專利名稱：一種特異性腫瘤殺傷細(xì)胞的制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗腫瘤的細(xì)胞免疫治療，特別涉及一種特異性腫瘤殺傷細(xì)胞的制備。
背景技術(shù)：
腫瘤發(fā)病率逐年上升，傳統(tǒng)的手術(shù)、放療、化療三大模式中，化療是唯一的全身治療手段，但化療的有效率低(25-30%)、副反應(yīng)大、耐藥性、只對(duì)分裂期細(xì)胞有效、嚴(yán)重的免疫抑制、對(duì)腫瘤干細(xì)胞無(wú)效六大缺陷，嚴(yán)重限制了臨床應(yīng)用。“細(xì)胞免疫治療”作為一種全新的全身治療新技術(shù)應(yīng)用于臨床，并獲得了有效率高、副反應(yīng)小的良好效果，被越來(lái)越多的腫瘤病患所接受，因而成為腫瘤的第四大治療模式。目前國(guó)內(nèi)外多用NK、TIL、CTL、或DC-CIK等技術(shù)進(jìn)行腫瘤的細(xì)胞免疫治療，臨床療效雖遠(yuǎn)高于化療，但回輸?shù)男?yīng)細(xì)胞在體內(nèi)存留時(shí)間短，有效率低仍是目前亟待解決的瓶頸問(wèn)題?；A(chǔ)研究證實(shí)，腫瘤一旦形成，就會(huì)形成“腫瘤微環(huán)境”，產(chǎn)生大量的免疫抑制因子如IL-10、TGF-i3、IL-6等，同時(shí)調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)水平大幅升高，結(jié)果導(dǎo)致病人本身的免疫系統(tǒng)不能辨認(rèn)和清除體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞，致使腫瘤無(wú)限制生長(zhǎng)，我們稱之為腫瘤的 “免疫耐受”或“免疫逃逸”。因而只要這些免疫抑制因素存在，體外制備的效應(yīng)細(xì)胞回輸體內(nèi)后很快被抑制，體內(nèi)的存留時(shí)間只有3-5天，嚴(yán)重影響了效應(yīng)細(xì)胞對(duì)腫瘤的殺傷效應(yīng)。因而，消除以上免疫抑制因素，是打破腫瘤免疫耐受、提高免疫治療療效的關(guān)鍵。細(xì)胞免疫治療方法很多，上世紀(jì)初就出現(xiàn)了應(yīng)用LAK細(xì)胞治療腫瘤的技術(shù)，但由于有效率低，療效不確切而被放棄。以后，人們逐一探討了 NK細(xì)胞、TIL細(xì)胞、CTL細(xì)胞、 DC疫苗等臨床應(yīng)用的可行性，均因療效的不確切性而未被臨床認(rèn)可。本世紀(jì)初，人們發(fā)現(xiàn) DC-CIK細(xì)胞具有強(qiáng)大的腫瘤殺傷功能，并能在體內(nèi)產(chǎn)生免疫記憶，有利于持續(xù)的免疫殺傷， 而且副反應(yīng)小、安全性高，因而國(guó)內(nèi)外臨床已廣泛推廣應(yīng)用至今。DC-CIK技術(shù)的方法是從腫瘤病人外周血獲取單狀核細(xì)胞，體外分離出DC細(xì)胞 (貼壁)和T細(xì)胞(懸浮)。貼壁的DC細(xì)胞內(nèi)加入GM-CSF、CI成熟化，第5-7天收集備用。懸浮的T細(xì)胞加入INF-γ沖擊，然后加入CIK細(xì)胞因子，每48小時(shí)擴(kuò)增一次。第5-7天，將成熟DC和CIK細(xì)胞混合培養(yǎng)8-10天獲得DC-CIK，移至含有2. Og白蛋白的0. 9%生理鹽水中制備成DC-CIK效應(yīng)細(xì)胞制劑，直接靜脈輸注治療(參照專利200510112381 )。上述方法存在的問(wèn)題是①效應(yīng)細(xì)胞制劑腫瘤殺傷力強(qiáng)但特異性相對(duì)差；②直接回輸后，在腫瘤微環(huán)境中IL-10、TGF-i3及Treg的免疫抑制下，效應(yīng)細(xì)胞在體內(nèi)的存留時(shí)間短(3-5天)，殺傷效率低；③所產(chǎn)生的免疫記憶也被抑制而不能發(fā)揮免疫激發(fā)功能，因而，臨床療效有限。本發(fā)明在于提供一種在干擾腫瘤微環(huán)境、打破腫瘤免疫耐受基礎(chǔ)上，DC-CIK-CTL 高效特異性細(xì)胞免疫治療的新技術(shù)，解決了現(xiàn)有DC-CIK技術(shù)存在的特異性差、體內(nèi)存留時(shí)間短、殺傷效率低等瓶頸問(wèn)題。本發(fā)明的方法是外周血獲得單狀核細(xì)胞，體外分離出DC細(xì)胞和T細(xì)胞。DC細(xì)胞經(jīng)過(guò)5天的培養(yǎng)擴(kuò)增并加入病人自體腫瘤相關(guān)全抗原至第7天成熟，獲得腫瘤特異性DC疫苗備用。T細(xì)胞經(jīng)過(guò)INF-γ沖擊后，應(yīng)用CIK細(xì)胞因子擴(kuò)增至第7天，半數(shù)移瓶加入DC疫苗激活制備腫瘤特異性CTL，另外半數(shù)繼續(xù)CIK擴(kuò)增，至第10天收集CIK和CTL效應(yīng)細(xì)胞， 混合移入含有2. Og人血白蛋白的250ml 0. 9%氯化鈉中，制備成高效DC-CIK-CTL。回輸前首先對(duì)病人實(shí)施微環(huán)境干擾，方法是環(huán)磷酰胺(CTX)600-1200mg靜脈滴入，2次/日，次日靜脈回輸DC-CIK-CTL，2次/日，共三天。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)，單次應(yīng)用小劑量替加氟或環(huán)磷酰胺(CTX)，能夠有效的降低腫瘤病人外周血調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)的比率，同時(shí)能夠降低外周血中IL-10和TGF-β的量， 但并不能有效的殺傷腫瘤細(xì)胞。因而我們假設(shè)，盡管小劑量CTX的應(yīng)用不能起到治療腫瘤的作用，但降低外周血Treg、IL-10和TGF- β含量，恰恰能夠達(dá)到消除腫瘤微環(huán)境中重要的免疫抑制因素，在此基礎(chǔ)上實(shí)施細(xì)胞免疫治療，可以有效的延長(zhǎng)回輸?shù)男?yīng)細(xì)胞在體內(nèi)的存留時(shí)間，強(qiáng)化細(xì)胞免疫對(duì)腫瘤的殺傷效應(yīng)，獲的更高的臨床療效?；谝陨习l(fā)現(xiàn)，我們建立了本發(fā)明，即首先應(yīng)用小劑量替加氟和CTX對(duì)腫瘤病人進(jìn)行預(yù)處理，然后給予DC-CIK-CTL高效特異性殺傷細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞免疫治療。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室研究、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究及臨床試驗(yàn)研究，獲得大量研究數(shù)據(jù)，證實(shí)了該技術(shù)的有效性和安全性。目前臨床應(yīng)用替加氟和CTX，目的是化療，用量分別是替加氟800-1000mg，總量 20g-40g —療程，CTX 500-1000mg/m2,每周1次，此劑量是化療的常規(guī)劑量，具有較大的副反應(yīng)，而小劑量雖可降低副反應(yīng)，但達(dá)不到化療目的。本技術(shù)應(yīng)用小劑量替加氟和CTX，目的不是化療，而是降低外周血Treg、IL-10和 TGF- β的含量，達(dá)到干擾腫瘤微環(huán)境，打破腫瘤免疫耐受的療效，為隨后進(jìn)行的細(xì)胞回輸治療創(chuàng)造環(huán)境，因而目的和用途是不同的。本技術(shù)應(yīng)用了替加氟和CTX復(fù)合制劑，對(duì)腫瘤病人進(jìn)行預(yù)處理，使外周血Treg、 IL-10和TGF-β等免疫抑制因素顯著降低，在此基礎(chǔ)上，回輸?shù)男?yīng)細(xì)胞在體內(nèi)的存留時(shí)間顯著延長(zhǎng)，達(dá)到20-30天，腫瘤的殺傷效率明顯提高，使臨床總體療效提高到68%。所以， 本技術(shù)是國(guó)際國(guó)內(nèi)最新研究成果，也是最合理的臨床治療模式。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的在于解決目前DC-CIK方法腫瘤殺傷率低、臨床有效率低的瓶頸問(wèn)題，應(yīng)用本技術(shù)，可以顯著提高腫瘤的殺傷效率，提高臨床有效率和客觀療效。為保證上述技術(shù)的實(shí)施，本發(fā)明提供了一種特異性腫瘤殺傷細(xì)胞的制備方法，本發(fā)明的制備方法，包括以下步驟
步驟1，外周血采集單狀核細(xì)胞； 步驟2，DC和T細(xì)胞分離； 步驟3，DC成熟和DC疫苗制備； 步驟4，CIK制備； 步驟5，CTL制備；
步驟6，特異性DC-CIK-CTL細(xì)胞制劑的制備。其中，步驟1的外周血采集單狀核細(xì)胞的方法如下應(yīng)用COBE SPECTRA細(xì)胞成分分離機(jī)，按照說(shuō)明書設(shè)定參數(shù)設(shè)定程序，外周血循環(huán) 6000-8000ml，采集單狀核細(xì)胞120_140ml。分裝入50ml離心管，日立細(xì)胞離心機(jī)1500轉(zhuǎn) /分離心5分鐘。收集上層血漿移入50ml離心管，制備自體滅活血清(方法加入10%葡萄糖酸鈣2. 5ml吹打混勻，56°C水浴35分鐘，2500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，收集上清)，4°C冷藏備用。收集細(xì)胞，30ml生理鹽水稀釋，移入含淋巴細(xì)胞分離液(FicOll，1.077)15ml的50ml離心管，應(yīng)用水平轉(zhuǎn)頭離心機(jī)離心2000rpmX15分鐘，一次性吸管吸取中間白色細(xì)胞層(單狀核細(xì)胞)。分別取15ml單狀核細(xì)胞移入含40ml生理鹽水的50ml離心管，輕柔吹打混勻，離心1500rpmX 10分鐘，棄上清。加入生理鹽水45ml輕柔吹打混勻，離心IOOOrpmX 5分鐘洗滌，棄上清。重復(fù)洗滌3次后，加入1640培養(yǎng)基，細(xì)胞計(jì)數(shù)(細(xì)胞總數(shù)量6-10X109)。其中，步驟2的DC和T細(xì)胞分離的方法如下
175cm2培養(yǎng)瓶分別加入1640無(wú)血清培養(yǎng)基20ml，室溫下放置20分鐘行培養(yǎng)瓶活化。 將單狀核細(xì)胞平均分裝到培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞濃度控制在IX IO7個(gè)/ml，加入終濃度10-20%的自體血清，37°C，5%0)2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育30-60分鐘，移出懸浮細(xì)胞為T細(xì)胞，剩余貼壁細(xì)胞即為DC細(xì)胞。其中，步驟3的DC成熟和DC疫苗制備的方法如下
貼壁的DC細(xì)胞中加入無(wú)血清DC培養(yǎng)基20ml (含GM-CSF 50ug/500ml, IL-4 30ug/500ml，慶大霉素2. 0萬(wàn)單位/500ml)，置于37°C，5%0)2飽和濕度培養(yǎng)箱中擴(kuò)增培養(yǎng)5 天。第6天加入自體腫瘤相關(guān)全抗原50ug/ml (自體腫瘤相關(guān)抗原制備方法新鮮腫瘤組織0. 5cm3，剪除腫瘤周邊組織后慶大霉素-生理鹽水洗滌3-5遍，剪碎，300目鋼網(wǎng)研磨制備單細(xì)胞懸液，凍融法制備腫瘤細(xì)胞裂解物，過(guò)網(wǎng)后蛋白定量)，次日補(bǔ)充10-15%的自體血清， 培養(yǎng)2天后于第8天回收，獲取DC疫苗，流式細(xì)胞檢測(cè)⑶83、HLA-DR表達(dá)，部分用于CTL制備，部分液氮凍存用于疫苗接種治療(附圖1-5)。其中，步驟4的CIK制備的方法如下
取175cm2培養(yǎng)瓶，分別加入AIM-V無(wú)血清培養(yǎng)基20ml (含IFN- y 50ug/500ml ；慶大霉素2萬(wàn)單位/500ml)，將懸浮的T細(xì)胞移入，置于37°C，5%0)2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日， 補(bǔ)充半量的CIK培養(yǎng)基(該培養(yǎng)基為AIM-V無(wú)血清培養(yǎng)基500ml，含⑶3單抗25ug，慶大霉素2萬(wàn)單位)。第5天補(bǔ)充IL-2培養(yǎng)基(該培養(yǎng)基為=AIM-V無(wú)血清培養(yǎng)基500ml，含IL-2 15ug，慶大霉素2萬(wàn)單位)。以后根據(jù)培養(yǎng)液顏色適量補(bǔ)充IL-2培養(yǎng)基，每次補(bǔ)充40%以上。第8天DC疫苗回收后，將每瓶CIK細(xì)胞的一半量移至DC培養(yǎng)瓶中，作為CTL培養(yǎng)，剩余半量繼續(xù)作為CIK培養(yǎng)。其中，步驟5的CTL制備的方法如下
第8天DC疫苗回收后，將每瓶CIK細(xì)胞的一半量移至DC培養(yǎng)瓶中，加入部分DC疫苗， 使CIK和DC比例控制為5 :1，繼續(xù)培養(yǎng)3天獲取CTL (附圖6_9)。其中，步驟6的高效特異性DC-CIK-CTL細(xì)胞制劑的制備的方法如下
第10天分批取DC疫苗1-2X107復(fù)蘇、洗滌后、和數(shù)量分別為0.5X109的CIK和CTL 細(xì)胞混合，細(xì)胞總數(shù)量控制為1-2 X IO9,加入50ml離心管，用生理鹽水洗滌3_6次去除細(xì)胞碎片，移入200ml回輸用生理鹽水瓶，(該生理鹽水中含1%人血白蛋白2. 0g, IL-2 20萬(wàn)單位)，制備成高效特異性DC-CIK-CTL細(xì)胞制劑(細(xì)胞數(shù)量控制在1-2X109)，4°C環(huán)境輸送病房備用。
通過(guò)以上方法得到的特異性DC-CIK-CTL細(xì)胞，在經(jīng)過(guò)常規(guī)的制劑學(xué)處理后可以得到用于治療的細(xì)胞制劑。因此本發(fā)明還包括，含有本發(fā)明特異性DC-CIK-CTL細(xì)胞的細(xì)胞制劑。本發(fā)明的另一個(gè)內(nèi)容是，用本發(fā)明的細(xì)胞制劑治療腫瘤病人，其方法是將本發(fā)明制備的特異性DC-CIK-CTL細(xì)胞制劑回輸?shù)侥[瘤病人體內(nèi)。本發(fā)明還包括制備一種干擾微環(huán)境制劑，該制劑為注射用替加氟和CTX，注射用替加氟和CTX均為小劑量，以干擾腫瘤微環(huán)境為目的，而不以抗腫瘤為目的，兩種制劑的制備方法依據(jù)制劑學(xué)常規(guī)技術(shù)制備即可，如制備成水針或粉針，也可直接制備成輸液劑。以上制劑的劑量范圍分別為可一次性用于病人的劑量，如靜脈注射用替加氟一次用量為800mg， CTX 一次用量為300-400mg/m2，制備成的制劑可直接輸注，也可加入含有0. 9%氯化鈉或 5%-10%的葡萄糖注射液中給病人輸注，兩種制劑可單獨(dú)使用，也可混合使用，必要時(shí)可制備成復(fù)方藥物制劑。本發(fā)明還包括一種組合試劑，其特征在于，包括制備特異性DC-CIK-CTL細(xì)胞及其制劑的全部需要使用的試劑，試劑的名稱如下
DC-CIK-CTL組合試劑
1.單核巨噬細(xì)胞克隆刺激因子(GM-CSF)；
2.白細(xì)胞介素4(IL-4)；
3.慶大霉素；
4.自體腫瘤相關(guān)全抗原；
5.IFN- γ ；
6.CD3單抗；
7.白細(xì)胞介素-2(IL-2)；
8.0. 9%氯化鈉；
9.人血白蛋白；
10.注射用白細(xì)胞介素-2(IL-2)； 干擾腫瘤微環(huán)境組合制劑
1.09%氯化鈉；
2.注射用替加氟；
3.注射用環(huán)磷酰胺； 試劑的劑量如下
DC-CIK-CTL組合試劑的劑量和終濃度如下
1.GM-CSF :50ug/500ml ；
2.IL-4 :30ug/500ml ；
3.慶大霉素2.0萬(wàn)單位/500ml ；
4.自體腫瘤相關(guān)全抗原50ug/ml；
5.IFN-y :50ug/500ml ；
6.CD3 單抗:25ug/500ml ； 7.IL-2 :15ug/500ml ；
8. 0. 9% 氯化鈉200ml ；9.人血白蛋白:2.Og ；
10.注射用白細(xì)胞介素-2(IL-2):20萬(wàn)U; 干擾腫瘤微環(huán)境組合制劑的劑量如下
1.0. 9% 氯化鈉500ml ；
2.注射用替加氟800mg；
3.注射用環(huán)磷酰胺300-400mg/m2；
本發(fā)明還包括一種組合包裝，其特征在于，將權(quán)利要求6中的注射用替加氟和注射用 CTX分別裝入到各自的容器中，再一同裝入同一包裝盒中形成組合包裝。本發(fā)明的細(xì)胞制劑和干擾微環(huán)境制劑的使用方法如下
細(xì)胞培養(yǎng)的第9天，開始應(yīng)用干擾微環(huán)境制劑對(duì)病人進(jìn)行前處理，方法為替加氟 IOOOmg加入5%的葡萄糖或0. 9%的生理鹽水500ml靜脈輸注，環(huán)磷酰胺(CTX)400_600mg加入0. 9%的生理鹽水20ml靜脈推注或入壺，1次/日，連續(xù)2天。細(xì)胞培養(yǎng)第11天，細(xì)胞回輸治療，方法為采用帶濾器輸血袋，生理鹽水IOOml靜脈點(diǎn)滴(沖袋)，換細(xì)胞制劑200ml靜脈輸注，速度40-60滴/分，期間每5-10分鐘輕柔搖晃輸液瓶(袋)，保持細(xì)胞混懸狀態(tài)。細(xì)胞輸注完成后，換生理鹽水IOOml靜脈點(diǎn)滴(沖洗輸液器)。細(xì)胞回輸治療每日2次，上下午分開，共6次3天完成。細(xì)胞回輸當(dāng)日行DC疫苗局部淋巴結(jié)注射接種，以后每周接種一次共三次。細(xì)胞回輸當(dāng)日起IL-2 100萬(wàn)U肌肉注射，2次/日，連續(xù)5天。干擾微環(huán)境制劑處理前1天和處理后4天分別采取外周血(抗凝)，流式細(xì)胞學(xué)(FCM)檢測(cè)Treg (⑶4+⑶25+) 水平，ELISA法檢測(cè)IL-10和TGF-β水平(附圖10-12)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，通過(guò)干擾腫瘤微環(huán)境能夠有效降低腫瘤病人外周血中IL-10、 TGF-β等免疫抑制因子及調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)水平，打破腫瘤免疫耐受，在此基礎(chǔ)上回輸體外制備的高強(qiáng)度、特異性腫瘤殺傷細(xì)胞(DC-CIK-CTL)進(jìn)行細(xì)胞免疫治療，可以有效延長(zhǎng)效應(yīng)細(xì)胞在體內(nèi)的存留時(shí)間；同時(shí)，在打破腫瘤免疫耐受基礎(chǔ)上實(shí)施DC疫苗接種，能夠有效激發(fā)體內(nèi)特異性腫瘤免疫，從而實(shí)現(xiàn)體內(nèi)、體外雙途徑腫瘤殺傷效應(yīng)，提高細(xì)胞免疫治療的臨床療效(附圖13-15)。本技術(shù)的意義在于，提出了一種全新的細(xì)胞免疫治療理念，即“打破腫瘤免疫耐受基礎(chǔ)上的細(xì)胞免疫治療”；提出了一種高效特異性腫瘤殺傷細(xì)胞(DC-CIK-CTL)的制備方法； 提出了一種在打破腫瘤“免疫耐受”基礎(chǔ)上實(shí)施高效特異性腫瘤殺傷的新技術(shù)、新方法。本技術(shù)解決了目前腫瘤免疫治療中效應(yīng)細(xì)胞在體內(nèi)存留時(shí)間短，腫瘤殺傷效率低，臨床療效低的瓶頸問(wèn)題，大幅提高了細(xì)胞免疫治療的臨床療效?，F(xiàn)有技術(shù)的主要缺陷是①、所制備的細(xì)胞制劑雖然殺傷力較強(qiáng)，但特異性較差； ②、雖然DC-CIK具有產(chǎn)生免疫記憶，誘導(dǎo)持續(xù)的腫瘤殺傷的優(yōu)點(diǎn)，但由于體內(nèi)的免疫抑制因素未被清除，抵消了持續(xù)腫瘤殺傷的功能；③、由于沒(méi)有打破腫瘤免疫耐受，回輸?shù)?DC-CIK細(xì)胞，只能在體內(nèi)存留3-5天，因而對(duì)腫瘤的殺傷效率低；④、臨床療效主要是改善患者生存質(zhì)量，延長(zhǎng)生存期，但腫瘤的客觀緩解率(腫瘤縮小或消失)不明顯。本技術(shù)的主要內(nèi)容是實(shí)驗(yàn)室制備高效率DC-CIK-CTL細(xì)胞制劑，回輸治療前，首先干擾腫瘤微環(huán)境，降低外周血Treg、L-IO及TGF-β水平，并使其低水平狀態(tài)保持4_10 天，從而打破腫瘤免疫耐受，解除免疫抑制因素(Treg、L-IO及TGF-β )對(duì)回輸效應(yīng)細(xì)胞的免疫抑制，然后進(jìn)行細(xì)胞回輸治療。優(yōu)勢(shì)在于①、效應(yīng)細(xì)胞DC-CIK-CTL，具備強(qiáng)大的殺傷功能，同時(shí)具備較高的特異性，對(duì)腫瘤的殺傷效率明顯增高，較DC-CIK有顯著的優(yōu)勢(shì)；②、 同樣產(chǎn)生免疫記憶，并能誘導(dǎo)持續(xù)的腫瘤殺傷，而且由于打破了腫瘤的免疫耐受，消除了免疫抑制因素，免疫記憶功能不被抵消；③、由于打破了腫瘤免疫耐受，回輸?shù)腄C-CIK-CTL效應(yīng)細(xì)胞在體內(nèi)的存留時(shí)間顯著延長(zhǎng)，能持續(xù)存在30天以上，因而對(duì)腫瘤的殺傷效率高；④、 臨床療效顯著提高，特別是對(duì)腫瘤的客觀有效率顯著提高。


附圖1. DC疫苗制備流程示意圖
附圖2. DC細(xì)胞不同培養(yǎng)時(shí)期的鏡下形態(tài)。培養(yǎng)的1-5天，屬于未成熟DC，形態(tài)特點(diǎn)是類圓形，細(xì)胞表面無(wú)樹突樣結(jié)構(gòu)平滑，缺少樹突樣結(jié)構(gòu)。隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞表面逐漸出現(xiàn)樹突樣結(jié)構(gòu)。加入抗原后培養(yǎng)2天，DC成熟，細(xì)胞表面呈典型的樹突樣突起，如電鏡圖所
7J\ ο附圖3. DC疫苗制備成功后，DC細(xì)胞表面的重要細(xì)胞因子表達(dá)顯著增高。⑶80、 ⑶83、⑶86、HLA-DR的表達(dá)，在未成熟DC (im-DC)十分低下，因而不具備抗原提呈功能；而在成熟DC (m-DC)的表達(dá)顯著增高，抗原提呈功能強(qiáng)大。附圖4.體外制備的DC疫苗，其標(biāo)志性細(xì)胞因子IL-12的分泌量顯著升高。附圖5.攜帶腫瘤抗原的DC疫苗，能有效的激活自體T細(xì)胞和同種異體T細(xì)胞，且在DC:T為1 :20時(shí)，激活效率最高。附圖6.攜帶腫瘤抗原的DC疫苗，在第一信號(hào)和第二信號(hào)的共同參與下，能夠有效的激活T細(xì)胞，制備成腫瘤特異性CTL。第一信號(hào)即，DC表面的MHC分子提供抗原給T細(xì)胞表面的T細(xì)胞受體(TCR)；第二信號(hào)即，DC表面的B7分子(⑶80、⑶86)激活T細(xì)胞表面的⑶觀分子。附圖7. DC細(xì)胞激活T細(xì)胞的電鏡示意圖
附圖8.體外制備的CTL，其標(biāo)志性細(xì)胞因子INF-γ的分泌量顯著增高。附圖9.體外制備的自體腫瘤特異性CTL，對(duì)腫瘤的特異性殺傷能力顯著增強(qiáng)。附圖10.應(yīng)用CTX處理后，Treg的水平顯著下調(diào)至正常人水平，從而消除Treg對(duì)免疫系統(tǒng)的免疫抑制效應(yīng)。附圖11.應(yīng)用CTX處理后，IL-10水平顯著下調(diào)至正常人水平。附圖12.應(yīng)用CTX處理后，TGF-β水平顯著下調(diào)至低于正常人的水平。附圖13.應(yīng)用CTX處理后，熒光標(biāo)記的效應(yīng)細(xì)胞在腫瘤組織內(nèi)存留時(shí)間長(zhǎng)達(dá)30天以上，因而腫瘤殺傷效率明顯提高。附圖14.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，干擾腫瘤微環(huán)境條件下，DC誘導(dǎo)的腫瘤特異性CTL，對(duì)腫瘤的特異性殺傷能力顯著增強(qiáng)。附圖15.在干擾腫瘤微環(huán)境基礎(chǔ)上，肺癌病人應(yīng)用本DC疫苗聯(lián)合DC-CIK-CTL過(guò)繼回輸治療，一個(gè)療程后，腫瘤縮小50%以上。
具體實(shí)施例方式
以下通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不作為對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1
特異性DC-CIK-CTL細(xì)胞制劑的制備，包括以下步驟 步驟1的外周血采集單狀核細(xì)胞的方法如下應(yīng)用COBE SPECTRA細(xì)胞成分分離機(jī)，按照說(shuō)明書設(shè)定參數(shù)設(shè)定程序，外周血循環(huán) 6000-8000ml，采集單狀核細(xì)胞120_140ml。分裝入50ml離心管，日立細(xì)胞離心機(jī)1500轉(zhuǎn) /分離心5分鐘。收集上層血漿移入50ml離心管，制備自體滅活血清(方法加入10%葡萄糖酸鈣2. 5ml吹打混勻，56°C水浴35分鐘，2500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，收集上清)，4°C冷藏備用。收集細(xì)胞，30ml生理鹽水稀釋，移入含淋巴細(xì)胞分離液(FicOll，1.077)15ml的50ml離心管，應(yīng)用水平轉(zhuǎn)頭離心機(jī)離心2000rpmX15分鐘，一次性吸管吸取中間白色細(xì)胞層(單狀核細(xì)胞)。分別取15ml單狀核細(xì)胞移入含40ml生理鹽水的50ml離心管，輕柔吹打混勻，離心1500rpmX 10分鐘，棄上清。加入生理鹽水45ml輕柔吹打混勻，離心IOOOrpmX 5分鐘洗滌，棄上清。重復(fù)洗滌3次后，加入1640培養(yǎng)基，細(xì)胞計(jì)數(shù)(細(xì)胞總數(shù)量6-10X109)。步驟2的DC和T細(xì)胞分離的方法如下
175cm2培養(yǎng)瓶分別加入1640無(wú)血清培養(yǎng)基20ml，室溫下放置20分鐘行培養(yǎng)瓶活化。 將單狀核細(xì)胞平均分裝到培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞濃度控制在IX IO7個(gè)/ml，加入終濃度10-20%的自體血清，37°C，5%0)2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育30-60分鐘，移出懸浮細(xì)胞為T細(xì)胞，剩余貼壁細(xì)胞即為DC細(xì)胞。步驟3的DC成熟和DC疫苗制備的方法如下
貼壁的DC細(xì)胞中加入無(wú)血清DC培養(yǎng)基20ml (含GM-CSF 50ug/500ml, IL-4 30ug/500ml，慶大霉素2. 0萬(wàn)單位/500ml)，置于37°C，5%0)2飽和濕度培養(yǎng)箱中擴(kuò)增培養(yǎng)5 天。第6天加入自體腫瘤相關(guān)全抗原50ug/ml(自體腫瘤相關(guān)全抗原制備方法新鮮腫瘤組織0. 5cm3，剪除腫瘤周邊組織后慶大霉素-生理鹽水洗滌3-5遍，剪碎，300目鋼網(wǎng)研磨制備單細(xì)胞懸液，凍融法制備腫瘤細(xì)胞裂解物，過(guò)網(wǎng)后蛋白定量)，次日補(bǔ)充10-15%的自體血清， 培養(yǎng)2天后于第8天回收，獲取DC疫苗，流式細(xì)胞檢測(cè)⑶83、HLA-DR表達(dá)，部分用于CTL制備，部分液氮凍存用于疫苗接種治療(附圖1-5)。步驟4的CIK制備的方法如下
取175cm2培養(yǎng)瓶，分別加入AIM-V無(wú)血清培養(yǎng)基20ml (含IFN- y 50ug/500ml ；慶大霉素2萬(wàn)單位/500ml)，將懸浮的T細(xì)胞移入，置于37°C，5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日，補(bǔ)充半量的CIK培養(yǎng)基(AIM-V無(wú)血清培養(yǎng)基500ml，含⑶3單抗25ug，慶大霉素2萬(wàn)單位)。 第5天補(bǔ)充IL-2培養(yǎng)基(AIM-V無(wú)血清培養(yǎng)基500ml，含IL-2 15ug，慶大霉素2萬(wàn)單位)。 以后根據(jù)培養(yǎng)液顏色適量補(bǔ)充IL-2培養(yǎng)基，每次補(bǔ)充40%以上。第8天DC疫苗回收后，將每瓶CIK細(xì)胞的一半量移至DC培養(yǎng)瓶中，作為CTL培養(yǎng)，剩余半量繼續(xù)作為CIK培養(yǎng)。步驟5的CTL制備的方法如下
第8天DC疫苗回收后，將每瓶CIK細(xì)胞的一半量移至DC培養(yǎng)瓶中，加入部分DC疫苗， 使CIK和DC比例控制為5 :1，繼續(xù)培養(yǎng)3天獲取CTL (附圖6_9)。步驟6的高效特異性DC-CIK-CTL細(xì)胞制劑的制備的方法如下
第10天分批取DC疫苗1-2X107復(fù)蘇、洗滌后、和數(shù)量分別為0.5X109的CIK和CTL 細(xì)胞混合，控制細(xì)胞總數(shù)量控制為1-2 X 109，加入50ml離心管，用生理鹽水洗滌3_6次去除細(xì)胞碎片，移入200ml回輸用生理鹽水瓶，(含1%人血白蛋白2. 0g, IL-2 20萬(wàn)單位)，制備成高效特異性DC-CIK-CTL細(xì)胞制劑(細(xì)胞數(shù)量控制在1-2 X 109，4°C環(huán)境輸送病房備用。實(shí)施例2
干擾微環(huán)境制劑的制備方法和用法成人按照靜脈注射用替加氟lOOOmg，CTX 300-400mg/m2,計(jì)算病人用藥劑量。一般采取替加氟800mg加入0. 9%的生理鹽水500ml，用20ml注射器抽取CTX 400-600mg,然后抽取0. 9%的生理鹽水20ml稀釋，制備成干擾腫瘤微環(huán)境制劑。治療時(shí)，首先靜脈輸注替加氟， 掌握速度為30-40滴/分，然后將CTX入壺或靜脈推注。治療前1天和治療后4天，分別采取外周血anl，抗凝，F(xiàn)CM檢測(cè)1Treg含量，ELISA檢測(cè)IL-10和TGF-β含量。
實(shí)施例3
本發(fā)明還包括一種組合試劑，其特征在于，包括制備特異性DC-CIK-CTL細(xì)胞及其制劑的全部需要使用的試劑，試劑的名稱如下 DC-CIK-CTL組合試劑
.11.單核巨噬細(xì)胞克隆刺激因子(GM-CSF)；
.12.白細(xì)胞介素4(IL-4)；
.13.慶大霉素；
.14.自體腫瘤相關(guān)全抗原；
.15.IFN-Y ；
.16.CD3 單抗；
.17.白細(xì)胞介素-2(IL-2)；
.18.0. 9%氯化鈉；
.19.人血白蛋白；
.20.注射用白細(xì)胞介素-2(IL-2)； 試劑的劑量如下
DC-CIK-CTL組合試劑的劑量和終濃度如下
.11.GM-CSF :50ug/500ml ；
.12.IL-4 :30ug/500ml ；
.13.慶大霉素2.0萬(wàn)單位/500ml ；
.14.自體腫瘤相關(guān)全抗原50ug/ml；
.15.IFN-y :50ug/500ml ；
.16.CD3 單抗:25ug/500ml ； 17.IL-2 :15ug/500ml ；
.18.0. 9% 氯化鈉200ml ；
.19.人血白蛋白2.Og ；
.20.注射用白細(xì)胞介素-2(IL-2):20萬(wàn)U; 干擾腫瘤微環(huán)境組合制劑
.4.09%氯化鈉；
.5.注射用替加氟；
.6.注射用環(huán)磷酰胺；
干擾腫瘤微環(huán)境組合制劑的劑量如下
.4.0. 9% 氯化鈉500ml ；
.5.注射用替加氟800mg；
.6.注射用環(huán)磷酰胺300-400mg/m2。
權(quán)利要求
1.一種特異性腫瘤殺傷細(xì)胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 步驟1，外周血采集單狀核細(xì)胞；步驟2，DC和T細(xì)胞分離； 步驟3，DC成熟和DC疫苗制備； 步驟4，CIK制備； 步驟5，CTL制備；步驟6，特異性DC-CIK-CTL細(xì)胞制劑的制備。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于，其中，步驟1的外周血采集單狀核細(xì)胞的方法如下應(yīng)用COBE SPECTRA細(xì)胞成分分離機(jī)，循環(huán)外周血6000-8000ml，采集單狀核細(xì)胞 120-140ml，分裝入50ml離心管，離心機(jī)1500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，收集上層血漿移入50ml 離心管，加入10%葡萄糖酸鈣2. 5ml吹打混勻，56°C水浴35分鐘，2500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘， 收集上清，得到自體血清，4°C冷藏備用；收集細(xì)胞，30ml生理鹽水稀釋，移入含淋巴細(xì)胞分離液15ml的50ml離心管，應(yīng)用水平轉(zhuǎn)頭離心機(jī)離心2000rpmX 15分鐘，一次性吸管吸取中間白色細(xì)胞層，分別取15ml單狀核細(xì)胞移入含40ml生理鹽水的50ml離心管，輕柔吹打混勻，離心1500rpmX10分鐘，棄上清，加入生理鹽水45ml輕柔吹打混勻，離心IOOOrpmX 5分鐘洗滌，棄上清，重復(fù)洗滌3次后，加入1640培養(yǎng)基，細(xì)胞計(jì)數(shù)； 其中，步驟2的DC和T細(xì)胞分離的方法如下175cm2培養(yǎng)瓶分別加入1640無(wú)血清培養(yǎng)基20ml，室溫下放置20分鐘行培養(yǎng)瓶活化， 將單狀核細(xì)胞平均分裝到培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞濃度控制在IX IO7個(gè)/ml，加入終濃度10-20%的自體血清，37°C，5%0)2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育30-60分鐘，移出懸浮細(xì)胞為T細(xì)胞，剩余貼壁細(xì)胞即為DC細(xì)胞；其中，步驟3的DC成熟和DC疫苗制備的方法如下貼壁的DC細(xì)胞中加入含GM-CSF 50ug/500ml, IL-4 30ug/500ml，慶大霉素2. 0萬(wàn)單位/500ml的無(wú)血清DC培養(yǎng)基20ml，置于37°C，5%C02飽和濕度培養(yǎng)箱中擴(kuò)增培養(yǎng)5天，第 6天加入自體腫瘤相關(guān)抗原50ug/ml，其中，自體腫瘤相關(guān)全抗原制備方法新鮮腫瘤組織 0. 5cm3，剪除腫瘤周邊組織后慶大霉素-生理鹽水洗滌3-5遍，剪碎，300目鋼網(wǎng)研磨制備單細(xì)胞懸液，凍融法制備腫瘤細(xì)胞裂解物，過(guò)網(wǎng)后蛋白定量；次日補(bǔ)充10-15%的自體血清，培養(yǎng)2天后于第8天回收，獲取DC疫苗，流式細(xì)胞檢測(cè)⑶83、HLA-DR表達(dá)，部分用于CTL制備，部分液氮凍存用于疫苗接種治療； 其中，步驟4的CIK制備的方法如下取175cm2培養(yǎng)瓶若干，分別加入含IFN-Y 1000U/ml，慶大霉素2萬(wàn)單位/500ml的 AIM-V無(wú)血清培養(yǎng)基20ml，將懸浮的T細(xì)胞移入，置于37°C，5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日， 補(bǔ)充半量的CIK培養(yǎng)基(AIM-V無(wú)血清培養(yǎng)基500ml，含⑶3單抗25ug，慶大霉素2萬(wàn)單位)， 第5天補(bǔ)充IL-2培養(yǎng)基(AIM-V無(wú)血清培養(yǎng)基500ml，含IL_2 15ug，慶大霉素2萬(wàn)單位)，以后根據(jù)培養(yǎng)液顏色，每次補(bǔ)充40 %以上的IL-2培養(yǎng)基，第8天DC疫苗回收后，將每瓶CIK 細(xì)胞的一半量移至DC培養(yǎng)瓶中，作為CTL培養(yǎng)，剩余半量繼續(xù)作為CIK培養(yǎng)； 其中，步驟5的CTL制備的方法如下第8天DC疫苗回收后，將每瓶CIK細(xì)胞的一半量移至DC培養(yǎng)瓶中，加入部分DC疫苗，使CIK和DC比例控制為5 :1，繼續(xù)培養(yǎng)3天獲取CTL ；其中，步驟6的高效特異性DC-CIK-CTL細(xì)胞制劑的制備方法如下 第10天分批取DC疫苗1-2X107復(fù)蘇、洗滌后、和數(shù)量分別為0.5X109的CIK和CTL 細(xì)胞混合，細(xì)胞總數(shù)量控制為1-2 X IO9,加入50ml離心管，用生理鹽水洗滌3_6次去除細(xì)胞碎片，移入200ml回輸用含1%人血白蛋白2.0g，IL-2 20萬(wàn)單位的生理鹽水瓶，制備成高效特異性DC-CIK-CTL細(xì)胞制劑，4°C環(huán)境保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的制備方法，其特征在于，包括以下步驟步驟1，外周血采集單狀核細(xì)胞；步驟2，DC和T細(xì)胞分離；步驟3，DC成熟和DC疫苗制備；步驟4，CIK制備；步驟5，CTL制備；步驟6，特異性DC-CIK-CTL細(xì)胞制劑的制備； 其中，步驟1的外周血采集單狀核細(xì)胞的方法如下應(yīng)用COBE SPECTRA細(xì)胞成分分離機(jī)，循環(huán)外周血6000-8000ml，采集單狀核細(xì)胞 120-140ml，分裝入50ml離心管，離心機(jī)1500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，收集上層血漿移入50ml 離心管，加入10%葡萄糖酸鈣2. 5ml吹打混勻，56°C水浴35分鐘，2500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘， 收集上清，得到自體血清，4°C冷藏備用；收集細(xì)胞，30ml生理鹽水稀釋，移入含淋巴細(xì)胞分離液15ml的50ml離心管，應(yīng)用水平轉(zhuǎn)頭離心機(jī)離心2000rpmX 15分鐘，一次性吸管吸取中間白色細(xì)胞層，分別取15ml單狀核細(xì)胞移入含40ml生理鹽水的50ml離心管，輕柔吹打混勻，離心1500rpmX10分鐘，棄上清，加入生理鹽水45ml輕柔吹打混勻，離心IOOOrpmX 5分鐘洗滌，棄上清，重復(fù)洗滌3次后，加入1640培養(yǎng)基，細(xì)胞計(jì)數(shù)； 其中，步驟2的DC和T細(xì)胞分離的方法如下175cm2培養(yǎng)瓶分別加入1640無(wú)血清培養(yǎng)基20ml，室溫下放置20分鐘行培養(yǎng)瓶活化， 將單狀核細(xì)胞平均分裝到培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞濃度控制在IX IO7個(gè)/ml，加入終濃度10-20%的自體血清，37°C，5%0)2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育30-60分鐘，移出懸浮細(xì)胞為T細(xì)胞，剩余貼壁細(xì)胞即為DC細(xì)胞；其中，步驟3的DC成熟和DC疫苗制備的方法如下貼壁的DC細(xì)胞中加入含GM-CSF 50ug/500ml, IL-4 30ug/500ml，慶大霉素2. 0萬(wàn)單位/500ml的無(wú)血清DC培養(yǎng)基20ml，置于37°C，5%C02飽和濕度培養(yǎng)箱中擴(kuò)增培養(yǎng)5天，第 6天加入自體腫瘤相關(guān)全抗原50ug/ml，其中，自體腫瘤相關(guān)抗原制備方法新鮮腫瘤組織 0. 5cm3，剪除腫瘤周邊組織后慶大霉素-生理鹽水洗滌3-5遍，剪碎，300目鋼網(wǎng)研磨制備單細(xì)胞懸液，凍融法制備腫瘤細(xì)胞裂解物，過(guò)網(wǎng)后蛋白定量；次日補(bǔ)充10-15%的自體血清，培養(yǎng)2天后于第8天回收，獲取DC疫苗，流式細(xì)胞檢測(cè)⑶83、HLA-DR表達(dá)，部分用于CTL制備，部分液氮凍存用于疫苗接種治療； 其中，步驟4的CIK制備的方法如下取175cm2培養(yǎng)瓶，分別加入含IFN- y 50ug/500ml，慶大霉素2萬(wàn)單位/500ml的AIM-V 無(wú)血清培養(yǎng)基20ml，將懸浮的T細(xì)胞移入，置于37°C，5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日，補(bǔ)充半量的CIK培養(yǎng)基(500ml AIM-V無(wú)血清培養(yǎng)基中含⑶3單抗25ug，慶大霉素2萬(wàn)單位)，第.5天補(bǔ)充IL-2培養(yǎng)基(AIM-V無(wú)血清培養(yǎng)基500ml，含IL_2 15ug，慶大霉素2萬(wàn)單位)，以后根據(jù)培養(yǎng)液顏色，每次補(bǔ)充40%以上的IL-2培養(yǎng)基，第8天DC疫苗回收后，將每瓶CIK細(xì)胞的一半量移至DC培養(yǎng)瓶中，作為CTL培養(yǎng)，剩余半量繼續(xù)作為CIK培養(yǎng)；其中，步驟5的CTL制備的方法如下第8天DC疫苗回收后，將每瓶CIK細(xì)胞的一半量移至DC培養(yǎng)瓶中，加入部分DC疫苗， 使CIK和DC比例控制為5 :1，繼續(xù)培養(yǎng)3天獲取CTL ；其中，步驟6的高效特異性DC-CIK-CTL細(xì)胞制劑的制備的方法如下第10天分批取DC疫苗1-2X107復(fù)蘇、洗滌后、和數(shù)量分別為0.5X109的CIK和CTL 細(xì)胞混合，控制細(xì)胞總數(shù)量控制為1-2 X 109，加入50ml離心管，用生理鹽水洗滌3_6次去除細(xì)胞碎片，移入200ml回輸用含1%人血白蛋白2.0g，IL-2 20萬(wàn)單位的生理鹽水瓶，制備成高效特異性DC-CIK-CTL細(xì)胞制劑，4°C環(huán)境保存。
4.含有權(quán)利要求1的方法制備的特異性DC-CIK-CTL細(xì)胞。
5.含有權(quán)利要求1的方法制備的特異性DC-CIK-CTL細(xì)胞的細(xì)胞制劑。
6.一種干擾微環(huán)境制劑，該制劑為注射用替加氟和注射用CTX，其特征在于，注射用替加氟和注射用CTX均為小劑量，以干擾腫瘤微環(huán)境為目的，而不以抗腫瘤為目的；制劑的劑量范圍分別為一次性用于病人的劑量，注射用替加氟一次用量為800mg，注射用CTX—次用量為 300-400mg/m2。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的制劑，其特征在于，制備成的制劑可直接輸注，也可加入含有0.9% 氯化鈉或5%-10%的葡萄糖注射液中靜脈輸注。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的制劑，其特征在于，注射用替加氟和注射用CTX是水針、粉針或輸液劑。
9.一種組合試劑，其特征在于，包括制備特異性DC-CIK-CTL細(xì)胞及其制劑的全部需要使用的試劑。
10.一種組合包裝，其特征在于，將權(quán)利要求6中的注射用替加氟和注射用CTX分別裝入到各自的容器中，再一同裝入同一包裝盒中形成組合包裝。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗腫瘤的細(xì)胞免疫治療技術(shù)，特別涉及一種特異性腫瘤殺傷細(xì)胞的制備，本發(fā)明的制備方法，包括以下步驟步驟1，外周血采集單狀核細(xì)胞；步驟2，DC和T細(xì)胞分離；步驟3，DC成熟和DC疫苗制備；步驟4，CIK制備；步驟5，CTL制備；步驟6，特異性DC-CIK-CTL細(xì)胞制劑的制備。
文檔編號(hào)C12N5/078GK102526716SQ20111040258
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2011年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月7日
發(fā)明者杰弗里·梅德因, 蔡建輝, 馬云龍 申請(qǐng)人:蔡穎