專利名稱：一種質(zhì)粒dna或反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染附植前胚胎的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于胚胎轉(zhuǎn)染領(lǐng)域，涉及一種質(zhì)粒DNA或反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染附植前胚胎的方法。
背景技術(shù)：
哺乳動物早期胚胎發(fā)育由其自身的遺傳機(jī)制所控制，研究該遺傳機(jī)制所采用的基本方法是調(diào)控關(guān)鍵基因的表達(dá)，觀察后續(xù)的發(fā)育情況并分析該關(guān)鍵基因在發(fā)育過程中所發(fā)揮的作用。目前，將外源基因?qū)肱咛ミM(jìn)行過表達(dá)或抑制基因的表達(dá)是研究基因功能一貫且經(jīng)典的方法。把外源基因轉(zhuǎn)入到細(xì)胞/胚胎或整合到基因組主要通過轉(zhuǎn)染、病毒載體的感染和顯微注射，而抑制基因的表達(dá)主要依靠基因敲低和基因敲除技術(shù)。然而，就附植前胚胎而言，通過轉(zhuǎn)染或病毒載體的感染而把外源基因?qū)胧掷щy，因?yàn)楦街睬芭咛ネ饷嬗梢粚油该鲙О??；蚯贸夹g(shù)雖好但不能廣泛的應(yīng)用，因?yàn)榇思夹g(shù)費(fèi)時費(fèi)力且花費(fèi)巨大。目前外源基因和下調(diào)基因表達(dá)的序列包括dsRNA、siRNA以及反義寡核苷酸主要通過顯微注射導(dǎo)入附植前胚胎。此種方法效率很低，因?yàn)閷⑼庠椿蚝蚫sRNA、siRNA以及反義寡核苷酸導(dǎo)入2-細(xì)胞期以后的附植前胚胎需要逐個卵裂球的注射，費(fèi)時費(fèi)力且每次只能操作一個胚胎。抑制基因表達(dá)的方法根據(jù)原理不同大致可分為兩類第一，利用siRNA或dsRNA降解靶mRNA，使關(guān)鍵基因失去翻譯的模板；第二，利用反義寡核苷酸與靶mRNA進(jìn)行結(jié)合，要么抑制靶mRNA的翻譯，要么改變靶mRNA的剪切，進(jìn)而表現(xiàn)出某關(guān)鍵基因失活的表型。以前， 抑制基因的表達(dá)時，運(yùn)用最多的是siRNA和dsRNA，但最近幾年，反義寡核苷酸的運(yùn)用有上升的趨勢，因?yàn)榉戳x寡核苷酸不降解靶mRNA且不易被RNase H降解，在細(xì)胞或胚胎內(nèi)能維持較長時間。目前，發(fā)育生物學(xué)家多采用顯微注射的方法將反義寡核苷酸注入卵子或者斑馬魚、青蛙、海鞘、海膽等的受精卵中進(jìn)而研究胚胎發(fā)育。此方法能準(zhǔn)確控制反義寡核苷酸的導(dǎo)入時間，但該方法對操作人員的技術(shù)要求很高，且每次只能注射一個胚胎，效率很低因此，亟待尋求一種將外源基因或特異序列快速高效導(dǎo)入小鼠附植前胚胎的方法，為進(jìn)一步深入研究小鼠早期胚胎發(fā)育機(jī)理提供技術(shù)支持。電穿孔技術(shù)主要是利用瞬時的脈沖電場改變細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞膜形成暫時性的孔洞，大分子在電場的作用下進(jìn)入細(xì)胞或胚胎。在成功的電轉(zhuǎn)中，電通透作用和電泳作用起著非常關(guān)鍵的作用，此外，大分子的被動擴(kuò)散和細(xì)胞內(nèi)吞也起了一定的作用。而利用電穿孔技術(shù)將質(zhì)粒DNA或反義寡核苷酸導(dǎo)入附植前胚胎的報道至今未見。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于提供一種質(zhì)粒DNA或反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染附植前胚胎的方法，實(shí)現(xiàn)對胚胎進(jìn)行安全、簡便、高效的轉(zhuǎn)染。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)
一種質(zhì)粒DNA或反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染附植前胚胎的方法，包括以下步驟 1)將待轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA用電轉(zhuǎn)緩沖液稀釋至濃度為10 80 μ g/ml，得到質(zhì)粒DNA
電穿孔溶液；或者將待轉(zhuǎn)染的反義寡核苷酸用電轉(zhuǎn)緩沖液稀釋至濃度為0. 2mM，得到反義寡核苷酸電穿孔溶液；2)將待轉(zhuǎn)染的附植前胚胎置于酸性臺氏液中，室溫孵育10 20s，然后終止消化并清洗；3)將質(zhì)粒DNA電穿孔溶液或反義寡核苷酸電穿孔溶液加入電轉(zhuǎn)皿兩根電極之間的凹槽中，將附植前胚胎線性排列在電轉(zhuǎn)皿的兩根電極之間，在脈沖電場下，利用電穿孔法對附植前胚胎進(jìn)行轉(zhuǎn)染。所述的質(zhì)粒DNA在轉(zhuǎn)染前還進(jìn)行去內(nèi)毒素處理，將去內(nèi)毒素處理的質(zhì)粒DNA用電轉(zhuǎn)緩沖液Opti-MEM I進(jìn)行稀釋。所述的將附植前胚胎在進(jìn)行酸性臺氏液處理之前，還對胚胎用H-KSOM溶液清洗。所述的終止消化是將胚胎從酸性臺氏液轉(zhuǎn)移到H-KSOM溶液中清洗，然后再用 Opti-MEM I溶液清洗。所述的轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA為帶有熒光基因的質(zhì)粒DNA ；所述的反義寡核苷酸在轉(zhuǎn)染前還進(jìn)行l(wèi)issamine標(biāo)記，將lissamine標(biāo)記的反義寡核苷酸用電轉(zhuǎn)緩沖液Opti-MEM I進(jìn)行稀釋。所述的轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA包括一種或多種以上序列不同的質(zhì)粒DNA。所述的附植前胚胎包括處于不同發(fā)育時期的附植前胚胎。所述的電穿孔法進(jìn)行質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染的參數(shù)控制為電壓20V 40V ；脈沖時間1 2ms ；脈沖次數(shù)3 4次。所述的附植前胚胎為小鼠附植前胚胎，電轉(zhuǎn)參數(shù)控制為電壓20V 40V ；脈沖時間1 2ms ；脈沖次數(shù)3 4次。所述的電穿孔完成后，將轉(zhuǎn)染后的胚胎清洗并轉(zhuǎn)移入KSOMaa培養(yǎng)液中培養(yǎng)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果本發(fā)明提供的質(zhì)粒DNA或反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染附植前胚胎的方法，首先對胚胎透明帶結(jié)構(gòu)使用臺氏液進(jìn)行弱化處理，然后再將處理后的胚胎置于脈沖電場作用下，細(xì)胞膜脂雙層上形成瞬時微孔，導(dǎo)致其通透性和膜電導(dǎo)瞬時增大，可以使在正常生理情況下細(xì)胞膜難以通透的質(zhì)粒DNA或反義寡核苷酸進(jìn)入細(xì)胞。由于采用了電穿孔轉(zhuǎn)染的方法，本發(fā)明還能同時將兩種或多種質(zhì)粒DNA —起轉(zhuǎn)入附植前胚胎，如果構(gòu)建的質(zhì)粒DNA所攜帶的外源片段是某個關(guān)鍵基因或靶向某個關(guān)鍵基因的干擾片段，則可具體研究某個關(guān)鍵基因在小鼠附植前胚胎的發(fā)育過程中所起的具體作用。由于采用了電穿孔轉(zhuǎn)染的方法，本發(fā)明能將所設(shè)計的、與不同靶基因的mRNA結(jié)合的反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染到胚胎內(nèi)，可用于研究目的基因在小鼠附植前胚胎的發(fā)育過程中所起的具體作用。為了進(jìn)一步觀察或跟蹤轉(zhuǎn)染效果，待轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA帶有熒光基因，而待轉(zhuǎn)染的反義寡核苷酸進(jìn)行Iissamine(麗絲胺，可以發(fā)紅色熒光)標(biāo)記，這樣在電穿孔轉(zhuǎn)染后通過熒光顯微鏡可以直觀的觀察。本發(fā)明將質(zhì)粒DNA或反義寡核苷酸轉(zhuǎn)入附植前胚胎省時、省力、花費(fèi)少、操作簡單、對操作者以及操作的胚胎沒有毒性、效率高、速度快。一次可操作50 100枚胚胎，電轉(zhuǎn)時間在Imin以內(nèi)。電轉(zhuǎn)后體外培養(yǎng)Mh，通過熒光顯微鏡對胚胎進(jìn)行觀察并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析表明，本發(fā)明的電轉(zhuǎn)效率約為97%。為采用質(zhì)粒DNA或反義寡核苷酸所針對的基因或基因轉(zhuǎn)錄物研究其在胚胎中的功能提供了有效的轉(zhuǎn)染方法。


圖1為質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入不同發(fā)育時期附植前胚胎的顯微照片；圖2為反義寡核苷酸轉(zhuǎn)入不同發(fā)育時期附植前胚胎的顯微照片。
具體實(shí)施例方式附植前胚胎的發(fā)育主要經(jīng)歷三次轉(zhuǎn)變(分別為合子基因組激活、致密化和囊胚形成)和兩次譜系分化(滋養(yǎng)外胚層和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的分化、內(nèi)細(xì)胞團(tuán)分化為原始內(nèi)胚層和外胚層)。每次轉(zhuǎn)變或譜系分化都伴隨著胚胎基因表達(dá)的巨大變化，因此，研究胚胎在轉(zhuǎn)變或譜系分化過程中表達(dá)變化比較大的基因能進(jìn)一步的揭示早期胚胎發(fā)育所蘊(yùn)藏的分子調(diào)控機(jī)制。然而，目前常用的技術(shù)在研究基因功能方面都存在一定的缺陷。本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)染附植前胚胎的方法，采用電穿孔的方法轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA，利用了電穿孔低毒性、效率高、速度快的優(yōu)勢。下面結(jié)合具體的電穿孔過程和轉(zhuǎn)染結(jié)果對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。所述的轉(zhuǎn)染附植前胚胎的方法，通過胚胎透明帶和細(xì)胞膜在脈沖電場下形成的瞬時微孔進(jìn)入胚胎，是一種生物物理的轉(zhuǎn)染方法，所以待轉(zhuǎn)染的胚胎并無特殊的種屬要求。由于形態(tài)結(jié)構(gòu)差異較大的胚胎進(jìn)行電穿孔時的透明帶弱化時間和電穿孔參數(shù)可能會有一些差別，然而本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過所提供的方法進(jìn)行很少次數(shù)的實(shí)驗(yàn)從而對于這些具體的參數(shù)進(jìn)行篩選和優(yōu)化，即可確定相應(yīng)胚胎的最優(yōu)參數(shù)，完成胚胎轉(zhuǎn)染。質(zhì)粒DNA和反義核苷酸分別是研究基因功能的兩種不同的分子工具。利用質(zhì)粒 DNA轉(zhuǎn)染可以對關(guān)鍵基因進(jìn)行過表達(dá)和抑制表達(dá)的研究，還可以同時轉(zhuǎn)染幾種不同的質(zhì)粒， 而反義核苷酸只能抑制基因的表達(dá)。相對反義核苷酸而言，質(zhì)粒DNA的分子較大。下面具體以哺乳類動物特別是小鼠附植前胚胎作為實(shí)施對象，詳細(xì)說明質(zhì)粒DNA 轉(zhuǎn)染附植前胚胎的方法，此類胚胎形態(tài)差異小，透明帶結(jié)構(gòu)成分相似，因此轉(zhuǎn)染條件和電穿孔參數(shù)設(shè)置變化不大。實(shí)施例1質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染附植前胚胎的方法，包括以下步驟1、首先對對質(zhì)粒DNA進(jìn)行預(yù)處理a、具體采用的質(zhì)粒DNA為pIRES2-AcGFPl_Nuc (Clontech)例進(jìn)行說明，質(zhì)粒DNA 根據(jù)需要可以采用不同的質(zhì)粒載體攜帶不同的目的基因，待轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒載體一般要求帶有熒光標(biāo)記基因或其它標(biāo)記基因，以便于后續(xù)的觀察及篩選；將質(zhì)粒DNA進(jìn)行去內(nèi)毒素處理，去內(nèi)毒素處理是為了消除質(zhì)粒中的內(nèi)毒素對胚胎的生長發(fā)育造成影響；b、將去內(nèi)毒素的質(zhì)粒DNA稀釋在Opti-MEM I溶液中，質(zhì)粒DNA不同，電轉(zhuǎn)時稀釋的濃度也不同，pIRES2-AcGFPl-Nuc質(zhì)粒DNA稀釋后的濃度控制為40μ g/ml ；雖然每種質(zhì)粒DNA的表達(dá)情況都不盡相同，通過多次實(shí)驗(yàn)之后可適當(dāng)調(diào)整。2、小鼠胚胎進(jìn)行透明帶弱化的預(yù)處理a、將收集得到的不同時期的小鼠附植前胚胎在H-KSOM操作液中洗3次，以除去組織碎片和顆粒細(xì)胞；100ml H-KS0M 工作液配方為=NaCl, 0. 5552g ；KC1，0. 0186g ；KH2PO4,0. 0047 ；D-葡萄糖，0. 0036 ；NaHCO3,0. 0336g ；丙酮酸鈉，0. 0022g ；L-谷氨酰胺，0. 0146g ；EDTA-Na2, 0. 0014g ；CaCl ‘ 2H20,0. 0250g ；MgSO4,0. 0024g ；HEPES,0. 2384g ；必需氨基酸(EAA， invitrogen,50X) ,2ml ；非必需氨基酸(NEAA, invitrogen, 100 X , Iml ；60 % 乳酸鈉， 350 μ 1;牛血清白蛋白(BSA), 0. 6g ；b、將收集好的胚胎置入酸性臺氏液(sigma，美國，T1788)中15s，進(jìn)行透明帶弱化處理；不同胚胎的具體的弱化時間可通過多次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行篩選而獲得；C、將弱化處理過的小鼠胚胎在H-KSOM操作液中洗3次，以除去酸性臺氏液；d、將胚胎在Opti-MEM I溶液中洗3次，之后置入稀釋有質(zhì)粒DNA的 Opti-MEM I溶液中；完成對胚胎的預(yù)處理之后，對胚胎進(jìn)行電穿孔，具體操作包括以下步驟1)使用電穿孔儀(ECM 2001Electro Cell Manipulator，BTX，美國)進(jìn)行電穿孔， 質(zhì)粒DNA溶液加入電轉(zhuǎn)皿取30 μ 1質(zhì)粒DNA溶液加入電轉(zhuǎn)皿兩根電極之間的凹槽；2)小鼠附植前胚胎置入電轉(zhuǎn)皿兩根電極之間將小鼠不同時期的附植前胚胎線性排列在電轉(zhuǎn)皿的兩根電極之間；3)質(zhì)粒DNA的電轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)參數(shù)是電壓30V，脈沖長度1ms，脈沖次數(shù)2次，重復(fù)次數(shù)1次；4)電轉(zhuǎn)后胚胎的培養(yǎng)將胚胎吸出并在操作液H-KSOM中洗3次，之后培養(yǎng)在 KSOMaa培養(yǎng)液中；100ml KSOMaa 培養(yǎng)液配方如下NaCl，0. 5552g ；KCl，0. 0186g ；KH2PO4,0. 0047g ； D-葡萄糖，0. 0036g ；NaHCO3,0. 2Ig ；丙酮酸鈉，0. 0022g ；L-谷氨酰胺，0. 0146g ；EDTA-Na2, 0. 0014g ；CaCl · 2H20,0. 0250g ；MgSO4,0. 0024g ；必需氨基酸(EAA, Invitrogen, 50 X)，2ml ； 非必需氨基酸(NEAA，Invitrogen, 100 X, Iml ；60%乳酸鈉，350 μ 1 ；牛血清白蛋白(BSA)， 0. 6 0. 8g。5)在熒光顯微鏡下觀察胚胎發(fā)綠色熒光的情況電轉(zhuǎn)24h后，將不同時期的胚胎置于熒光顯微鏡下觀察照相并計算電轉(zhuǎn)效率。熒光顯微鏡觀察結(jié)果如圖1所示，其中圖A、圖B、C、圖D、圖E和圖F分別在1_細(xì)胞胚胎、2-細(xì)胞胚胎、4-細(xì)胞胚胎、8-細(xì)胞胚胎和桑椹胚時進(jìn)行的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染結(jié)果，對熒光亮度的定性的觀察結(jié)果顯示，在不同時期的胚胎轉(zhuǎn)染都達(dá)到了良好的轉(zhuǎn)染效果。實(shí)施例2反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染附植前胚胎的方法，包括以下步驟
1、首先對反義寡核苷酸進(jìn)行預(yù)處理a、具體采用標(biāo)準(zhǔn)對照反義寡核苷酸為例進(jìn)行說明，反義寡核苷酸根據(jù)需要可以針對不同的目的基因來設(shè)計，待轉(zhuǎn)染的反義寡核苷酸一般帶有熒光基團(tuán)標(biāo)記，以便于后續(xù)的觀察及篩選；具體采用lissamine標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)對照反義寡核苷酸(商品化的)，不會影響任何基因的功能，在正常的實(shí)驗(yàn)中僅僅是一個對照組。由于反義寡核苷酸的序列非常短，僅僅25bp 左右，由人工合成。只要標(biāo)準(zhǔn)對照反義寡核苷酸能夠轉(zhuǎn)染成功，其它針對任何基因的反義寡核苷酸都能轉(zhuǎn)進(jìn)去。b、將lissamine標(biāo)記的反義寡核苷酸稀釋在Opti-MEM I溶液中，反義寡核苷酸不同，電轉(zhuǎn)時稀釋的濃度也不同，標(biāo)準(zhǔn)對照反義寡核苷酸稀釋后的濃度控制為0. 2mM ；雖然每種反義寡核苷酸所針對的靶基因轉(zhuǎn)錄物都不盡相同，通過多次實(shí)驗(yàn)之后可適當(dāng)調(diào)整其轉(zhuǎn)染濃度。2、小鼠胚胎進(jìn)行透明帶弱化的預(yù)處理a、將收集得到的不同時期的小鼠附植前胚胎在H-KSOM操作液中洗3次，以除去組織碎片和顆粒細(xì)胞；100ml H-KS0M工作液配方同實(shí)施例1 ；b、將收集好的胚胎置入酸性臺氏液(sigma，美國)中15s，進(jìn)行透明帶弱化處理； 不同胚胎的具體的弱化時間可通過多次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行篩選而獲得；C、將弱化處理過的小鼠胚胎在H-KSOM操作液中洗3次，以除去酸性臺氏液；d、將胚胎在Opti-MEM I溶液中洗3次，之后置入反義寡核苷酸稀釋液中；完成對胚胎的預(yù)處理之后，對胚胎進(jìn)行電穿孔，具體操作包括以下步驟1)使用電穿孔儀(ECM 2001Electro Cell Manipulator，BTX，美國)進(jìn)行電穿孔， 反義寡核苷酸溶液加入電轉(zhuǎn)皿取30 μ 1反義寡核苷酸溶液加入電轉(zhuǎn)皿兩根電極之間的凹槽；2)小鼠附植前胚胎置入電轉(zhuǎn)皿兩根電極之間將小鼠不同時期的附植前胚胎線性排列在電轉(zhuǎn)皿的兩根電極之間；3)反義寡核苷酸的電轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)參數(shù)是電壓30V，脈沖長度1ms，脈沖次數(shù)2次，重復(fù)次數(shù)1次；4)電轉(zhuǎn)后胚胎的培養(yǎng)將胚胎吸出并在操作液H-KSOM中洗3次，之后培養(yǎng)在KSOM 培養(yǎng)液中；100ml KSOM培養(yǎng)液配方同實(shí)施例1 ；5)在熒光顯微鏡下觀察胚胎發(fā)綠色熒光的情況電轉(zhuǎn)24h后，將不同時期的胚胎置于熒光顯微鏡下觀察照相并計算電轉(zhuǎn)效率。熒光顯微鏡觀察結(jié)果如圖2所示，圖A、圖B、圖C、圖D、圖E和圖F分別在1_細(xì)胞胚胎、2-細(xì)胞胚胎、4-細(xì)胞胚胎、8-細(xì)胞胚胎和桑椹胚時進(jìn)行的反義寡核苷酸電轉(zhuǎn)結(jié)果，對熒光亮度的定性的觀察結(jié)果顯示，在不同時期的胚胎轉(zhuǎn)染都達(dá)到了良好的轉(zhuǎn)染效果。
權(quán)利要求
1.一種質(zhì)粒DNA或反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染附植前胚胎的方法，其特征在于，包括以下步驟1)將待轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA用電轉(zhuǎn)緩沖液稀釋至濃度為10 80μ g/ml，得到質(zhì)粒DNA電穿孔溶液；或者將待轉(zhuǎn)染的反義寡核苷酸用電轉(zhuǎn)緩沖液稀釋至濃度為0. 2mM，得到反義寡核苷酸電穿孔溶液；2)將待轉(zhuǎn)染的附植前胚胎置于酸性臺氏液中，室溫孵育10 20s，然后終止消化并清洗；3)將質(zhì)粒DNA電穿孔溶液或反義寡核苷酸電穿孔溶液加入電轉(zhuǎn)皿兩根電極之間的凹槽中，將附植前胚胎線性排列在電轉(zhuǎn)皿的兩根電極之間，在脈沖電場下，利用電穿孔法對附植前胚胎進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
2.如權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染附植前胚胎的方法，其特征在于，所述的質(zhì)粒DNA 在轉(zhuǎn)染前還進(jìn)行去內(nèi)毒素處理，將去內(nèi)毒素處理的質(zhì)粒DNA用電轉(zhuǎn)緩沖液Opti-MEM I進(jìn)行稀釋。
3.如權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染附植前胚胎的方法，其特征在于，所述的將附植前胚胎在進(jìn)行酸性臺氏液處理之前，還對胚胎用H-KSOM溶液清洗。
4.如權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染附植前胚胎的方法，其特征在于，所述的終止消化是將胚胎從酸性臺氏液轉(zhuǎn)移到H-KSOM溶液中清洗，然后再用Opti-MEM I溶液清洗。
5.如權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染附植前胚胎的方法，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA為帶有熒光基因的質(zhì)粒DNA ；所述的反義寡核苷酸在轉(zhuǎn)染前還進(jìn)行l(wèi)issamine標(biāo)記，將lissamine標(biāo)記的反義寡核苷酸用電轉(zhuǎn)緩沖液Opti-MEM I進(jìn)行稀釋。
6.如權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染附植前胚胎的方法，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA包括一種或多種以上序列不同的質(zhì)粒DNA。
7.如權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染附植前胚胎的方法，其特征在于，所述的附植前胚胎包括處于不同發(fā)育時期的附植前胚胎。
8.如權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染附植前胚胎的方法，其特征在于，所述的電穿孔法進(jìn)行質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染的參數(shù)控制為電壓20V 40V ；脈沖時間1 2ms ；脈沖次數(shù)3 4次。
9.如權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染附植前胚胎的方法，其特征在于，所述的附植前胚胎為小鼠附植前胚胎，電轉(zhuǎn)參數(shù)控制為電壓20V 40V ；脈沖時間1 2ms ；脈沖次數(shù)3 4次。
10.如權(quán)利要求1所述的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染附植前胚胎的方法，其特征在于，所述的電穿孔完成后，將轉(zhuǎn)染后的胚胎清洗并轉(zhuǎn)移入KSOMaa培養(yǎng)液中培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種質(zhì)粒DNA或反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染附植前胚胎的方法，包括以下步驟1)配制待轉(zhuǎn)染的電穿孔溶液；2)對胚胎透明帶進(jìn)行弱化處理；3)將胚胎移入配制好的含電穿孔溶液，室溫靜置，然后再將胚胎連同電穿孔溶液移入電轉(zhuǎn)槽中進(jìn)行電穿孔。由于采用了電穿孔轉(zhuǎn)染的方法，本發(fā)明還能同時將兩種或多種質(zhì)粒DNA，或者反義寡核苷酸一起轉(zhuǎn)入附植前胚胎，如果構(gòu)建的質(zhì)粒DNA所攜帶的外源片段是某個關(guān)鍵基因或靶向某個關(guān)鍵基因的干擾片段，則可具體研究某個關(guān)鍵基因在小鼠附植前胚胎的發(fā)育過程中所起的具體作用。
文檔編號C12N15/87GK102559752SQ20111040379
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月7日
發(fā)明者常博皞, 張涌, 彭輝 申請人:楊凌科元克隆股份有限公司, 西北農(nóng)林科技大學(xué)