereal Sciences,1996,23 :181-189.)。蛋白質(zhì)的數(shù)量與質(zhì)量對(duì)面條品質(zhì)有重要影響，其質(zhì)量主要是指面粉中醇溶蛋白與麥谷蛋白的構(gòu)成及比例，不同的蛋白質(zhì)構(gòu)成賦予了小麥籽粒蛋白質(zhì)不同的質(zhì)量，其中，高分子量谷蛋白亞基(HMW-GQ和低分子量谷蛋白亞基(LMW-GQ的組成與面團(tuán)的粘彈性及延伸性密切相關(guān)，在一定程度上決定了面條的品質(zhì)。適合新疆拉面制作的面粉一般為中筋，且具有較好的延伸性。盧靜等人研究發(fā)現(xiàn)(蘆靜，黃天榮，聶莉小麥高分子量谷蛋白亞基及 1B/1R易位系對(duì)新疆拉面品質(zhì)性狀的影響[J],新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)2010,47(10) 1909-1917.)， HMW-GS 7+8,5+10,2+10等對(duì)新疆拉面的品質(zhì)有正向效應(yīng)，但未對(duì)Glu-Al位點(diǎn)的優(yōu)質(zhì) HMW-GS和優(yōu)質(zhì)LMW-GS予以說明。對(duì)優(yōu)質(zhì)拉面品種的HMW-GS和LMW-GS的分子標(biāo)記檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，除已發(fā)現(xiàn)的優(yōu)質(zhì)拉面亞基類型外，2*和Glu-B3a等亞基類型對(duì)新疆拉面的品質(zhì)也有一定的正向效應(yīng)。Glu-Al位點(diǎn)的Ax2*基因表達(dá)的2*亞基通過提高面筋強(qiáng)度(Payne P I， Lawrence G J. Catalogue of alleles for the complex gene loci, Glu-Al,Glu-Bl, and Glu-Dl which code for high molecular weight subunits of glutenin in hexaploid wheat [J]. Cereal Research Communications, 1983，11 :29-35.)，對(duì)拉面品質(zhì)有一定的貢獻(xiàn)。此外，1B/1R易位對(duì)小麥的蛋白特性也有顯著影響。小麥的IB染色體短臂被黑麥的 IR染色體短臂取代而形成小麥-黑麥1B/1R易位系。易位使普通小麥IB染色體短臂上 LMW-GS(Glu-B3位點(diǎn))和醇溶蛋白(Gli-Bl位點(diǎn))缺失，或被品質(zhì)較差的黑麥堿(secalin 基因編碼)取代，導(dǎo)致面團(tuán)粘性增大，強(qiáng)度降低，對(duì)面團(tuán)流變學(xué)特性和面條品質(zhì)都有極顯著的負(fù)面影響(Wieser H, Kieffer R, Lelley T. The influence of 1B/1R chromosome translocation on gluten protein composition and technological properties of bread wheat [J]. J Sci Food Agric，2000，80 :1640-1647.)。蘆靜(蘆靜，黃天榮，聶莉小麥高分子量谷蛋白亞基及1B/1R易位系對(duì)新疆拉面品質(zhì)性狀的影響[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2010,47(10) :1909-1917.)等研究發(fā)現(xiàn)，與非1B/1R易位系(不含有co-secalin基因)相比，1B/1R易位系(含有ω-secalin基因)的各項(xiàng)加工品質(zhì)均顯著降低，大多不能滿足優(yōu)質(zhì)拉面制作的要求，在新疆拉面品質(zhì)育種中應(yīng)當(dāng)淘汰。LMW-GS對(duì)小麥面粉加工品質(zhì)起著重要的作用，主要影響面筋的強(qiáng)度和延展性 (Cornish GB,Bekes F,Allen HM,et al. Flour proteins linked to quality traits in an Australian doubled haploid wheat population[J]. Aust J Agric Res,2001,52: 1339-1348.)。He等(He ZH,Liu L，Xia XC,et al,Composition of HMW and LMW glutenin subunits and their effects on dough properties,pan bread,and noodle quality of Chinese bread wheats [J]. Cereal Chem，2005，82 :345-350.)和 Liu 等(Liu L，He ZH, Yan J, et al. Allelic variation at the Glu-I and Glu_3 loci presence of the 1B/1R translocation, and their effectson mixographic properties in Chinese bread wheat [J]. Euphytica，2005，142 :197-204.)對(duì)中國(guó)小麥品種的 Glu-I 和 Glu-3 位點(diǎn)的等位變異做了較詳細(xì)的研究，表明Glu-A3和Glu-B3位點(diǎn)與面包和面條品質(zhì)相關(guān)，其中Glu_B3位點(diǎn)的d和b等位基因?qū)γ鎴F(tuán)延展性的作用大于其他等位基因；在對(duì)和面時(shí)間的貢獻(xiàn)上，表現(xiàn)為 Glu-Dl >Glu-B3> Glu-Al =Glu-Bl = Glu_A3 ；對(duì)面團(tuán)耐揉性而言，Glu-Dl > Glu_B3 =Glu-Bl > Glu-A3 > Glu-Al ；對(duì) SDS 沉淀值的影響大小依次為 Glu_B3 > Glu-Bl > Glu-Al > Glu-Dl > Glu-A30在提高面團(tuán)最大抗延阻力方面，不同的等位變異具有不同的效應(yīng)，在 Glu-A3 位點(diǎn)，b>d>e>c，在 Glu-B3 位點(diǎn)，i>b = a>e = f = g = h>c，在 Glu-D3 位點(diǎn)， e>b >a>c> d(Gupta RB，Singh NK，Shepherd KW. The cumulative effect of allelic variation in LMWand HMW glutenin subunits on dough properties in the progeny of two bread wheats[J]. Theor Appl Genet, 1989, 77 :57-64. Gupta RBiBekes FiWrigley CW. Prediction of physical dough properties from glutenin subunit composition in bread wheats[J]. Cereal Chem, 1991,68 :328-333.Metakovsky EV,Wrigley CW,Bekes F，et al· Gluten polypeptides as useful genetic markers of dough quality in Australian wheats [J]. Aust J Agric Res，1990,41 :289-306.)。而且近來很多育種學(xué)以及數(shù)量遺傳學(xué)等方面的研究認(rèn)為，LMW-GS對(duì)提高面團(tuán)的強(qiáng)度和延展性，進(jìn)而改良面包的品質(zhì)方面具有很高的正效應(yīng)(Nelson JCiAndreescu C，Breseghello F，et al. Quantitative trait locus analysis of wheat quality traits[J]. Euphytica，2006，149 145-159. Li Y，Song Y，Zhou R，et al. Detection of QTLs for bread-making quality in wheat using a recombinant inbred line population[J]. Plant Breeding, 2009,128 :235-243. Mann G，Diffey S，Cullis B，et al. Genetic control of wheat quality !interactions between chromosomal regions determining protein content and composition, dough rheology, and sponge and dough baking properties[J]. Theor Appl Genet，2009，118 1519-1537. Oury F-XiChiron H,Faye A,et al. The prediction of bread wheat quality joint use of the phenotypic information brought by technological tests and the eenetic information brought by HMW and LMW glutenin subunits [J]. Euphytica，2010， 171 :87-109. Raman R，Allen H，Diffey S，et al. Localization of quantitative trait loci for qualityattributes in a doubled haploid population of wheat(Triticum aestivum L.) [J] · Genome，2009，52 :701-715.)。 淀粉的含量、直鏈淀粉與支鏈淀粉的比例對(duì)面條的柔軟度、彈性和光滑度有很大影口向(Toyokawa H, Rubenthaler G L, Powers J R, et al. Japanese noodle qualities I. Flour components [J] · Cereal Chem, 1989,66 (5) :387-391.)，對(duì)面條的感官評(píng)價(jià)有重要影響。在小麥籽粒淀粉合成中，糯蛋白(Waxy)是合成直鏈淀粉的關(guān)鍵酶(Miura H，Tanii S,Nakamura T,et al. Genetic control of amylase content in wheat endosperm starch and differential effects of three Wx genes[J]. Theor Appl Genet,2000,100 (1) 32-38.)，由fe-Al、Wx-Bl和三個(gè)基因編碼合成(羅光彬，黃修文，尤明山，等小麥 fe基因研究進(jìn)展[J].糧油食品科技，2010，18(6) :1-4.)，它主要是通過直鏈淀粉含量影響面條品質(zhì)的。一般認(rèn)為直鏈淀粉含量低的面粉做出的面條評(píng)分高(趙俊曄，于振文小麥籽粒蛋白質(zhì)和淀粉代謝及其與品質(zhì)形成關(guān)系的研究進(jìn)展[J].麥類作物學(xué)報(bào)，2005，25 (3) 106-111.)。在普通小麥的三個(gè)fe蛋白亞基中，同樣缺失單個(gè)亞基的情況下，缺失fe-Bl亞基使直鏈淀粉減少得最多，同時(shí)也使得膨脹勢(shì)和峰值粘度增高幅度最大(Miura H，Araki E，Tarui S. Amylose synthesis capacity of the three Wx gene of wheat cv. ChineseSpring[J], Euphytica,1999,108(2) :91-95. Araki E, Miura H, Sawada S. Differential effects ofthe nullalleles at the three Wx loci on the starch-pasting properties of wheat[J]. Theor Appl Genet, 1991,97 :199-205.Yamamori M,Quynh N T. Differential effects of Wx-Al, Wx-Bl and Wx-Dl protein deficiencies on apparent amylase content and starch pasting properties in common wheat[J]. Theor Appl Genet,1994, 89 :276-觀0.)，面粉的面條加工品質(zhì)較好(劉建軍，何中虎，楊金，等小麥品種淀粉特性變異及其與面條品質(zhì)關(guān)系的研究[J]·中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003，36(1) :7-12. )0籽粒硬度的主效基因puroindoline位于5D染色體短臂，分為Pina和Pinb兩種類型，其不同變異對(duì)小麥磨粉品質(zhì)和食品加工品質(zhì)有重要的影響。Chen等(陳鋒，尚曉麗，董中東，等.中國(guó)小麥歷史品種puroindoline基因等位變異檢測(cè)[J].麥類作物學(xué)報(bào)，2011， 31(3) 389 394)研究表明，Pinb-Dlb比Pina-Dlb類型出粉率高、灰份低、具有更好的磨粉品質(zhì)，同時(shí)前者的饅頭、面條和面包加工品質(zhì)也均優(yōu)于Pina-Dlb和野生型。新疆拉面的傳統(tǒng)評(píng)價(jià)方法需要多種分析儀器、樣品用量大、測(cè)定周期長(zhǎng)，且很難實(shí)現(xiàn)大量材料、多個(gè)指標(biāo)的同時(shí)檢測(cè)，制約了新疆拉面的品質(zhì)改良和評(píng)價(jià)。隨著與小麥加工品質(zhì)相關(guān)基因的克隆及其分子標(biāo)記的開發(fā)，利用特異性引物對(duì)品質(zhì)基因進(jìn)行快速PCR檢測(cè)的方法得到廣泛應(yīng)用。但新疆拉面的品質(zhì)改良涉及多個(gè)基因，傳統(tǒng)的PCR方法一般一次只能檢測(cè)一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)基因，很難滿足拉面專用品種的選育及其后續(xù)篩選、加工、評(píng)價(jià)的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供用于鑒定或輔助鑒定待測(cè)小麥拉面品質(zhì)性狀相關(guān)基因的多重PCR引物對(duì)組、試劑盒，以及利用所述多重PCR引物對(duì)組鑒定或輔助鑒定待測(cè)小麥拉面品質(zhì)性狀的方法。本發(fā)明所提供的用于鑒定或輔助鑒定待測(cè)小麥拉面品質(zhì)性狀相關(guān)基因的多重PCR 引物對(duì)組為如下al)或a2)的引物對(duì)組al)由引物對(duì)組A和引物對(duì)組B組成的弓丨物對(duì)組；3幻引物對(duì)組A;所述引物對(duì)組A中的引物對(duì)均特異于拉面面筋強(qiáng)度、面筋質(zhì)量和磨粉品質(zhì)相關(guān)基因，具體由特異于Ax2*基因的一個(gè)引物對(duì)，特異于Pinb-Dlb基因的一個(gè)引物對(duì)，和特異于 ω-secalin基因的一個(gè)引物對(duì)組成；所述引物對(duì)組B中的引物對(duì)均特異于拉面面筋強(qiáng)度， 及粘性和光滑性相關(guān)基因，具體由特異于Glu-B3a基因(使拉面中等面筋強(qiáng)度相關(guān)基因) 的一個(gè)引物對(duì)，和特異于fe-Bl基因(拉面粘性和光滑性相關(guān)基因)的一個(gè)引物對(duì)組成；所述引物對(duì)組A中，所述特異于Ax2*基因的一個(gè)引物對(duì)為序列表中序列1和序列 2所示的兩條單鏈DNA組成的引物對(duì)1 ；所述特異于PinbDlb基因的一個(gè)引物對(duì)為序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的引物對(duì)2 ；所述特異于ω-secalin基因的一個(gè)引物對(duì)為序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的引物對(duì)3。所述引物對(duì)組B中，所述特異于Glu_B3a基因的一個(gè)引物對(duì)為序列表中序列7和序列8所示的兩條單鏈DNA組成的引物對(duì)4 ；所述特異于Wx-Bl基因的一個(gè)引物對(duì)為序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的引物對(duì)5。
其中，序列1由21個(gè)核苷酸組成；序列2由20個(gè)核苷酸組成；序列3由21個(gè)核苷酸組成；序列4由18個(gè)核苷酸組成；序列5由20個(gè)核苷酸組成；序列6由20個(gè)核苷酸組成；序列7由20個(gè)核苷酸組成；序列8由19個(gè)核苷酸組成；序列9由25個(gè)核苷酸組成；序列10由22個(gè)核苷酸組成。本發(fā)明中，所述^31基因有兩個(gè)等位基因，分別是化-81￡1和fe-Blb。所述引物對(duì)組A中每個(gè)引物對(duì)的兩條引物在PCR反應(yīng)體系中等量使用，且所述引物對(duì)1，所述引物對(duì)2和所述引物對(duì)3在PCR反應(yīng)體系中的摩爾比為1 1 1;所述特異引物對(duì)組B中每個(gè)引物對(duì)的兩條引物在PCR反應(yīng)體系中等量使用，且所述引物對(duì)4和所述引物對(duì)5在PCR反應(yīng)體系中的摩爾比為5 2。含有所述用于鑒定或輔助鑒定待測(cè)小麥拉面品質(zhì)性狀相關(guān)基因的多重PCR引物對(duì)組的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述用于鑒定或輔助鑒定待測(cè)小麥拉面品質(zhì)性狀相關(guān)基因的多重PCR引物對(duì)組的制備方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。該制備方法具體可包括將所述用于鑒定或輔助鑒定待測(cè)小麥拉面品質(zhì)性狀相關(guān)基因的多重PCR引物對(duì)組中各引物對(duì)的所述兩條單鏈DNA分別單獨(dú)包裝的步驟。所述試劑盒的制備方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。該制備方法具體可包括如下步驟將所述用于鑒定或輔助鑒定待測(cè)小麥拉面品質(zhì)性狀相關(guān)基因的多重PCR引物對(duì)組中各引物對(duì)的所述兩條單鏈DNA分別單獨(dú)包裝后，與下述物質(zhì)中的至少一種包裝在同一試劑盒內(nèi)PCR反應(yīng)緩沖液、DNA聚合酶和4種dNTP。鑒定或輔助鑒定待測(cè)小麥?zhǔn)欠窈蠥x2*基因、Pinb-Dlb基因和co-secalin基因這三種基因中的至少一種，是否含有Glu-B3a基因，以及含有fe-Bla基因和fe-Blb基因這兩種基因中哪一種的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。該方法包括下述(1)和O)的步驟所述(1)為如下A)和B)A)以待測(cè)小麥的基因組DNA為模板，用所述引物對(duì)組A進(jìn)行PCR反應(yīng)，所述PCR反應(yīng)的退火溫度為從62°C起，每進(jìn)行IfPCR反應(yīng)循環(huán)下降0. rc ；在本發(fā)明的實(shí)施例中，用所述引物對(duì)組A進(jìn)行PCR反應(yīng)共進(jìn)行了 35個(gè)循環(huán)；B)以待測(cè)小麥的基因組DNA為模板，用所述引物對(duì)組B進(jìn)行PCR反應(yīng)，所述PCR反應(yīng)的退火溫度為55. 50C ；(2)檢測(cè)步驟(1)得到的PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法根據(jù)PCR產(chǎn)物確定所述待測(cè)小麥?zhǔn)欠窈蠥x2*基因、Pinb-Dlb基因和ω -secalin基因這三種基因中的至少一種，是否含有Glu-B3a基因，以及含有fe-Bla基因和fe-Blb基因這兩種基因中哪一種以所述引物對(duì)組A的進(jìn)行PCR反應(yīng)的產(chǎn)物中，如果含有大小為1319bp的DNA片段， 所述待測(cè)小麥含有Ax2*基因或候選含有Ax2*基因；如果不含有大小為1319bp的DNA片段， 所述待測(cè)小麥不含有Ax2*基因或候選不含有Ax2*基因；如果含有大小為250bp的DNA片段， 所述待測(cè)小麥含有Pinb-Dlb基因或候選含有Pinb-Dlb基因；如果不含有大小為250bp的 DNA片段，所述待測(cè)小麥不含有Pinb-Dlb基因或候選不含有Pinb-Dlb基因；如果含有大小為1067bp的DNA片段，所述待測(cè)小麥含有ω-secalin基因或候選含有co-secalin基因； 如果不含有大小為1067bp的DNA片段，所述待測(cè)小麥不含有ω-secalin基因或候選不含有 ω-secalin 基因；以所述引物對(duì)組B的進(jìn)行PCR反應(yīng)的產(chǎn)物中，如果含有大小為1095bp的DNA片段， 所述待測(cè)小麥含有Glu-B3a基因或候選含有Glu-B3a基因；如果不含有大小為1095bp的 DNA片段，所述待測(cè)小麥不含有Glu-B3a基因或候選不含有Glu_B3a基因；如果含有大小為 425bp的DNA片段，所述待測(cè)小麥含有Wx-Bla基因或候選含有Wx-Bla基因；如果不含有大小為42^p的DNA片段，所述待測(cè)小麥含有fe-Blb基因或候選含有基因。鑒定或輔助鑒定待測(cè)小麥?zhǔn)欠窈蠥x2*基因、Pinb-Dlb基因和ω-secalin基因這三種基因中的至少一種的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。該方法包括下述(1)和O)的步驟(1)以待測(cè)小麥的基因組DNA為模板，用所述引物對(duì)組A進(jìn)行PCR反應(yīng)，所述PCR 反應(yīng)的退火溫度為從62°C起，每進(jìn)行1個(gè)PCR反應(yīng)循環(huán)下降0. 1°C，在本發(fā)明的實(shí)施例中， 用所述引物對(duì)組A進(jìn)行PCR反應(yīng)共進(jìn)行了 35個(gè)循環(huán)。(2)檢測(cè)步驟(1)得到的PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法根據(jù)PCR產(chǎn)物確定所述待測(cè)小麥?zhǔn)欠窈蠥x2*基因、Pinb-Dlb基因和ω-secalin基因這三種基因中的至少一種以所述引物對(duì)組A的進(jìn)行PCR反應(yīng)的產(chǎn)物中，如果含有大小為1319bp的DNA片段， 所述待測(cè)小麥含有Ax2*基因或候選含有Ax2*基因；如果不含有大小為1319bp的DNA片段， 所述待測(cè)小麥不含有Ax2*基因或候選不含有Ax2*基因；如果含有大小為250bp的DNA片段， 所述待測(cè)小麥含有Pinb-Dlb基因或候選含有Pinb-Dlb基因；如果不含有大小為250bp的 DNA片段，所述待測(cè)小麥不含有Pinb-Dlb基因或候選不含有Pinb-Dlb基因；如果含有大小為1067bp的DNA片段，所述待測(cè)小麥含有ω-secalin基因或候選含有ω-secalin基因； 如果不含有大小為1067bp的DNA片段，所述待測(cè)小麥不含有ω-secalin基因或候選不含有 ω-secalin 基因。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育拉面小麥品種的方法。該方法包括采用如下a)_e)中至少一種的小麥作為親本進(jìn)行育種的步驟a)含有或候選含有Ax2*基因；b)含有或候選含有Pinb-Dlb基因；c)不含或候選不含有ω-secal in基因；d)含有或候選含有Glu_B3a基因；e)含有或候選含有fe-Blb基因。從眾多小麥品種中選擇滿足a)_e)中至少一項(xiàng)的小麥的方法，即為上述鑒定或輔助鑒定待測(cè)小麥?zhǔn)欠窈蠥x2*基因、Pinb-Dlb基因和co-secalin基因這三種基因中的至少一種，是否含有Glu-B3a基因，以及含有fe-Bla基因和fe-Blb基因這兩種基因中哪一種的方法。所選擇的小麥滿足上述a)-e)五項(xiàng)中的項(xiàng)數(shù)越多，表示所選擇的小麥越適合制作拉面。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述待測(cè)小麥具體為新疆冬小麥，如小麥品種(系)新冬22 號(hào)、新冬23號(hào)、藁優(yōu)8901、HD04-23、79-18、新冬14號(hào)、新冬對(duì)號(hào)、新冬觀號(hào)、新冬18號(hào)、冀麥26、奎冬4號(hào)、石冬8號(hào)、85(1) ,89(35)、80182、花91_26、89_44、新冬2號(hào)、新冬7號(hào)、華北497,91 (28)、89-2012、新冬19號(hào)、冀麥31、石冬9號(hào)和87YF5等。利用本發(fā)明對(duì)上述小麥品種(系)進(jìn)行鑒定或輔助鑒定后，發(fā)現(xiàn)小麥品種(系)石冬8號(hào)具有拉面面筋強(qiáng)度、面筋質(zhì)量和磨粉品質(zhì)優(yōu)質(zhì)基因AUi^nPinb-Dlb的同時(shí)，又不含有影響拉面品質(zhì)的ω-secalin 基因；小麥品種(系)華北497和冀麥31同時(shí)具有拉面粘性和光滑性優(yōu)質(zhì)基因Glu-B3a和 Wx-Blb0本發(fā)明所提供的引物對(duì)組A或引物對(duì)組B的各引物對(duì)之間不存在相互抑制作用和錯(cuò)配，檢測(cè)品種(系)的結(jié)果可靠、重復(fù)性好，成本低。本發(fā)明所提供的引物對(duì)組A或引物對(duì)組B均選用同樣的退火溫度，實(shí)現(xiàn)了相同溫度一次PCR完成一組基因的鑒別，且特異性強(qiáng)， 檢測(cè)過程耗時(shí)短。將本發(fā)明含有引物對(duì)組A或引物對(duì)組B的多重PCR體系用于小麥品質(zhì)育種的親本評(píng)價(jià)和雜交后代優(yōu)質(zhì)基因的聚合，將會(huì)提高優(yōu)質(zhì)拉面專用小麥品種評(píng)價(jià)和選育的效率，加快拉面專用小麥品種的加工品質(zhì)改良。


圖1為Ax2*、Pinb_Dlb和ω-secalin基因標(biāo)記的多重PCR瓊脂糖凝膠電泳圖。圖2為Glu_B3a、Wx-Bla和基因標(biāo)記的多重PCR瓊脂糖凝膠電泳圖。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、拉面面筋強(qiáng)度、面筋質(zhì)量和磨粉品質(zhì)相關(guān)基因的多重PCR檢測(cè)本實(shí)施例的多重PCR引物對(duì)組由特異于Ax2*基因的一個(gè)引物對(duì)，特異于Pinb-Dlb 基因的一個(gè)引物對(duì)，和特異于ω-secalin基因的一個(gè)引物對(duì)組成；其中，所述特異于Ax2* 基因的一個(gè)引物對(duì)為序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的引物對(duì)1 ；所述特異于Pinb-Dlb基因的一個(gè)引物對(duì)為序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的引物對(duì)2 ；所述特異于ω-secalin基因的一個(gè)引物對(duì)為序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的引物對(duì)3。本實(shí)施例的多重PCR引物對(duì)組可用于同時(shí)檢測(cè)Ax2*、Pinb-Dlb和ω-secalin基因。在Glu-Al位點(diǎn)含有Ax2*基因的材料中，PCR擴(kuò)增出大小為1319bp的一條帶；在含有 Pinb-Dlb基因的材料中，PCR擴(kuò)增出大小為250bp的一條帶；在含有ω-secalin基因的材料中，PCR擴(kuò)增出大小為1067bp的一條帶。一、已知基因型小麥品種拉面面筋強(qiáng)度、面筋質(zhì)量和磨粉品質(zhì)相關(guān)基因的多重PCR 擴(kuò)增1、小麥基因組的制備采用CTAB法對(duì)5份已知基因型的小麥品種(系)進(jìn)行基因組DNA的提取，得到對(duì)應(yīng)于5份已知基因型的小麥品種(系)的基因組DNA，作為拉面面筋強(qiáng)度、面筋質(zhì)量和磨粉品質(zhì)相關(guān)基因多重PCR擴(kuò)增的模板。其中，5份已知基因型的小麥品種(系)依次為新冬22 號(hào)、新冬23號(hào)、藁優(yōu)8901、HD04-23和79-18。王亮等(王亮，穆培源，徐紅軍，等.新疆小麥品種高分子量麥谷蛋白亞基組成分析[J].麥類作物學(xué)報(bào)，2008，觀(3) =430-435.王亮，穆培源，桑偉，等.新疆小麥品種籽粒硬度及puroindoline基因等位變異的分子檢測(cè)[J].麥類作物學(xué)報(bào)，2010，30(1) :17-22.王亮，穆培源，徐紅軍，等.新疆小麥1BL/1RS易位和Dx5 基因的多重PCR檢測(cè)及其面筋品質(zhì)分析[J],麥類作物學(xué)報(bào)，2011,31(3) :469-474.)對(duì)這五個(gè)小麥品種(系)的Glu-Al和Pinb-Dl基因的基因型，以及是否含有co-secalin基因進(jìn)行了分子標(biāo)記檢測(cè)，詳見表1。 表1已知基因型小麥品種(系)拉面面筋強(qiáng)度、面筋質(zhì)量和磨粉品質(zhì)相關(guān)基因的基因型
權(quán)利要求
1.用于鑒定或輔助鑒定待測(cè)小麥拉面品質(zhì)性狀相關(guān)基因的多重PCR引物對(duì)組，所述拉面品質(zhì)性狀相關(guān)基因?yàn)锳x2*基因、Pinb-Dlb基因、co-secalin基因、Glu_B3a基因和基因，其特征在于所述多重PCR引物對(duì)組由引物對(duì)組A和引物對(duì)組B組成；所述引物對(duì)組 A由特異于所述Ax2*基因的一個(gè)引物對(duì)，特異于所述Pinb-Dlb基因的一個(gè)引物對(duì)，和特異于所述ω-secalin基因的一個(gè)引物對(duì)組成；所述引物對(duì)組B由特異于所述Glu-B3a基因的一個(gè)引物對(duì)，和特異于所述fe-Bl基因的一個(gè)引物對(duì)組成；所述引物對(duì)組A中，所述特異于Ax2*基因的一個(gè)引物對(duì)為序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的引物對(duì)1 ；所述特異于Pinb-Dlb基因的一個(gè)引物對(duì)為序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的引物對(duì)2 ；所述特異于ω-secalin基因的一個(gè)引物對(duì)為序列表中序列5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的引物對(duì)3 ；所述引物對(duì)組B中，所述特異于Glu-B3a基因的一個(gè)引物對(duì)為序列表中序列7和序列 8所示的兩條單鏈DNA組成的引物對(duì)4;所述特異于Wx-Bl基因的一個(gè)引物對(duì)為序列表中序列9和序列10所示的兩條單鏈DNA組成的引物對(duì)5。
2.用于鑒定或輔助鑒定待測(cè)小麥拉面品質(zhì)性狀相關(guān)基因的多重PCR引物對(duì)組，為權(quán)利要求1中的所述引物對(duì)組A，由特異于所述Ax2*基因的一個(gè)引物對(duì)，特異于所述Pinb-Dlb 基因的一個(gè)引物對(duì)，和特異于所述ω-secalin基因的一個(gè)引物對(duì)組成；所述特異于Ax2*基因的一個(gè)引物對(duì)為序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA組成的引物對(duì)1 ；所述特異于Pinb-Dlb基因的一個(gè)引物對(duì)為序列表中序列3和序列4所示的兩條單鏈DNA組成的引物對(duì)2 ；所述特異于ω-secalin基因的一個(gè)引物對(duì)為序列表中序列 5和序列6所示的兩條單鏈DNA組成的引物對(duì)3。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的引物對(duì)組，其特征在于所述引物對(duì)組A中每個(gè)引物對(duì)的兩條引物在PCR反應(yīng)體系中等量使用，且所述引物對(duì)1，所述引物對(duì)2和所述引物對(duì)3在 PCR反應(yīng)體系中的摩爾比為1 1 1 ；所述特異引物對(duì)組B中每個(gè)引物對(duì)的兩條引物在 PCR反應(yīng)體系中等量使用，且所述引物對(duì)4和所述引物對(duì)5在PCR反應(yīng)體系中的摩爾比為5 · 2 ο
4.含有權(quán)利要求1-3中任一所述引物對(duì)組的試劑盒。
5.權(quán)利要求1-3中任一所述引物對(duì)組的制備方法，其特征在于所述制備方法包括將權(quán)利要求1-3中任一所述引物對(duì)組中各引物對(duì)的所述兩條單鏈DNA分別單獨(dú)包裝的步驟。
6.權(quán)利要求4所述PCR試劑盒的制備方法，包括如下步驟將權(quán)利要求1-3中任一所述的引物對(duì)組中各引物對(duì)的所述兩條單鏈DNA分別單獨(dú)包裝后，與下述物質(zhì)中的至少一種包裝在同一試劑盒內(nèi)PCR反應(yīng)緩沖液、DNA聚合酶和4種dNTP。
7.鑒定或輔助鑒定待測(cè)小麥?zhǔn)欠窈蠥x2*基因、Pinb-Dlb基因和co-secalin基因這三種基因中的至少一種，是否含有Glu-B3a基因，以及含有fe-Bla基因和fe-Blb基因這兩種基因中哪一種的方法，其特征在于所述方法包括下述(1)和O)的步驟所述(1)為如下A)和B)A)以待測(cè)小麥的基因組DNA為模板，用權(quán)利要求1或3所述引物對(duì)組中的所述引物對(duì)組A進(jìn)行PCR反應(yīng)，所述PCR反應(yīng)的退火溫度為從62°C起，每進(jìn)行1個(gè)PCR反應(yīng)循環(huán)下降.0. rc ；B)以待測(cè)小麥的基因組DNA為模板，用權(quán)利要求1或3所述引物對(duì)組中的所述引物對(duì)組B進(jìn)行PCR反應(yīng)，所述PCR反應(yīng)的退火溫度為55. 5°C ；(2)檢測(cè)步驟(1)得到的PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法根據(jù)PCR產(chǎn)物確定所述待測(cè)小麥?zhǔn)欠窈蠥x2*基因、Pinb-Dlb基因和ω-secalin基因這三種基因中的至少一種，是否含有Glu-B3a基因，以及含有fe-Bla基因和fe-Blb基因這兩種基因中哪一種以所述引物對(duì)組A的進(jìn)行PCR反應(yīng)的產(chǎn)物中，如果含有大小為1319bp的DNA片段，所述待測(cè)小麥含有Ax2*基因或候選含有Ax2*基因；如果不含有大小為1319bp的DNA片段，所述待測(cè)小麥不含有Ax2*基因或候選不含有Ax2*基因；如果含有大小為250bp的DNA片段， 所述待測(cè)小麥含有Pinb-Dlb基因或候選含有Pinb-Dlb基因；如果不含有大小為250bp的 DNA片段，所述待測(cè)小麥不含有Pinb-Dlb基因或候選不含有Pinb-Dlb基因；如果含有大小為1067bp的DNA片段，所述待測(cè)小麥含有ω-secalin基因或候選含有co-secalin基因； 如果不含有大小為1067bp的DNA片段，所述待測(cè)小麥不含有ω-secalin基因或候選不含有 ω-secalin 基因；以所述引物對(duì)組B的進(jìn)行PCR反應(yīng)的產(chǎn)物中，如果含有大小為1095bp的DNA片段，所述待測(cè)小麥含有Glu-B3a基因或候選含有Glu-B3a基因；如果不含有大小為1095bp的DNA片段，所述待測(cè)小麥不含有Glu-B3a基因或候選不含有Glu-B3a基因；如果含有大小為的DNA片段，所述待測(cè)小麥含有Wx-Bla基因或候選含有Wx-Bla基因；如果不含有大小為 425bp的DNA片段，所述待測(cè)小麥含有fe-Blb基因或候選含有基因。
8.鑒定或輔助鑒定待測(cè)小麥?zhǔn)欠窈蠥x2*基因、Pinb-Dlb基因和co-secalin基因這三種基因中的至少一種的方法，其特征在于所述方法包括下述(1)和O)的步驟該方法包括下述(1)和O)的步驟(1)以待測(cè)小麥的基因組DNA為模板，用權(quán)利要求2或3所述引物對(duì)組中的所述引物對(duì)組A進(jìn)行PCR反應(yīng)，所述PCR反應(yīng)的退火溫度為從62°C起，每進(jìn)行1個(gè)PCR反應(yīng)循環(huán)下降0. rc ；(2)檢測(cè)步驟(1)得到的PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法根據(jù)PCR產(chǎn)物確定所述待測(cè)小麥?zhǔn)欠窈蠥x2*基因、Pinb-Dlb基因和co-secalin基因這三種基因中的至少一種以所述引物對(duì)組A的進(jìn)行PCR反應(yīng)的產(chǎn)物中，如果含有大小為1319bp的DNA片段，所述待測(cè)小麥含有Ax2*基因或候選含有Ax2*基因；如果不含有大小為1319bp的DNA片段，所述待測(cè)小麥不含有Ax2*基因或候選不含有Ax2*基因；如果含有大小為250bp的DNA片段， 所述待測(cè)小麥含有Pinb-Dlb基因或候選含有Pinb-Dlb基因；如果不含有大小為250bp的 DNA片段，所述待測(cè)小麥不含有Pinb-Dlb基因或候選不含有Pinb-Dlb基因；如果含有大小為1067bp的DNA片段，所述待測(cè)小麥含有ω-secalin基因或候選含有co-secalin基因； 如果不含有大小為1067bp的DNA片段，所述待測(cè)小麥不含有ω-secalin基因或候選不含有 ω-secalin 基因。
9.一種培育拉面小麥品種的方法，包括采用通過權(quán)利要求7的方法鑒定得到的如下 a)-e)中至少一種的小麥作為親本進(jìn)行育種的步驟a)含有或候選含有Ax2*基因；b)含有或候選含有Pinb-Dlb基因；c)不含或候選不含有ω-secalin基因；d)含有或候選含有Glu-B3a基因；e)含有或候選含有^^讓基因。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于所述小麥為新疆冬小麥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于鑒定或輔助鑒定小麥拉面品質(zhì)性狀基因的PCR體系及其應(yīng)用。本發(fā)明的PCR體系中的引物對(duì)組為下述1)或2)1)引物對(duì)組A和引物對(duì)組B；2)引物對(duì)組A；所述引物對(duì)組A中的三個(gè)引物對(duì)分別由序列1和序列2所示兩條DNA單鏈，序列3和序列4所示兩條DNA單鏈，序列5和序列6所示兩條DNA單鏈組成；所述引物對(duì)組B兩個(gè)引物對(duì)分別由序列7和序列8所示兩條DNA單鏈，序列9和序列10所示兩條DNA單鏈組成。本發(fā)明所提供的引物對(duì)組各引物對(duì)間不存在抑制和錯(cuò)配，實(shí)現(xiàn)了相同溫度一次PCR完成一組基因的鑒別，且結(jié)果可靠、重復(fù)性好，特異性強(qiáng)，成本低，耗時(shí)短，為優(yōu)質(zhì)拉面小麥品種選育及加工品質(zhì)改良提供依據(jù)。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102399892SQ20111039810
公開日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2011年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月2日
發(fā)明者崔鳳娟, 張曉科, 徐紅軍, 桑偉, 王曉龍, 相吉山, 穆培源, 聶迎彬, 鄒波, 韓新年 申請(qǐng)人:新疆農(nóng)墾科學(xué)院