專利名稱：Npm1基因突變檢測方法及其試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，具體是NPMl基因突變檢測方法及其試劑盒。
背景技術：
NPMl是一種廣泛表達的磷蛋白質，其作用為在細胞核與細胞漿之間穿梭，可與 ALK, RARa和MLF-I等形成融合基因，參與多種白血病或淋巴瘤的發(fā)病。近來，多項研究顯示46-62%的正常核型AML患者存在NPMl基因的突變，成為正常核型AML患者最常見的基因突變，而在異常核型AML患者中也有25%以上存在NPMl突變(BLOOD. 2006 107 4514-4523 ；BLOOD. 2007 109:874-885)。目前，國際上有報道的NPMl突變類型有30種以上，其中最常見的類型為12號外顯子發(fā)生4個堿基的重復導致蛋白C端結構改變，A型 (TCTG插入)占接近80%，B型(CATG插入)占6%左右，D型(CCTG插入)占6%左右。攜帶NPMl突變的AML患者表現出NPMl蛋白異常的胞漿內分布(正常情況下分布于細胞核內)，多發(fā)生于女性，骨髓原始細胞比例、血LDH、白細胞及血小板計數高于野生型患者，其白血病細胞的CD34呈低表達或缺如。由于NPMl基因具有腫瘤抑制基因的功能，可調節(jié)p53 信號通路，有學者推測NPMl基因的突變可影響p53信號并進而導致遺傳學不穩(wěn)定性，因此 NPMl基因的突變使得AML細胞能夠獲得其它的遺傳學改變。大約40%伴NPMl突變的AML 患者可同時檢測到FLT3-ITD，不伴有FLT3-ITD而攜帶NPMl突變(NPMllmut/FLT3_ITDneg) 的患者治愈后良好。伴有NPMl突變的AML患者FLT3基因突變(包括ITD和點突變)的檢出率大約是NPMl野生型AML患者的2倍。NPMl基因突變診斷對AML的診斷及分型具有重要臨床意義。2007年，美國國立綜合癌癥網絡(NCCN)將NPMl突變診斷作為AML患者檢查項目，對于NPMl突變患者具有不同的治療方案。目前，國內還沒有對NPMl基因進行一個大標本量的檢測，傳統(tǒng)的檢測方法只能檢測A、B、D即12號外顯子發(fā)生4個堿基的重復導致蛋白C端結構改變的突變類型。

發(fā)明內容
本發(fā)明正是針對以上技術問題，自行設計了 PCR擴增引物和測序引物，并研制了一種檢測范圍廣，檢測費用低，檢測靈敏度高的NPMl基因突變檢測方法及其試劑盒。本發(fā)明通過以下技術方案來實現本發(fā)明提供NPMl基因突變檢測方法，包括以下步驟(e)提取待檢樣本的DNA ；(f)用自行設計的用于檢測NPMl基因12號外顯子開放閱讀框多種突變位點的擴增引物對步驟(a)中的待檢樣本DNA進行PCR擴增；(g)用自行設計的用于檢測NPMl基因12號外顯子開放閱讀框多種突變位點的測序引物對步驟(b)中擴增后的DNA進行測序；(h)將步驟(c)中的測序結果與標準NPMl基因12號外顯子開放閱讀框進行比較， 并進行序列分析，即可找出突變類型與突變位點。
本發(fā)明根據人5號染色體基因組序列登錄號NT_023133. 13設計NPMl基因12號外顯子開放閱讀框相關引物如下，NPMl基因12號外顯子開放閱讀框PCR擴增引物NPMlF 5' -TCGGGAGATGAAGTTGGAAGTA-3 ‘ (NT_023133. 13 :15648494 15648515)；NPMlR 5' -CATTTATCAAACACGGTAGGGA-3 ‘ (NT_023133. 13 :15648943 15648964)；NPMl基因12號外顯子開放閱讀框測序反應引物NPM1R2 :5，-GGACAGCCAGATATCAACT-3’ (ΝΤ_023133· 13 :15648899 15648917)。本發(fā)明還提供NPMl基因突變檢測試劑盒，包括PCR Amplification Mixture ； Primer (sense, antisense) > HotStarTaq Sl^ffl^bBS^ Sequencing Mixture。本發(fā)明提供的NPMl基因突變檢測試劑盒采用HotStarI1aq DNA Polymerase作為熱啟動酶，擴增反應體系為每50μ 1中含5μ 1的10倍擴增緩沖液、2 μ 1濃度為25mM的 Mg2+、2y 1濃度為IOmM的dNIPs、l. 5μ 1濃度為10 μ M的正向引物、1. 5 μ 1濃度為10 μ M的反向引物、0. 3μ 1的Taq DNA聚合酶、1 μ 1的DNA模板、余量為mH20，測序反應體系為4μ 1 的 BigdyeV3. 1、3μ 1 的 πιΗ20、1μ 1 濃度為 10 μ M 的 kquencing 引物(F，R)、2y 1 的 PCR 產物。本發(fā)明提供的NPMl基因突變檢測試劑盒采用的擴增反應步驟為先95°C反應 15min，進入循環(huán)，循環(huán)中先94°C反應0. 5min,然后56°C反應0. 5min,然后72°C反應Imin為一個循環(huán)，共反應35個循環(huán)然后72°C反應7min，最后4°C保存。本發(fā)明提供的NPMl基因突變檢測試劑盒采用的測序反應步驟為先94°C反應 0. 5min，然后50°C反應0. 5min，然后60°C反應2. Omin為一個循環(huán)，共反應M個循環(huán)。
具體實施例方式下面以幾例檢測到的新型突變樣本為例對本發(fā)明做進一步說明。(a)提取待檢樣本的DNA ；(b)用自行設計的用于檢測NPMl基因12號外顯子開放閱讀框多種突變位點的擴增引物對步驟(a)中的待檢樣本DNA進行PCR擴增；(c)用自行設計的用于檢測NPMl基因12號外顯子開放閱讀框多種突變位點的測序引物對步驟(b)中擴增后的DNA進行測序；(d)將步驟(c)中的測序結果與標準NPMl基因12號外顯子開放閱讀框進行比較，并進行序列分析，共找出兩種新型突變，根據基因登陸號NM_002520 —種新型突變?yōu)樵?016與1017位堿基之間插入ATCC，且1021與1022位堿基從AG置換為CC突變。一種新型突變?yōu)樵?022與1023位堿基之間插入AGCC，且1026-10 位堿基從AGG置換為CCC 突變。此兩種突變在國際國內上均屬首次報道。
權利要求
1.本發(fā)明提供NPMl基因突變檢測方法，包括以下步驟(a)提取待檢樣本的DNA；(b)用自行設計的用于檢測NPMl基因12號外顯子開放閱讀框多種突變位點的擴增引物對步驟(a)中的待檢樣本DNA進行PCR擴增；(c)用自行設計的用于檢測NPMl基因12號外顯子開放閱讀框多種突變位點的測序引物對步驟(b)中擴增后的DNA進行測序；(d)將步驟(c)中的測序結果與標準NPMl基因12號外顯子開放閱讀框進行比較，并進行序列分析，即可找出突變類型與突變位點。
2.本發(fā)明根據人5號染色體基因組序列登錄號NT_023133.13設計NPMl基因12號外顯子開放閱讀框相關引物如下，NPMl基因12號外顯子開放閱讀框PCR擴增引物NPMlF :5’ -TCGGGAGATGAAGTTGGAAGTA-3’ (NT_023133. 13 :15648494 15648515)；NPMlR :5’ -CATTTATCAAACACGGTAGGGA-3’ (NT_023133. 13 :15648943 15648964)；NPMl基因12號外顯子開放閱讀框測序反應引物NPM1R2 :5，-GGACAGCCAGATATCAACT-3’ (ΝΤ_023133· 13 :15648899 15648917)。
3.本發(fā)明還提供NPMl基因突變檢測試劑盒，包括PCRAmplification Mixture ； Primer (sense, antisense) > HotStarTaq Sl^ffl^bBS^ Sequencing Mixture。
4.根據權利要求3述NPMl基因突變檢測試劑盒，其特征在于NPMl基因突變檢測試劑盒采用HotStarTaq DNA Polymerase作為熱啟動酶，擴增反應體系為每50 μ 1中含5 μ 1 的10倍擴增緩沖液、2 μ 1濃度為25mM的Mg2+、2 μ 1濃度為IOmM的dNTPs、1. 5 μ 1濃度為 ΙΟμΜ的正向引物、1. 5μ 1濃度為ΙΟμΜ的反向引物、0. 3μ 1的Taq DNA聚合酶、1 μ 1的DNA 模板、余量為mH20，測序反應體系為4μ 1的BigdyeV3. 1、3μ 1的πιΗ20、1μ 1濃度為ΙΟμΜ 的 kquencing 引物(F，R),2y 1 的 PCR 產物。
5.根據權利要求3述NPMl基因突變檢測試劑盒，其特征在于NPMl基因突變檢測試劑盒采用的擴增反應步驟為先95°C反應15min，進入循環(huán)，循環(huán)中先94°C反應0. 5min，然后 56°C反應0. 5min，然后72°C反應Imin為一個循環(huán)，共反應35個循環(huán)然后72°C反應7min， 最后4 °C保存。
6.根據權利要求3述NPMl基因突變檢測試劑盒，其特征在于NPMl基因突變檢測試劑盒采用的測序反應步驟為先94?！鉉反應0. 5min，然后50?！鉉反應0. 5min，然后60。V反應2. Omin為一個循環(huán)，共反應M個循環(huán)。
全文摘要
NPM1是一種廣泛表達的磷蛋白質，其作用為在細胞核與細胞漿之間穿梭，可與ALK、RARα和MLF-1等形成融合基因，參與多種白血病或淋巴瘤的發(fā)病。NPM1基因突變診斷對AML的診斷及分型具有重要臨床意義。本發(fā)明自行設計了PCR擴增引物和測序引物，并研制了一種檢測范圍廣，檢測費用低，檢測靈敏度高的NPM1基因突變檢測方法及其試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK102382896SQ20111039916
公開日2012年3月21日 申請日期2011年12月6日 優(yōu)先權日2011年12月6日
發(fā)明者費敏 申請人:蘇州蘇大賽爾免疫生物技術有限公司