專利名稱：一種細胞信號通路抑制劑誘導(dǎo)豬脂肪細胞形成的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開一種細胞信號通路抑制劑誘導(dǎo)豬脂肪細胞形成的方法，將豬胚胎成纖維細胞轉(zhuǎn)化脂肪細胞，屬于細胞誘導(dǎo)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
由于臨床治療的需要，人們需要特殊分化的細胞來治療疾病，所以干細胞誘導(dǎo)及分化技術(shù)逐漸成熟，但隨之發(fā)現(xiàn)，一些細胞能夠不通過干細胞狀態(tài)直接分化成另一種類型的分化細胞，所報道的方法都是以轉(zhuǎn)基因的手段來實現(xiàn)的，直接將終末分化的細胞轉(zhuǎn)化為其他類型的功能細胞如將胚胎成纖維細胞、成軟骨細胞和視網(wǎng)膜上皮細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫呤湛s特性的肌細胞；將B淋巴細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榫奘杉毎?；將胰島外分泌細胞轉(zhuǎn)化為β胰島細胞樣細胞；將小鼠成纖維細胞轉(zhuǎn)化為功能性的神經(jīng)細胞；將小鼠心肌內(nèi)成纖維細胞重新編程為心肌細胞來修復(fù)受損的心臟。由于誘導(dǎo)細胞編程都是以轉(zhuǎn)基因為主，其轉(zhuǎn)基因后導(dǎo)致的外源基因插入突變對生物安全性有嚴重的影響，并且該方法獲得的細胞在疾病治療或者器官移植中都是不可用的，這就導(dǎo)致了目前的方法只適用于研究而不適用于臨床治療。目前，對脂肪細胞分化及調(diào)控方面的研究主要使用體外分化系統(tǒng)。現(xiàn)在已經(jīng)建立起來的最有代表性的兩個前脂肪細胞系是Green和Kehinde從17 — 19天小鼠胚胎的中胚層多能干細胞中分離并誘導(dǎo)分化出來的，即3T3-F442A和3T3-L1小鼠前脂肪細胞系，當(dāng)用適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)劑進行誘導(dǎo)刺激時，約經(jīng)過一周左右的時間就可分化成為充滿著脂肪滴的脂肪細胞。如利用該方法得到脂肪細胞，就必須預(yù)先分離得到前脂肪祖細胞，這就使得獲得脂肪細胞的難度大大增加，并且前脂肪細胞在動物體內(nèi)含量較少且不易分離純化，所以人們通常使用前脂肪細胞系由于研究，但其作為一種成系細胞，具有一定的致瘤性，并不適用于疾病治療。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種細胞信號通路抑制劑誘導(dǎo)豬脂肪細胞形成的方法，通過細胞信號通路抑制劑作于細胞，獲得的豬脂肪細胞沒有外源基因的插入，解決了轉(zhuǎn)基因后導(dǎo)致的外源基因插入突變對生物安全性影響的問題。本發(fā)明的技術(shù)解決方案如下
將豬胚胎成纖維細胞以Γ6Χ IO4個/ cm2的比例均勻的接種到Corning細胞培養(yǎng)板中，使用誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)；37°C ,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20天時，對細胞進行觀察并油紅0染色，可發(fā)現(xiàn)油紅0著色細胞，證明其確實為脂肪細胞；
誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為15% (v/v) Knockout Serum Replacement (Invitrogen)血清，82. 8% (v/v) DMEM/F12 (Invitrogen)培養(yǎng)基，0. ImM 非必須氨基酸 Gnvitrogen)， 0. 055πιΜβ -巰基乙醇(Invitrogen)，2 mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)，0. 2-1 μ M SB431542 (Stemgent)。所述細胞信號通路抑制劑誘導(dǎo)豬脂肪細胞形成的方法，還可加入0. 5-2 μ M通路抑制劑Thiazovivin后使其效率增加。細胞信號通路抑制劑SB431542和Thiazovivin分別作用于TGF-β /smad信號通路和ROCK信號通路。Smad3能夠與通過C/E B P β的Mad homology 1區(qū)域的結(jié)合，影響C/ E BP β與DNA的結(jié)合，從而抑制其活性，抑制脂肪細胞轉(zhuǎn)化。因此通過細胞信號通路抑制劑 SB431542的處理，可以抑制TGF- β /smad信號通路的活性，促進脂肪細胞的形成。而ROC家族成員能夠直接調(diào)節(jié)細胞骨架中的肌動蛋白進行重組，還能夠調(diào)節(jié)如細胞能動性、粘附力、 胞質(zhì)分裂等多種與肌動蛋白細胞骨架相關(guān)的細胞功能。ROCK介導(dǎo)的他0信號肽是通過磷酸化某些參與肌動蛋白絲組裝及收縮的底物來調(diào)節(jié)肌動蛋白細胞骨架的。而在脂肪形成的過程中絲狀的肌動蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從長的張力纖維變成皮質(zhì)肌動蛋白。因此抑制ROCK信號通路可促進脂肪細胞的形成。本發(fā)明的積極效果在于利用細胞信號通路抑制劑而非轉(zhuǎn)基因來誘導(dǎo)細胞轉(zhuǎn)化， 可有效的防止細胞基因組因插入外源基因而導(dǎo)致的基因突變。同時該方法對于研究脂肪細胞的形成機制有一定的促進作用，其簡便性和安全性可被廣泛的應(yīng)用，可用于脂肪形成機制的研究，也能在疾病治療等臨床應(yīng)用上發(fā)揮作用。


圖1為實施例1誘導(dǎo)得到的脂肪細胞；
圖2為實施例1誘導(dǎo)得到的脂肪細胞油紅0染色； 圖3為實施例IRT-PCR分析脂肪特異基因表達； 圖4為實施例1細胞免疫熒光染色分析脂肪特異基因表達； 圖5為實施例2誘導(dǎo)得到的脂肪細胞油紅0染色； 圖6為實施例3誘導(dǎo)得到的脂肪細胞油紅0染色； 圖7為實施例4誘導(dǎo)得到的脂肪細胞油紅0染色； 圖8為實施例5誘導(dǎo)得到的脂肪細胞油紅0染色； 圖9為實施例6誘導(dǎo)得到的脂肪細胞油紅0染色； 圖10為實施例7誘導(dǎo)得到的脂肪細胞油紅0染色； 圖11為實施例8誘導(dǎo)得到的脂肪細胞油紅0染色。
具體實施例方式下列實施例旨在進一步舉例描述本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明。在不背離本發(fā)明的精神和原則的前提下，對本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實現(xiàn)的任何改動或改變都將落入本發(fā)明的待批權(quán)利要求范圍之內(nèi)。實施例1
0. 5 μ M細胞信號通路抑制劑SB431542可誘導(dǎo)豬胚胎成纖維細胞轉(zhuǎn)化成為脂肪細胞將豬胚胎成纖維細胞以5 X IO4個/ cm2的比例均勻的接種到6cm細胞培養(yǎng)板中，使用誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為15%(v/v)Knockout Serum Replacement (Invitrogen) 血清，82. 8% (v/v) DMEM/F12 (Invitrogen)培養(yǎng)基，0. ImM 非必須氨基酸 Gnvitrogen)， 0·055πιΜβ-巰基乙醇 Gnvitrogen)，2mM L-谷氨酰胺 Qnvitrogen)，0. 5 μ M SB431542 (Stemgent)。37°C，5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
結(jié)果表明誘導(dǎo)培養(yǎng)20天時，經(jīng)觀察可發(fā)現(xiàn)有明亮的、富含脂滴的細胞的形成 (參見圖1、圖2)。油紅0染色后可觀察到被染成紅色的圓形的脂滴，豬脂肪特異性基因 (PPAR γ，C/EBP α、β、δ，LPL, ΑΡ2, Adipoq, CFD, SLC2A4)經(jīng) PCR 后分另Ij為 172，130，148， 127，150，114，229，88，83bp處出現(xiàn)特異性條帶，細胞免疫熒光呈陽性。證明0.5μΜ的 SB431542能夠促使豬胚胎成纖維細胞轉(zhuǎn)化成為脂肪細胞，計算得到的效率為17. 3%。參見圖3、20天時，誘導(dǎo)的到的脂肪細胞表達脂肪特異性基因，β-actin作為對照。特異基因 PPAR γ，C/EBP α、β、δ，LPL, ΑΡ2, Adipoq, CFD, SLC2A4, β -actin 片段的大小分別為 172,130,148,127,150,114,229,88,83,173 bp。圖4 用三種脂肪特異性基因蛋白抗體對誘導(dǎo)得到的脂肪細胞進行免疫熒光染色，從左到右分別為亮視野對照；DAPI染色；細胞免疫熒光染色。實施例2
0. 2 μ M細胞信號通路抑制劑SB431542可誘導(dǎo)豬胚胎成纖維細胞轉(zhuǎn)化成為脂肪細胞將豬胚胎成纖維細胞以5 X IO4個/ cm2的比例均勻的接種到6cm細胞培養(yǎng)板中，使用誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為15%(v/v)Knockout Serum Replacement (Invitrogen) 血清，82. 8% (v/v) DMEM/F12 (Invitrogen)培養(yǎng)基，0. ImM 非必須氨基酸 Gnvitrogen)， 0·055πιΜβ-巰基乙醇 Gnvitrogen)，2mM L-谷氨酰胺 Qnvitrogen)，0. 2 μ M SB431542 (Stemgent)。37°C，5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。結(jié)果表明誘導(dǎo)培養(yǎng)20天時，經(jīng)觀察可發(fā)現(xiàn)有明亮的、富含脂滴的細胞的形成。油紅O染色后可觀察到被染成紅色的圓形的脂滴，證明0. 2 μ M的SB431542能夠促使豬胚胎成纖維細胞轉(zhuǎn)化成為脂肪細胞，計算得到的效率為15. 8%。參見圖5.
實施例3
1 μ M細胞信號通路抑制劑SB431542可誘導(dǎo)豬胚胎成纖維細胞轉(zhuǎn)化成為脂肪細胞將豬胚胎成纖維細胞以5Χ IO4個/ cm2的比例均勻的接種到6cm細胞培養(yǎng)板中，使用誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為15%(v/v)Knockout Serum Replacement (Invitrogen) 血清，82. 8% (v/v) DMEM/F12 (Invitrogen)培養(yǎng)基，0. ImM 非必須氨基酸 Gnvitrogen)， 0. 055πιΜβ -巰基乙醇 Gnvitrogen)，2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)，1 μ M SB431542 (Stemgent)。37°C，5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。結(jié)果表明誘導(dǎo)培養(yǎng)20天時，經(jīng)觀察可發(fā)現(xiàn)有明亮的、富含脂滴的細胞的形成。油紅O染色后可觀察到被染成紅色的圓形的脂滴，證明1 μ M的SB431542能夠促使豬胚胎成纖維細胞轉(zhuǎn)化成為脂肪細胞，計算得到的效率為19. 1。參見圖6。實施例4
0. 5 μ M細胞信號通路抑制劑SB431542和0. 5 μ M細胞信號通路抑制劑Thiazovivin可誘導(dǎo)豬胚胎成纖維細胞轉(zhuǎn)化成為脂肪細胞
將豬胚胎成纖維細胞以5 X IO4個/ cm2的比例均勻的接種到6cm細胞培養(yǎng)板中，使用誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為15%(v/v)Knockout Serum Replacement (Invitrogen) 血清，82. 8% (v/v) DMEM/F12 (Invitrogen)培養(yǎng)基，0. ImM 非必須氨基酸 Gnvitrogen)， 0. 055πιΜβ -巰基乙醇(Invitrogen) ,2mM L-谷氨酰胺 Qnvitrogen)，0. 5 μ M Thiazovivin (Stemgent)，0· 5μ M SB431542 (Stemgent)。37°C，5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。結(jié)果表明誘導(dǎo)培養(yǎng)20天時，經(jīng)觀察可發(fā)現(xiàn)有明亮的、富含脂滴的細胞的形成。油紅0染色后可觀察到被染成紅色的圓形的脂滴，證明同時加入0. 5 μ M SB431542和0. 5 μ M Thiazovivin能夠促使豬胚胎成纖維細胞轉(zhuǎn)化成為脂肪細胞，計算得到的效率為25. 5%。 參見圖7。實施例5
0. 5 μ M細胞信號通路抑制劑SB431542和ΙμΜ細胞信號通路抑制劑Thiazovivin可誘導(dǎo)豬胚胎成纖維細胞轉(zhuǎn)化成為脂肪細胞
將豬胚胎成纖維細胞以5 X IO4個/ cm2的比例均勻的接種到6cm細胞培養(yǎng)板中，使用誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為15%(v/v)Knockout Serum Replacement (Invitrogen) 血清，82. 8% (v/v) DMEM/F12 (Invitrogen)培養(yǎng)基，0. ImM 非必須氨基酸 Gnvitrogen)， 0. 055πιΜβ -巰基乙醇(Invitrogen) ,2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)，1 μ M Thiazovivin (Stemgent)，0· 5μ M SB431542 (Stemgent)。37°C，5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。結(jié)果表明誘導(dǎo)培養(yǎng)20天時，經(jīng)觀察可發(fā)現(xiàn)有明亮的、富含脂滴的細胞的形成。油紅0染色后可觀察到被染成紅色的圓形的脂滴，證明同時加入0.5μ M SB431542和ΙμΜ Thiazovivin能夠促使豬胚胎成纖維細胞轉(zhuǎn)化成為脂肪細胞，計算得到的效率為27. 0%。 見圖8.
實施例6
0. 5 μ M細胞信號通路抑制劑SB431542和2 μ M細胞信號通路抑制劑Thiazovivin可誘導(dǎo)豬胚胎成纖維細胞轉(zhuǎn)化成為脂肪細胞
將豬胚胎成纖維細胞以5Χ IO4個/ cm2的比例均勻的接種到6cm細胞培養(yǎng)板中，使用誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為15%(v/v)Knockout Serum Replacement (Invitrogen) 血清，82. 8% (v/v) DMEM/F12 (Invitrogen)培養(yǎng)基，0. ImM 非必須氨基酸 Gnvitrogen)， 0·055πιΜβ-巰基乙醇(Invitrogen) ,2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)，2 μ M Thiazovivin (Stemgent)，0· 5μ M SB431542 (Stemgent)。37°C，5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。結(jié)果表明誘導(dǎo)培養(yǎng)20天時，經(jīng)觀察可發(fā)現(xiàn)有明亮的、富含脂滴的細胞的形成。油紅O染色后可觀察到被染成紅色的圓形的脂滴，證明同時加入0. 5 μ M SB431542和2 μ M Thiazovivin能夠促使豬胚胎成纖維細胞轉(zhuǎn)化成為脂肪細胞，計算得到的效率為27. 4%。 見圖9.
實施例7
豬胚胎成纖維細胞密度為4X IO4個/ cm2時經(jīng)細胞信號通路抑制劑SB431542(0. 5μΜ) 誘導(dǎo)可轉(zhuǎn)化成為脂肪細胞
將豬胚胎成纖維細胞以4Χ IO4個/ cm2的比例均勻的接種到6cm細胞培養(yǎng)板中，使用誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為15%(v/v)Knockout Serum Replacement (Invitrogen) 血清，82. 8% (v/v) DMEM/F12 (Invitrogen)培養(yǎng)基，0. ImM 非必須氨基酸 Gnvitrogen)， 0·055πιΜβ-巰基乙醇 Gnvitrogen)，2mM L-谷氨酰胺 Qnvitrogen)，0. 5 μ M SB431542 (Stemgent)。37°C，5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。結(jié)果表明誘導(dǎo)培養(yǎng)20天時，經(jīng)觀察可發(fā)現(xiàn)有明亮的、富含脂滴的細胞的形成。油紅O染色后可觀察到被染成紅色的圓形的脂滴，證明豬胚胎成纖維細胞密度為4X IO4個/ cm2時經(jīng)誘導(dǎo)能夠得到脂肪細胞，計算得到的效率為15. 9%。見圖10.
實施例8豬胚胎成纖維細胞密度為6X104個/ cm2時經(jīng)細胞信號通路抑制劑SB431542(0. 5μΜ) 誘導(dǎo)可轉(zhuǎn)化成為脂肪細胞
將豬胚胎成纖維細胞以6 X IO4個/ cm2的比例均勻的接種到6cm細胞培養(yǎng)板中，使用誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為15%(v/v)Knockout Serum Replacement (Invitrogen) 血清，82. 8% (v/v) DMEM/F12 (Invitrogen)培養(yǎng)基，0. ImM 非必須氨基酸 Gnvitrogen)， 0·055πιΜβ-巰基乙醇 Gnvitrogen)，2mM L-谷氨酰胺 Qnvitrogen)，0. 5 μ M SB431542 (Stemgent)。37°C，5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。結(jié)果表明誘導(dǎo)培養(yǎng)20天時，經(jīng)觀察可發(fā)現(xiàn)有明亮的、富含脂滴的細胞的形成。油紅0染色后可觀察到被染成紅色的圓形的脂滴，證明豬胚胎成纖維細胞密度為6X IO4個/ cm2時經(jīng)誘導(dǎo)能夠得到脂肪細胞，計算得到的效率為16. 7%。見圖11。通過以下試驗例證明本發(fā)明的效果 試驗例1 油紅0染色鑒定豬脂肪細胞
1試驗過程在20天時對誘導(dǎo)的細胞進行油紅0染色。首先使用10%甲醛(V· :V 水=1:9) 1 30min，用60%胃丙酉享(V異丙醇V水= 3 2)清洗、晾干，然后0. 6g/ml油紅0染色 30min，用30%異丙醇(V胃:V7K=3:7)快速清洗一遍，最后用蒸餾水清洗五遍后用顯微鏡觀察。2試驗結(jié)果油紅0染料可與脂肪細胞特異性的結(jié)合。所以豬胚胎成纖維細胞經(jīng)油紅0染色不著色，脂肪細胞的脂滴可被油紅0染成紅色。結(jié)果表明在顯微鏡下可觀察到被染成紅色的圓形的脂滴，證明其確實是脂肪細胞。試驗例2 油紅0染色測定脂肪細胞的形成效率
1試驗過程在20天時對誘導(dǎo)的細胞進行油紅0染色后。在同組的3個細胞培養(yǎng)板中(10X20)倍顯微鏡下隨機選取10個視野(1. 35mm2)進行油紅0染色細胞計數(shù)，取得平均數(shù)后計算每平方厘米(cm2)的脂肪細胞數(shù)目，除以起始的細胞密度(Γ6Χ104個/ cm2)，得到的結(jié)果即誘導(dǎo)效率。試驗例3 RT-PCR檢測豬脂肪細胞特異基因的表達
1試驗過程提取誘導(dǎo)20天的細胞總RNA作為模板，利用豬脂肪特異性基因(PPARy， C/EBP α、β、δ，LPL, ΑΡ2, Adipoq, CFD, SLC2A4)的引物進行 RT-PCR 鑒定。采用 Trizol (Invitrogen) i式齊Ll提取 RNA，米用 SuperScript IIIFirst-Strand SynThiazovivinesis System (Invitrogen)反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得 cDNA，PCR 反應(yīng)采用 Taq DNA polymerase (Fermentas)試劑。具體操作步驟參照說明書。PCR產(chǎn)物委托北京天根公司進行測序，證明其序列正確。 RT-PCR反應(yīng)的引物和大小分別為
基因上游引物(5，to3')下游引物(5’ to3')AmpliconSize(bp)PPARyCTGACCAMGCAAAGGCGAGACCCCTGAAAGATGCGAATG172C/EBPαCAAGAACAGCAACGAGTAGTCATTGTCACTGGTCAG130C/EBPβCAGCGACGAGTACAAGATCTGCTCCACCTTCTTCTG148C/EBPδGCTATCGTCAGGTCAGTTATCTCCATAATCAGTGTCCAA127LPLGCGTGTGGCTTCAGAGTCCAGGAATGAGATGGCAAGTGT150AP2CGAACTCTACAACACTCTGACCAACAAGCATATTGAACA114adipoqACTTGAAGGATGTGAAGGTATGTTGTGGTAGAGAAGGAA229CFDCATGATCTCCTCCTGCTGAAGCCTCGTGGTCCTCTCGTT88
權(quán)利要求
1.一種細胞信號通路抑制劑誘導(dǎo)豬脂肪細胞形成的方法，包括以下步驟將豬胚胎成纖維細胞以Γ6Χ IO4個/ cm2的比例均勻的接種到Corning細胞培養(yǎng)板中， 使用誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)；37°C，5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20天時，對細胞進行觀察并油紅0染色證明其為脂肪細胞；誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為15% (v/v) Knockout Serum Replacement (Invitrogen)血清，82. 8% (v/v) DMEM/F12 (Invitrogen)培養(yǎng)基，0. ImM 非必須氨基酸 Gnvitrogen)， 0. 055πιΜβ -巰基乙醇(Invitrogen)，2 mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)，0. 2-1 μ M SB431542 (Stemgent)。
2.如權(quán)利要求1所述細胞信號通路抑制劑誘導(dǎo)豬脂肪細胞形成的方法，其特征在于 在誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中還加入0. 5-2 μ M通路抑制劑Thiazovivin。
全文摘要
本發(fā)明提供一種細胞信號通路抑制劑誘導(dǎo)豬脂肪細胞形成的方法，將豬胚胎成纖維細胞以4~6×104個/cm2的比例均勻的接種到Corning細胞培養(yǎng)板中，使用誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)；37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20天時，對細胞進行觀察并油紅O染色證明其為脂肪細胞。利用細胞信號通路抑制劑而非轉(zhuǎn)基因來誘導(dǎo)細胞轉(zhuǎn)化，可有效的防止細胞基因組因插入外源基因而導(dǎo)致的基因突變。同時該方法對于研究脂肪細胞的形成機制有一定的促進作用，其簡便性和安全性可被廣泛的應(yīng)用，可用于脂肪形成機制的研究，也能在疾病治療等臨床應(yīng)用上發(fā)揮作用。
文檔編號C12N5/077GK102382800SQ201110404508
公開日2012年3月21日 申請日期2011年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月8日
發(fā)明者全龍泉, 周楊, 唐成程, 張明軍, 朱建國, 歐陽紅生, 逄大欣, 高飛 申請人:吉林大學(xué)