專利名稱：一種葡萄糖異構(gòu)酶突變體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種葡萄糖異構(gòu)酶，具體地說涉及一種高轉(zhuǎn)化率葡萄糖異構(gòu)酶突變體及其生產(chǎn)與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
葡萄糖異構(gòu)酶(glucose isomerase，GI)，又稱木糖異構(gòu)酶(xylose isomerase, XI) (EC5.3. 1.5)，可以催化D-葡萄糖等醛糖至D-果糖等相應(yīng)酮醣的異構(gòu)化反應(yīng)。因此是工業(yè)生產(chǎn)上大規(guī)模以淀粉制備高果糖漿的關(guān)鍵酶之一。果葡糖漿也稱高果糖漿或異構(gòu)糖漿，它是以酶法糖化淀粉所得的糖化液經(jīng)葡萄糖異構(gòu)酶的異構(gòu)作用，將其中一部分葡萄糖異構(gòu)成果糖，由葡萄糖和果糖而組成的一種混合糖糖漿。高果糖漿是甜度與蔗糖相當(dāng)、風(fēng)味純正、營養(yǎng)豐富，且具有協(xié)同增效、冷甜爽口、低熱量、不致齲齒防腐效果佳、吸水性好、發(fā)酵性能好等特點(diǎn)，是可以最佳替代蔗糖使用或取代蔗糖使用的新型甜味劑。此外，果糖代謝過程中不需胰島素的輔助，在體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化的肝糖生成量是葡萄糖的三倍，具有保肝作用；它還能抑制體內(nèi)蛋白質(zhì)的消耗，有利于運(yùn)動(dòng)員和體力勞動(dòng)者的營養(yǎng)補(bǔ)給。由于果葡糖漿具有比葡萄糖、蔗糖明顯優(yōu)越的保健與營養(yǎng)功效以及良好的食品加工性能，目前被越來越廣泛地應(yīng)用于飲料、冷食品、糖果、烘焙制品、水果罐頭及蜜餞、果醬等食品加工中，其需求量將不斷增加。果葡糖漿是一種由果糖和葡萄糖所組成的混合物，根據(jù)其果糖含量的不同，目前市場上主要有F42(果糖占42% )和F55(果糖占55% )兩個(gè)品種，F(xiàn)55糖漿相對(duì)于F42糖漿的主要優(yōu)點(diǎn)在于a. F42糖漿不能在低溫下儲(chǔ)存，易結(jié)晶析出葡萄糖，而F55糖漿則可以在沈 301的范圍內(nèi)儲(chǔ)存；b.在同等碳水化合物的前提下，F(xiàn)42糖漿其甜度只有普通蔗糖甜度75%，而F55糖漿甜度與蔗糖甜度相當(dāng)；c由于F55糖漿果糖含量更高，其保健價(jià)值更高。而根據(jù)目前國內(nèi)的具體生產(chǎn)、技術(shù)條件和成本要求，絕大部分生產(chǎn)企業(yè)只能先生產(chǎn)F42 產(chǎn)品，再經(jīng)色譜分離系統(tǒng)的濃縮出F90糖漿(果糖占90% )，再與F42糖漿勾兌出F55糖漿， 如果能直接生產(chǎn)出F55糖漿，則生產(chǎn)投資將大大降低。高溫有利于葡萄糖異構(gòu)轉(zhuǎn)化率的提高，目前，人們已經(jīng)從一些天然嗜熱菌中分離出許多了耐熱性葡萄糖異構(gòu)酶，如 Bacills thermoantarcti. CUS, Thermus aquaticus HB8,Thermotoga neapolitana等。人們對(duì)其產(chǎn)生的耐熱葡萄糖異構(gòu)酶進(jìn)行了純化、定性，肯定了它在制備高糖果漿工業(yè)中的巨大潛力。但由于嗜熱菌苛刻的培養(yǎng)條件、低的細(xì)胞產(chǎn)量及90°C以上的異構(gòu)轉(zhuǎn)化溫度造成副產(chǎn)物和色素的大量生成，其產(chǎn)酶并不適合工業(yè)化生產(chǎn)。 所以能在60-70°C下就有55%以上的轉(zhuǎn)化率的葡萄糖異構(gòu)酶真正是果葡糖漿工業(yè)生產(chǎn)所要解決的頭等問題！

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種葡萄糖異構(gòu)酶突變體，其親本具有NCBI 編碼YPJ89661所示的氨基酸序列，所述葡萄糖異構(gòu)酶突變體是第243位或244位或284位或286位的氨基酸突變?yōu)橥蛔優(yōu)楦彼?ftx))或絲氨酸(kr)或丙氨酸(Ala)或異亮氨酸(Ile)或蘇氨酸(Thr)或纈氨酸(Val)。所述葡萄糖異構(gòu)酶突變體為第244位組氨酸、第243位苯丙氨酸分別突變?yōu)楦彼?、絲氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、纈氨酸中的一種。所述葡萄糖異構(gòu)酶突變體為第243位苯丙氨酸、第244位組氨酸、284位脯氨酸、 286位組氨酸均突變?yōu)楦彼帷⒔z氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、纈氨酸中的一種。所述葡萄糖異構(gòu)酶突變體為是286位組氨酸突變?yōu)楦彼?、絲氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、纈氨酸中的一種。編碼本發(fā)明的葡萄糖異構(gòu)酶突變體的基因序列也屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一種生產(chǎn)葡萄糖異構(gòu)酶突變體的方法，具體技術(shù)方案如下根據(jù)嗜熱子囊菌(Thermobifida fusca)葡萄糖異構(gòu)酶基因NCBI編碼 CP000088，設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變的突變引物，以攜帶葡萄糖異構(gòu)酶基因的克隆載體為模板進(jìn)行定點(diǎn)突變構(gòu)建突變體；以質(zhì)粒PT7-7或能表達(dá)該酶的載體為表達(dá)載體，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE!3)細(xì)胞或能表達(dá)該酶的宿主細(xì)胞，挑選驗(yàn)證后的陽性單克隆進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。本發(fā)明應(yīng)用于果葡糖漿的生產(chǎn)，應(yīng)用溫度為60-70°C，應(yīng)用pH為5. 0-8. 5，應(yīng)用磷酸鹽濃度為50-100mM、鎂離子濃度為5-8mM。使用本突變體生產(chǎn)果葡糖漿，在上述轉(zhuǎn)化條件下，突變體酶生產(chǎn)果葡糖漿的轉(zhuǎn)化率達(dá)到55% -60%，較野生酶高3% -8%左右，此酶突變體解決了長期困擾果葡糖漿工業(yè)生產(chǎn)的技術(shù)難題，具有突出的技術(shù)進(jìn)步。


圖1葡萄糖異構(gòu)酶突變體的分離純化SDS-PAGE圖譜M 標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker，1破壁上清液，2熱處理純化后的酶液，3離子交換和凝膠排阻純化后的酶液，圖2葡萄糖異構(gòu)酶突變體的最適溫度圖3葡萄糖異構(gòu)酶突變體的最適pHNaAc-HAc 緩沖液(pH 4. 0-5. 0)，Na-K-PO4 緩沖液(pH 5. 0-9. 0)和 Gly-NaOH 緩沖液(ρΗ9· 0-12. 0)圖4葡萄糖異構(gòu)酶突變體在70°C穩(wěn)定性研究圖5葡萄糖異構(gòu)酶突變體在70°C轉(zhuǎn)化率研究pH7. 5 ( O ), pH5. O(D)
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、葡萄糖異構(gòu)酶單位點(diǎn)突變體的構(gòu)建根據(jù)嗜熱子囊菌(Thermobifida fusca)葡萄糖異構(gòu)酶基因NCBI編號(hào)CP000088， 采用化學(xué)全合成法合成親本序列，克隆到PMD18-T，構(gòu)建載體XylA/pMD18-T。根據(jù)親本序列設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變的突變引物，利用快速PCR技術(shù)，以載體xylA/pMD18-T為模板，單突變P284S 引物為引物 B-ST-I :5，-AGTGGCTACGACGGATCGCGCCACTTCGACTTCAAGACC-3'(下劃線為突變堿基)引物 B-ST-2 :5，-GGTCTTGAAGTCGAAGTGGCGCGATCCGTCGTAGCCACT-3’ (下劃線為突
變堿基)PCR反應(yīng)體系為2 X PrimeSTARTM GC Buffer (含Mg2+) 25 μ L，dNTPs (各 2. 5mmol/ L) 4 μ L，正向引物(10 μ Μ) 1 μ L，反向引物(10 μ Μ) 1 μ L，模板 DNA 1 μ L, PrimeSTARTM HS DNA Polymerase (2. 5U/ μ 1)0. 5μ L,力口入雙蒸水至 50 μ L。PCR擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性^iin;隨后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)(94 °C 10s,60°C 5s, 72°C 4min30s) ；72°C延伸 IOmin ；最后 4°C保溫。PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，感受態(tài)細(xì)胞在LB固體培養(yǎng)基(含 100 μ g/mL氨芐青霉素)培養(yǎng)過夜后，挑單克隆于LB液體培養(yǎng)基(含100 μ g/mL氨芐青霉素)中培養(yǎng)，后提取質(zhì)粒，突變質(zhì)粒測序正確，構(gòu)建的突變體命名為xylA-S。實(shí)施例2、葡萄糖異構(gòu)酶雙位點(diǎn)突變體的構(gòu)建根據(jù)嗜熱子囊菌(Thermobifida fusca)葡萄糖異構(gòu)酶基因NCBI編號(hào)CP000088， 采用化學(xué)全合成法合成親本序列，克隆到PMD18-T，構(gòu)建載體XylA/pMD18-T。根據(jù)親本序列設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變的突變引物，利用快速PCR技術(shù)，以載體xylA/pMD18-T為模板，雙突變F243I、 H244T，定點(diǎn)突變引物為引物 A-IT-I 5’ -TGGCACGGCAAACTGATCACCATCGACCTCAACGGC-3’ (下劃線為突變堿
基)引物 Α-IT-2 5，-GCCGTTGAGG TCGATGGTGA TCAGTTTGCC GTGCCA-3'(下劃線為突
變堿基)PCR反應(yīng)體系為2 X PrimeSTARTM GC Buffer (含Mg2+) 25 μ L，dNTPs (各 2. 5mmol/ L) 4 μ L，正向引物(10 μ Μ) 1 μ L，反向引物(10 μ Μ) 1 μ L，模板 DNA 1 μ L, PrimeSTARTM HS DNA Polymerase (2. 5U/ μ 1)0. 5μ L,力口入雙蒸水至 50 μ L。PCR擴(kuò)增條件為94 V預(yù)變性^iin ；隨后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)(94 °C IOs，60°C 5s， 72°C 4min30s) ；72°C延伸 IOmin ；最后 4°C保溫。PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，感受態(tài)細(xì)胞在LB固體培養(yǎng)基(含 100 μ g/mL氨芐青霉素)培養(yǎng)過夜后，挑單克隆于LB液體培養(yǎng)基(含100 μ g/mL氨芐青霉素)中培養(yǎng)，后提取質(zhì)粒，突變質(zhì)粒測序正確，構(gòu)建的突變體命名為xylA-IT。實(shí)施例3、葡萄糖異構(gòu)酶四位點(diǎn)突變體的構(gòu)建根據(jù)嗜熱子囊菌(Thermobifida fusca)葡萄糖異構(gòu)酶基因NCBI編號(hào)CP000088， 采用化學(xué)全合成法合成親本序列，克隆到PMD18-T，構(gòu)建載體XylA/pMD18-T。根據(jù)親本序列設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變的突變引物，利用快速PCR技術(shù)，以載體xylA/pMD18-T為模板，雙突變F243I/ H244T，定點(diǎn)突變引物為引物 A-IT-I 5’ -TGGCACGGCAAACTGATCACCATCGACCTCAACGGC-3’ (下劃線為突變堿
基)引物 A-IT-2 :5，-GCCGTTGAGG TCGATGGTGA TCAGTTTGCC GTGCCA-3，(下劃線為突
變堿基)再以載體XylA(FM3I/ffi44T)/pT7-7為模板，雙突變P284S/H286T，定點(diǎn)突變引物為
引物 B-ST-I :5，-AGTGGCTACGACGGATCGCGCACCTTCGACTTCAAGACC-3'(下劃線為突
變堿基)弓丨物 B-ST-2 5，-GGTCTTGAAGTCGAAGGTGCGCGATCCGTCGTAGCCACT-3，(下劃線為突變堿基)PCR 反應(yīng)體系均為2 XPrimeSTARTM GC Buffer (含 Mg2+) 25 μ L, dNTPs (各 2. 5mmol/L)4y L,正向引物(10 μ Μ) 1 μ L，反向引物(ΙΟμΜ)Ιμ ，模板 DNA IyL, PrimeSTARTM HS DNA Polymerase (2. 5U/ μ 1)0. 5μ L,加入雙蒸水至 50 μ L。PCR擴(kuò)增條件均為94°C預(yù)變性^iin ；隨后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)(94°C 10s，60°C 5s， 72°C 4min30s) ；72°C延伸 IOmin ；最后 4°C保溫。PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞，感受態(tài)細(xì)胞在LB固體培養(yǎng)基(含 100 μ g/mL氨芐青霉素)培養(yǎng)過夜后，挑單克隆于LB液體培養(yǎng)基(含100 μ g/mL氨芐青霉素)中培養(yǎng)，后提取質(zhì)粒，突變質(zhì)粒測序正確，構(gòu)建的突變體命名為xylA-ITST。實(shí)例4、野生或突變重組葡萄糖異構(gòu)酶的表達(dá)與發(fā)酵制備將上述得到的質(zhì)粒與ρΤ7_7載體(商業(yè)化載體)，進(jìn)行NdeI和HindIII雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)膠回收后，用T4連接酶16°C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109，經(jīng)37°C培養(yǎng)過夜，挑選轉(zhuǎn)化子于含100mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，他后抽提質(zhì)粒，得到富集的親本葡萄糖異構(gòu)酶質(zhì)粒和葡萄糖異構(gòu)酶突變體質(zhì)粒。將他們分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)細(xì)胞后在LB/Amp (含100 μ g/mL氨芐青霉素)平板上37°C培養(yǎng)，他后挑選轉(zhuǎn)化子在LB培養(yǎng)基(含100 μ g/mL氨芐青霉素)中37°C 液體培養(yǎng)過夜，后接入TB發(fā)酵液體培養(yǎng)基(含100 μ g/mL氨芐青霉素)37°C培養(yǎng)池后，降溫至25°C后，用％ig/LIPTG (異丙基硫代- β -D半乳糖苷)誘導(dǎo)培養(yǎng)30h。實(shí)例5、野生或突變重組葡萄糖異構(gòu)酶的純化取IOOml培養(yǎng)后的菌體10，000rpm，4°C離心lOmin，去盡上清，加入IOmL PBS緩沖液(50mM KP04, IOmM MgS04, pH 7.5)，充分混勻，ON 10s, OFF 10s，超聲破碎。4°C， 13，OOOrpm,離心30min,上清即為粗酶液，把粗酶液在70°C水浴lOmin, 4°C，13，OOOrpm,離心30min，取上清進(jìn)行離子柱純化。采用ARTK蛋白純化系統(tǒng)，采用kpharose Fast Flow層析柱，DEAE為其陰離子交換介質(zhì)基團(tuán)，洗脫液為A液(50mM KP04, 5mMMgS04, pH 7. 5)，B液 (OmM KP04，5mMMgS04，lM NaClpH 7. 5)。對(duì)出峰蛋白進(jìn)行酶活測定，選取合適的洗脫液比例洗脫含目的蛋白的吸收峰。再把目的蛋白用分子排阻色譜進(jìn)行二次純化，對(duì)出峰蛋白進(jìn)行酶活測定，選取合適的洗脫時(shí)間回收含目的蛋白的吸收峰，把目的蛋白用分子用SDS-PAGE 蛋白電泳對(duì)粗酶液和不同純化的階段產(chǎn)物進(jìn)行電泳，比較純化效果(見圖1)。多突變位點(diǎn)、雙突變位點(diǎn)和單突變位點(diǎn)葡萄糖異構(gòu)酶的酶學(xué)性質(zhì)基本相同，下文中以實(shí)例1中制備的多突變位點(diǎn)葡萄糖異構(gòu)酶為例進(jìn)行說明。實(shí)例6、重組葡萄糖異構(gòu)酶的特性。當(dāng)以葡萄糖為底物時(shí)，葡萄糖異構(gòu)酶的最適溫度為80°C (圖2)，最適pHIO (圖3)， 在70°C具有很高的穩(wěn)定性，半衰期大于30h(圖4)。實(shí)例7、HPLC方法分析葡萄糖異構(gòu)酶的轉(zhuǎn)化率?？疾靸煞NpH條件下重組葡萄糖異構(gòu)酶的轉(zhuǎn)化能力，葡萄糖轉(zhuǎn)化體系為5mL，包含 50mM Na-K-P04 緩沖液(pH 7. 5 或 5.0),42% (W/V) D-葡萄糖水溶液，5mM MgS04 水溶液，100U的酶液，70°C水浴，間隔一定時(shí)間取樣，樣品于沸水中加熱5min使樣品中的酶失活變性后，稀釋為1/100，12000r/min離心25min，上清經(jīng)0. 45 μ m超濾膜過濾后取500 μ L進(jìn)行分析。HPLC分析的條件為Agilentl200 HPLC色譜儀，Agilent自動(dòng)進(jìn)樣器，色譜柱Aminex HPX-87H Ion Exclusion Cloumn(7. 8mmX300mm)，Agilentl200 示差檢測器；流動(dòng)相為 0. 0005M H2S04溶液，流速0. 6mL/min ；柱溫50°C ；池溫(檢測器)30V ；進(jìn)樣量10 μ L。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5，將上述突變體表達(dá)獲得的突變酶與野生酶相比，可以發(fā)現(xiàn)，突變體實(shí)現(xiàn)了葡萄糖轉(zhuǎn)化率的提高，終產(chǎn)量達(dá)到60%。
權(quán)利要求
1.一種葡萄糖異構(gòu)酶突變體，其特征在于在NCBI登陸號(hào)YPJ89661所示的氨基酸序列中進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)酶的氨基酸位點(diǎn)的取代。
2.權(quán)利要求1所述的葡萄糖異構(gòu)酶突變體，其特征所述氨基酸取代位點(diǎn)為第243位苯丙氨酸、第244位組氨酸、284位脯氨酸、286位組氨酸的一個(gè)或其組合。
3.權(quán)利要求2所述的葡萄糖異構(gòu)酶突變體，其特征是第244位組氨酸、第243位苯丙氨酸分別突變?yōu)楦彼?、絲氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、纈氨酸中的一種。
4.權(quán)利要求2所述的葡萄糖異構(gòu)酶突變體，其特征是第243位苯丙氨酸、第244位組氨酸、284位脯氨酸、286位組氨酸均突變?yōu)楦彼?、絲氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、纈氨酸中的一種。
5.權(quán)利要求2所述的葡萄糖異構(gòu)酶突變體，其特征是第286位組氨酸突變?yōu)楦彼?、絲氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸、纈氨酸中的一種。
6.權(quán)利要求1-5任一所述突變體應(yīng)用于葡萄糖到果糖的轉(zhuǎn)化或制備果葡糖漿。
7.權(quán)利要求6所述應(yīng)用，其特征在于葡萄糖到果糖的轉(zhuǎn)化的處理工藝控制溫度為 70°C，pH 為 7. 5。
8.編碼權(quán)利要求1-5任一所述葡萄糖異構(gòu)酶突變體的核苷酸序列。
9.一種生產(chǎn)權(quán)利要求1-5任一所述葡萄糖異構(gòu)酶突變體的方法，其特征是由嗜熱子囊菌(Thermobifida fusca)總DNA獲得葡萄糖異構(gòu)酶基因，NCBI編碼為CP000088，經(jīng)定點(diǎn)突變后，突變基因以質(zhì)粒PT7-7或能表達(dá)該酶的質(zhì)粒為表達(dá)載體，以E. coli BL2KDE3)或能表達(dá)該酶的菌株為表達(dá)宿主，實(shí)現(xiàn)葡萄糖異構(gòu)酶基因的高效表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種葡萄糖異構(gòu)酶突變體及其應(yīng)用，屬于酶基因工程和酶工程領(lǐng)域。本發(fā)明由嗜熱子囊菌(Thermobifida fusca)總DNA獲得高溫葡萄糖異構(gòu)酶基因(NCBI編碼CP000088)，經(jīng)定點(diǎn)突變后，葡萄糖異構(gòu)酶基因以質(zhì)粒pT7-7或能表達(dá)該酶的載體為表達(dá)載體，以E.coli BL21(DE3)或能表達(dá)該酶的菌株為表達(dá)宿主，實(shí)現(xiàn)高轉(zhuǎn)化率葡萄糖異構(gòu)酶基因的高效表達(dá)；該葡萄糖異構(gòu)酶基因全長個(gè)1158核苷酸，編碼385個(gè)氨基酸，本發(fā)明構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化細(xì)菌或酵母表達(dá)葡萄糖異構(gòu)酶，所獲得的重組酶突變體具有葡萄糖異構(gòu)酶活性，在70℃條件下轉(zhuǎn)化率為60％，比親本的轉(zhuǎn)化率高出7％。該重組葡萄糖異構(gòu)酶的最適溫度為80℃，最適pH＝10，70℃半衰期不低于30h。此酶非常適合食品工業(yè)生產(chǎn)F55高果糖漿應(yīng)用的需要。
文檔編號(hào)C12N15/56GK102443578SQ20111040641
公開日2012年5月9日 申請(qǐng)日期2011年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月8日
發(fā)明者吳敬, 鄧輝, 陳堅(jiān), 陳晟 申請(qǐng)人:江南大學(xué)