專利名稱：一種Bt蛋白Cyt1Da1、其編碼基因及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新的Bt蛋白及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在人類生產(chǎn)過程中，蟲害是造成農(nóng)業(yè)生產(chǎn)損失及影響人類健康的重要因素。為了減少這些損失，多年來，對農(nóng)作物害蟲及蚊蟲普遍采用化學(xué)防治手段進行防治，但由于化學(xué)農(nóng)藥的長期、大量使用，造成了對環(huán)境的污染，農(nóng)副產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留量增加，給人類的生存和健康帶來了危害。此外，化學(xué)農(nóng)藥在殺滅害蟲的同時，也殺傷了天敵及其它有益物，破壞了生態(tài)平衡。與化學(xué)防治相比，生物防治具有安全、有效、持久的特點。并且避免了化學(xué)防治帶來的一系列問題。因此，生物防治技術(shù)成了人們研究的熱點。在生物殺蟲劑中，蘇云金芽孢桿菌是目前世界上用途最廣、產(chǎn)量最大的一類微生物殺蟲劑。蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)是一種革蘭氏陽性細菌，它的分布極為廣泛，在芽孢形成的同時可形成具有殺蟲活性的由蛋白質(zhì)組成的伴胞晶體，又名殺蟲晶體蛋白Gnsectididal crystal proteins，簡稱ICPs)，ICPs是由cry基因編碼的，對敏感昆蟲有強烈毒性，而對高等動物和人無毒性。目前在農(nóng)田害蟲、森林害蟲及衛(wèi)生害蟲的防治中Bt已成為化學(xué)合成農(nóng)藥的有力替代品，Bt還是轉(zhuǎn)基因抗蟲工程植物重要的基因來源。自1981年Schn印f從菌株HD-I中克隆了第一個能表達殺蟲活性的基因以來，人們已經(jīng)分離克隆了 500多種編碼殺蟲晶體蛋白的基因，根據(jù)編碼的氨基酸序列同源性它們被分別確定為不同的群、亞群、類和亞類(Crickmore N, et al. Microbiol Mol Biol Rev, 1998,62 :807-813 ；http://www. biols. susx. ac. uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/)。一般而言，Cryl, Cry2和Cry9等毒蛋白對鱗翅目害蟲有效；其中研究的最多的是Cryl和Cry9類蛋白，它們編碼的殺蟲晶體蛋白分子量為130-140kD，許多基因目前已被廣泛應(yīng)用于植物的鱗翅目害蟲的防治。蘇云金芽胞桿菌以色列亞種(B. thuringiensis subsp. israelensis， 簡稱Bti)產(chǎn)生的毒素蛋白對蚊蟲具有很好殺蟲活性，被廣泛用于蚊蟲的防治。同時，Cyt蛋白具有溶細胞性，對某些Cry蛋白具有增效作用及延緩昆蟲的抗性。以Bt殺蟲晶體蛋白為基礎(chǔ)的殺蟲劑的使用已有50多年的歷史，最初一直沒有檢測到昆蟲對Bt的抗性，但是，上世紀80年中期開始，抗性問題不斷在實驗室及田間試驗中得到證實(McGaughey, W. H. 1985. Science. 229 :193-195)，原因主要是持續(xù)使用單品種及亞致劑量的Bt以及Bt轉(zhuǎn)基因抗蟲植物的應(yīng)用造成昆蟲種群長期受到殺蟲劑的選擇壓力。 1985 年，McGaughey 報道倉庫谷物害蟲印度谷螟(Plodia interpunctella)在 Dipel (Bt subsp. kurstaik HD-I的商品制劑)的選擇壓力下，繁殖15代后，抗性增加97倍；在高劑量選擇壓力下，抗性可增加250倍。1990年，在夏威夷首次證實大田中的小菜蛾對Bt 殺蟲劑產(chǎn)生了明顯的抗性(Tabashnik，B. Ε.，et al. 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91 4120-4124)，上世紀90年代以來，在我國應(yīng)用Bt殺蟲劑時間較長的深圳、廣州、上海等地， 發(fā)現(xiàn)Bt殺蟲劑對小菜蛾防治效果明顯下降，意味著抗性已經(jīng)形成(馮夏.1996.昆蟲學(xué)報，39 (3) :238-244 ；Hofie, H.，1988. Appl. Environ. Microbiol. 54 :2010-2017)。目前發(fā)現(xiàn)在實驗室及田間至少有十幾種昆蟲對Bt及其殺蟲晶體蛋白產(chǎn)生了抗性，用選擇壓力數(shù)學(xué)模型預(yù)測到，在Bt轉(zhuǎn)基因抗蟲植物選擇壓力的條件下，昆蟲將會產(chǎn)生抗性(khnepf， E.，et al. 1998. Mol. Biol. Rev. 65(3) :775-806)。另外，有研究證明 Bti 在大田的使用中尚未發(fā)現(xiàn)抗性問題，但是蚊蟲對其抗性問題不斷在實驗室中得到證實，這種情況也可能會在大田中出現(xiàn)(Georghiou G P, 1997. Applied and Environmental Microbiology, 63 1095-1101.)。為避免抗性昆蟲所造成的損失，尋找新的高毒力Bt基因資源是解決這個問題的有效途徑，這對我國的生物防治有著十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的在于針對上述不足提供一種新的Bt毒力蛋白資源。本發(fā)明的第二個目的在于提供編碼所述蛋白的基因。本發(fā)明的第三個目的在于提供上述蛋白及基因的應(yīng)用。本發(fā)明從四川省沐川原始森林地區(qū)土壤中分離得到的蘇云金芽孢桿菌新菌株 M(^8，該菌株已于2008年10月21日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (簡稱06110，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編 100101)保藏，分類命名為蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)，保藏號為CGMCC No. 2719。該菌已在中國專利CN101503666B中公開。通過對MC^S的毒力測試表明，MC28對鱗翅目害蟲、雙翅目害蟲等等均具有極高的毒力。從Μα8基因組和質(zhì)粒測序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)該菌株存在一個cyt基因，進一步設(shè)計其全長基因引物，克隆得到cytlDa基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 1所示，全長為 1527bp，分析表明，GC含量為28. 81 %，編碼508個氨基酸組成的蛋白。經(jīng)測定，其氨基酸序列如 SEQ ID No. 2 所示。在 softberry 網(wǎng)站采用 bacterial sigma7. Opromoter 程序?qū)θ蛄羞M行預(yù)測表明，在基因編碼區(qū)上游含有RNA聚合酶活化位點的序列，將其命名為 CytlDal0 CytlDal蛋白的氨基酸組成如表1。表1 CytlDal蛋白的氨基酸組成
權(quán)利要求
1.一種Bt蛋白CytlDal，其氨基酸序列是1)SEQID No. 2所示的氨基酸序列；2)SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸且具有同等活性的氨基酸序列。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，是如下1)或2)1)其核苷酸序列如序列表中SEQID No. 1所示；或2)由SEQID No. 1所示核苷酸序列經(jīng)取代一個或幾個核苷酸，得到的核苷酸序列。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達載體。
5.由權(quán)利要求4所述表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
6.如權(quán)利要求5所述的宿主細胞，其為植物宿主細胞。
7.含有權(quán)利要求1所述蛋白的殺蟲劑。
8.權(quán)利要求1所述的蛋白或其編碼基因在制備殺蟲劑中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1所述的蛋白或其編碼基因在培育轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1所述的蛋白或其編碼基因在提高植物抗蟲性中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的Bt蛋白Cyt1Da1及其編碼基因，所述蛋白具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個氨基酸且具有同等活性的氨基酸序列。本發(fā)明蛋白可以用于制備Bt殺蟲劑，編碼該蛋白的基因可以轉(zhuǎn)化棉花、玉米、水稻、蔬菜等農(nóng)作物，使其具備相應(yīng)的抗蟲活性，從而降低農(nóng)藥的使用量，減少環(huán)境污染，具有重要的經(jīng)濟價值和應(yīng)用前景。
文檔編號C12R1/07GK102408475SQ201110404408
公開日2012年4月11日 申請日期2011年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月7日
發(fā)明者關(guān)鵬, 朱軍, 李雙成, 李平, 王世全, 鄧其明, 鄭愛萍 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)