專利名稱：一種可用于Real Time-PCR擴(kuò)增鏈霉菌DNA的特異性引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種可用于Real Time-PCR擴(kuò)增鏈霉菌DNA的特異性引物。
背景技術(shù)：
鏈霉菌(Sti^ptomyces)是一種地理分布和寄主范圍均很廣泛的放線菌，主要在土壤和腐敗的植物中發(fā)現(xiàn)，大部分鏈霉菌會(huì)產(chǎn)生孢子，是重要的腐生物，并且會(huì)使土壤產(chǎn)生土腥味。鏈霉菌屬于ActincAacteria，大概550種鏈霉菌已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，并且不斷有新種被發(fā)現(xiàn)。鏈霉菌家族對(duì)人類的一個(gè)重要貢獻(xiàn)就是產(chǎn)生各種抗生素。鏈霉素、四環(huán)素、和紅霉素等都是由它們產(chǎn)生的。鏈霉菌在土壤中可以忍受極端的環(huán)境。科學(xué)家從測(cè)出的基因組序列中發(fā)現(xiàn)，鏈霉菌擁有大量基因以適應(yīng)不同的環(huán)境，其中大約12%的基因是負(fù)責(zé)打開或者關(guān)閉其他基因。抗生素的濫用給細(xì)菌施加了強(qiáng)大的自然選擇壓力，測(cè)定鏈霉菌的基因組可以幫助制造更有效的抗生素，在某種程度上克服細(xì)菌的抗藥性。只有少部分的鏈霉菌是病原體，主要是植物病原體，感染植物根系，例如 Streptomyces caviscabies, Streptomyces acidiscabies,也會(huì)使馬鈴薯得馬鈴薯疫痂病。Streptomyces somaliensis 禾口 Streptomyces sudanensis 感染人體后會(huì)得足分支菌病。目前，擴(kuò)增鏈霉菌的特異引物擴(kuò)增的片段大多為500bp或者更大，不利于應(yīng)用到 Real Time-PCR定量的檢測(cè)樣品中的鏈霉菌。對(duì)于分布廣泛和功能強(qiáng)大的鏈霉菌，如果能設(shè)計(jì)特異性的引物，運(yùn)用Real Time-PCR技術(shù)定量檢測(cè)樣品中鏈霉菌的豐度，對(duì)于實(shí)驗(yàn)室研究和實(shí)際應(yīng)用，有很大的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決目前缺乏弓丨物從樣品DNA中以Real Time PCR擴(kuò)增出鏈霉菌靶標(biāo)序列的問題，而提供一種用于擴(kuò)增鏈霉菌的特異性引物。一種用于擴(kuò)增鏈霉菌屬細(xì)菌DNA的特異性引物，其正向引物SF序列如SEQ IDNo. 1 所示，反向引物SR序列如SEQ ID No. 2所示。所述的用于擴(kuò)增鏈霉菌屬細(xì)菌DNA的特異性引物在鏈霉菌的分子檢測(cè)中的應(yīng)用。所述的用于擴(kuò)增鏈霉菌屬細(xì)菌DNA的特異性引物在制備鏈霉菌檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。有益效果本發(fā)明的引物是根據(jù)鏈霉菌核糖體rDNA的序列堿基存在差異和Real Time-PCR的引物要求設(shè)計(jì)的。應(yīng)用本發(fā)明的引物SF/SR可從各類含有鏈霉菌的樣品DNA中直接快速擴(kuò)增出長(zhǎng)度為200bp的鏈霉菌目的片段?？梢詰?yīng)用于Real Time-PCR，可以快速定
量檢驗(yàn)土壤中鏈霉菌。


圖1為實(shí)施例1中SF/SR引物對(duì)5種屬細(xì)菌DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖。M泳道為標(biāo)準(zhǔn)BM2000，1號(hào)泳道為含有鏈霉菌(Sti^ptomyces)菌株DNA的擴(kuò)增結(jié)果，2-5號(hào)泳道分別為含有枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis，)、鞘脂單胞菌(Sphingomonadales)、紅球菌 (Rhodococcus,)、伯克氏菌(BurWiolderia，)DNA的擴(kuò)增結(jié)果，6號(hào)泳道為不含DNA空白對(duì)照的擴(kuò)增結(jié)果。圖2為實(shí)施例2中SF/SR弓丨物對(duì)土壤樣品DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖。M泳道為標(biāo)準(zhǔn)DL2000，1-4號(hào)泳道分別為河北廊坊市土壤樣品DNA的擴(kuò)增結(jié)果，5-8號(hào)泳道分別為湖北武漢市土壤樣品DNA的擴(kuò)增結(jié)果。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1分別以的鏈霉菌(Sti^ptomyces ATCC 13273)、枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis, ATCC 6633)、鞘脂單胞菌(Sphingomonadales，ATCC 27551)、紅球菌 (Rhodococcus, ATCC6939)、伯克氏菌(Burkholderia，ATCC 17616) 5 個(gè)屬細(xì)菌 DNA 為模板進(jìn)行引物VF/VR的特異性驗(yàn)證試驗(yàn)。菌種購(gòu)自ATCC(American Type Culture Collection).PCR擴(kuò)增體系為25 μ L由0. 5 μ L DNA模板(約IOng)、0. 5 μ L正向引物 SF(10yM)、0.5yL 反向引物 SR(10 μ Μ)、0· 5 μ L dNTPs (10mmol/L)、2· 5 μ L IOXPCR buffer (with MgC12) ,0. 2μ 1 TaqDNA 聚合酶(5U/μ L)，滅菌雙蒸水補(bǔ)足 25 μ L。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件為預(yù)變性95°C 5min,變性94°C 30s，退火59°C 30s,延伸72°C 45s，共35個(gè)循環(huán)， 72°C 延伸 5min，4°C 保存。將本實(shí)施方式擴(kuò)增出的序列進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，從圖1中可以看出本實(shí)施方式用于擴(kuò)增鏈霉菌的特異性引物SF/SR能夠準(zhǔn)確的擴(kuò)增出鏈霉菌的靶標(biāo)序列片段，而未能從其他屬細(xì)菌DNA和空白對(duì)照中擴(kuò)增出核酸片段。將1號(hào)泳道對(duì)應(yīng)的序列片段于T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞測(cè)序，測(cè)序結(jié)果為序列長(zhǎng)度為200bp，并且經(jīng)blast分析，為鏈霉菌(Sti^ptomyces)的特異序列?？梢娫撎禺愐颯F/ SR能夠用于鏈霉菌的分子鑒定。實(shí)施例2用OMEGA公司的Soil DNA Kit提取土樣采自河北廊坊市和湖北武漢市)土壤DNA， 應(yīng)用引物SF/SR對(duì)8份提取的土壤DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增試驗(yàn)。PCR擴(kuò)增體系為25 μ L由1 μ L DNA模板(約IOng)、lyL正向引物SF(10y Μ)、lyL反向引物SR(10y Μ)、12. 5 μ L，滅菌雙蒸水補(bǔ)足25 μ L0 PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為預(yù)變性95°C 3min,變性94°C 30s，退火59°C 30s,延伸72°C 4 ，共35個(gè)循環(huán)，72°C延伸5min，4°C保存。將本實(shí)施方式擴(kuò)增出的序列進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，從圖2中可以看出本實(shí)驗(yàn)用于擴(kuò)增鏈霉菌的特異性引物SF/SR能夠準(zhǔn)確的擴(kuò)增出所有土壤樣品DNA中的鏈霉菌的靶標(biāo)序列片段。挑選1 8號(hào)泳道對(duì)應(yīng)的序列片段分別于T載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞測(cè)序，測(cè)序結(jié)果為序列長(zhǎng)度為200bp，并且經(jīng)blast分析，為鏈霉菌(Sti^ptomyces)的特異序列。
權(quán)利要求
1.一種用于擴(kuò)增鏈霉菌屬細(xì)菌DNA的特異性引物，其特征在于其正向引物SF序列如 SEQ ID No. 1所示，反向引物SR序列如SEQ ID No. 2所示。
2.權(quán)利要求1所述的用于擴(kuò)增鏈霉菌屬細(xì)菌DNA的特異性引物在鏈霉菌的分子檢測(cè)中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述的用于擴(kuò)增鏈霉菌屬細(xì)菌DNA的特異性引物在制備鏈霉菌檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種可用于Real Time-PCR擴(kuò)增鏈霉菌DNA的特異性引物。該擴(kuò)增鏈霉菌DNA的特異性引物其正向引物SF序列如SEQ IDNo.1所示，反向引物SR序列如SEQ ID No.2所示。本發(fā)明的引物是根據(jù)鏈霉菌核糖體rDNA的序列堿基存在差異和Real Time-PCR的引物要求設(shè)計(jì)的。應(yīng)用本發(fā)明的引物SF/SR可從各類含有鏈霉菌的樣品DNA中直接快速擴(kuò)增出長(zhǎng)度為200bp的鏈霉菌目的片段?？梢詰?yīng)用于Real Time-PCR，可以快速定量檢驗(yàn)土壤中鏈霉菌。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102399895SQ201110400009
公開日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2011年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月6日
發(fā)明者李順鵬, 鄭婕, 陳俊輝 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)