專(zhuān)利名稱(chēng)：嗜熱內(nèi)切木聚糖酶基因工程菌的構(gòu)建及其酶的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，具體涉及一種嗜熱內(nèi)切木聚糖酶基因工程菌的構(gòu)建、利用該工程菌制備的嗜熱內(nèi)切木聚糖酶及該酶在工業(yè)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
木聚糖是植物細(xì)胞壁半纖維素的重要組成部分，它是僅次于纖維素、自然界中含量第二豐富的多聚糖，幾乎占地球可再生碳源的三分之一(Collins et. al. FEMSMicrobiology Reviews. 2005，29 :3_2；3)。木聚糖來(lái)源廣泛，可由林業(yè)、農(nóng)業(yè)、木材加工以及造紙等工業(yè)的副產(chǎn)品獲得，其主鏈主要是由木聚糖殘基以β_1，4-糖苷鍵構(gòu)成。而根據(jù)來(lái)源的不同，木聚糖的側(cè)鏈可以被阿拉伯糖、葡聚糖醛酸、乙酰基等殘基取代，由于成份復(fù)雜，木聚糖需要在包括木聚糖酶、D-木糖苷酶、葡萄糖醛酸酶以及α-L-阿拉伯呋喃糖酶等的共同作用下才能夠被徹底降解。β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶(Endo-^-l,4-xylanase, EC 3.2. 1.8)主要從主鏈內(nèi)部作用于木糖苷鍵，能夠?qū)Ｒ唤到饽揪厶菫榈途勰咎呛湍咎?，是木聚糖降解過(guò)程中最重要的酶之一 (Kulkami N, Shendye A, Rao M. Molecular and biotechnological aspects of xylanases[J], FEMS Microbiol. Rev. 1999,23(4) :411-456) 能夠產(chǎn)生木聚糖酶的微生物有很多，包括絲狀真菌、細(xì)菌、放線(xiàn)菌等。微生物中木聚糖酶由于來(lái)源菌株不同而導(dǎo)致其理化性質(zhì)和分子量不盡相同，其分子量從7. 7到150kDa都有分布，絕大多數(shù)在20_40kDa 之間，最適PH值在2-11都有分布。根據(jù)木聚糖酶催化區(qū)域的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)分析，可將其分為不同的家族，其中糖苷水解酶以第10家族和第11家族居多(Kulkami N, Shendye A， Rao M. Molecular and biotechnological aspects of xylanases[J]. FEMS Microbiol. Rev. 1999,23(4) :441-456)。在過(guò)去20年中，有大量的木聚糖酶被分離純化出來(lái)，它們的基因已經(jīng)被克隆，并在大腸桿菌、釀酒酵母、畢赤酵母等系統(tǒng)中進(jìn)行了表達(dá)。當(dāng)前，木聚糖酶在造紙、食品、飼料、紡織和能源等工業(yè)領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用前景，但能夠應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)的天然木聚糖酶卻很少，工業(yè)用酶要求有較高的酶活性，良好的PH穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性。如在食品加工過(guò)程中，高溫易造成酶失活，因此耐高溫的酶有更好的應(yīng)用前景(Beg QK, Kapoor Μ,Mahajan L,et al. Microbial xylanases and their industrial applications a review [J], Appl Microbiol. Biotechnol. 2001,56(3-4) :326-338) 到目前為止，國(guó)內(nèi)有關(guān)木聚糖酶產(chǎn)生菌的報(bào)道較多，其中以真菌(如黑曲霉)的研究居多，而細(xì)菌類(lèi)研究偏少。但較真菌所產(chǎn)木聚糖酶而言，細(xì)菌木聚糖酶有更好的熱穩(wěn)定性，具有更廣泛的工業(yè)應(yīng)用前景，并受到學(xué)術(shù)界的普遍關(guān)注(Badal C. Hemicellulose bioconversion[J]. J Ind Microbiol Biotechnol,2003, 30 :279-291)。木聚糖酶產(chǎn)生菌株熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)在 70_75°C的高溫下可以正常生長(zhǎng)，所以我們推斷它所產(chǎn)生的木聚糖酶具有良好的熱穩(wěn)定性， 非常適合工業(yè)化生產(chǎn)以及食品應(yīng)用，通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，它與其它已研究的木聚糖酶基因序列具有較低的同源性，我們希望通過(guò)此研究來(lái)發(fā)掘性質(zhì)優(yōu)良的新型木聚糖酶源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種能高效應(yīng)用的高比活嗜熱內(nèi)切木聚糖酶；本發(fā)明的目的之二是提供編碼上述高比活嗜熱內(nèi)切木聚糖酶的基因；本發(fā)明的目的之三是提供包含上述嗜熱內(nèi)切木聚糖酶的基因的重組載體；本發(fā)明的目的之四是提供包含上述嗜熱內(nèi)切木聚糖酶的基因的重組菌株；本發(fā)明的目的之五是提供一種嗜熱內(nèi)切木聚糖酶的基因工程菌的構(gòu)建方法。本發(fā)明的目的之六是提供上述高比活嗜熱內(nèi)切木聚糖酶的應(yīng)用。本發(fā)明的嗜熱內(nèi)切木聚糖酶的基因工程菌已于2011年10月31日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCCJia 中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路 1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。保藏編號(hào)為CGMCC No. 5420。其分類(lèi)命名為大腸埃希氏菌，拉丁名!Escherichia coli。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案一種嗜熱內(nèi)切木聚糖酶基因工程菌的構(gòu)建，所述的嗜熱內(nèi)切木聚糖酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，包括以下步驟A、熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)的培養(yǎng)按照 DSMZ 的配方配置厭氧培養(yǎng)基，按照100體積份的厭氧培養(yǎng)基注入1體積熱解纖維素菌的比例，將熱解纖維素菌接種到厭氧培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；B、基因組DNA的提取將步驟A培養(yǎng)的熱解纖維素菌用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取熱解纖維素菌的基因組，得到基因組DNA溶液；C、引物設(shè)計(jì)及用PCR法釣取嗜熱內(nèi)切木聚糖酶目的基因引物設(shè)計(jì)如下上游引物5’CCAGTCCCATGGAGAGCGAAGATTATTATGAAAA 3，，劃線(xiàn)部分為 Nco I 的酶切位點(diǎn)；下游引物5，CGACGACTCGAGAAAGTCAATTATTCTGAAAAATGCC3，，劃線(xiàn)部分為 Xho I 的酶切位點(diǎn)；以步驟B所得基因組DNA溶液為模板，在上述上游引物和下游引物的參與下進(jìn)行 PCR反應(yīng)，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，再對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到純化的PCR產(chǎn)物，然后用限制性?xún)?nèi)切酶Nco I和B10 I進(jìn)行雙酶切，得到嗜熱內(nèi)切木聚糖酶目的基因；D、構(gòu)建重組表達(dá)載體以pET28a為載體，對(duì)載體用限制性?xún)?nèi)切酶Nco I和)(h0 I進(jìn)行雙酶切，然后用連接試劑盒與步驟C所得嗜熱內(nèi)切木聚糖酶目的基因進(jìn)行連接，得到重組表達(dá)載體；E、將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中將步驟D所得重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌B L 21感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，得到嗜熱內(nèi)切木聚糖酶基因工程菌。所述的PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系按以下方法配制DNA聚合酶(Primer star) 1 μ 1，DNA 聚合酶緩沖液(Primer star buffer) 20 μ 1，作為模板的基因組DNA溶液2 μ 1，2. 5mM脫氧核苷酸混合物((1^ )8111，上下游引物各加40 11101，加超純水至總體積10(^1 ；所述的PCR反應(yīng)的反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性:3min ；然后98°C變性15s，56°C退火10s，72°C延伸90s，最后再72°C延伸20min，共32個(gè)循環(huán)。步驟C所述的用限制性?xún)?nèi)切酶Nco I和Bio I進(jìn)行雙酶切的酶切體系包括40 μ 1 純化的PCR產(chǎn)物，上游引物和下游引物各2μ 1，限制性?xún)?nèi)切酶緩沖液(FD buffer) 4. 9 μ L·所述的脫氧核苷酸混合物是脫氧腺嘌呤苷酸、脫氧鳥(niǎo)嘌呤苷酸、脫氧胞嘧啶核苷酸和脫氧胸腺嘧啶核苷酸的混合物，每種核苷酸的濃度均為25nmol/L。步驟D所述的用限制性?xún)?nèi)切酶Nco I和Bio I進(jìn)行雙酶切的酶切體系包括pET28a 空載體45 μ 1，上游引物和下游引物各2 μ 1，限制性?xún)?nèi)切酶緩沖液(FDbuffer) 6 μ 1，加超純水5μ 1至總體積60 μ 1。用上述嗜熱內(nèi)切木聚糖酶基因工程菌制備的嗜熱內(nèi)切木聚糖酶，所述的嗜熱內(nèi)切木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，該嗜熱內(nèi)切木聚糖酶具有以下特性(1)最適反應(yīng)溫度在45-85°C表現(xiàn)催化活力，最適反應(yīng)溫度為70°C ；(2)最適反應(yīng)pH在pH 4. 2-12. O范圍內(nèi)表現(xiàn)催化活力，最適pH為7.2;(3)底物特異性能夠有效地催化樺木木聚糖(Birctiwood)，山毛櫸木聚糖(Beechhood)，燕麥木聚糖(Oat Spelts)，高粘度羥甲基纖維素(高粘度CMC)，低粘度羥甲基纖維素(低粘度CMC) 的水解，其中水解的最適底物為山毛櫸木聚糖；(4)熱穩(wěn)定性將嗜熱內(nèi)切木聚糖酶在不同溫度孵育，表現(xiàn)出很好的熱穩(wěn)定性，其中60°C下保溫 240min仍然保持65%的活力，65°C下保溫150min仍然保持45%的活力；(5)對(duì)一價(jià)金屬離子有很好的抗性。上述嗜熱內(nèi)切木聚糖酶的制備方法是，將構(gòu)建在大腸桿菌宿主中的含嗜熱內(nèi)切木聚糖酶的工程菌進(jìn)行放大培養(yǎng)，然后通過(guò)細(xì)胞超聲破碎、熱失活大腸桿菌自主表達(dá)的雜蛋白、分離純化得到嗜熱內(nèi)切木聚糖酶。所述的嗜熱內(nèi)切木聚糖酶用于造紙、食品、飼料、紡織、釀酒和醫(yī)藥的生產(chǎn)領(lǐng)域中。熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)是一株極度嗜熱的細(xì)菌，可以降解纖維素，半纖維素，其最適生長(zhǎng)溫度為75°C。菌種購(gòu)買(mǎi)于德國(guó)微生物菌種保藏中心 DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen),通過(guò) NCBI 對(duì)熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)的全基因組進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其全基因組的233136-234149區(qū)域的1014bp的核苷酸可以編碼一種嗜熱內(nèi)切木聚糖酶，可以將其DNA分子中表達(dá)嗜熱內(nèi)切木聚糖酶活性的基因序列稱(chēng)為嗜熱內(nèi)切木聚糖酶基因Cb XynlOB0 由于嗜熱的熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)是一株厭氧細(xì)菌，培養(yǎng)條件復(fù)雜，人工培養(yǎng)比較困難，因此直接用培養(yǎng)厭氧菌來(lái)生產(chǎn)嗜熱內(nèi)切木聚糖酶成本比較高且周期比較長(zhǎng)。將嗜熱內(nèi)切木聚糖酶基因轉(zhuǎn)入易培養(yǎng)、可快速繁殖的常溫宿主如大腸桿菌內(nèi)，能夠有效地解決上述問(wèn)題。對(duì)厭氧的熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)通過(guò)培養(yǎng)、目的基因的提取，得到本發(fā)明所述嗜熱內(nèi)切木聚糖酶基因，我們委托上海華大基因有限公司進(jìn)行基因測(cè)序，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 1所示。將嗜熱內(nèi)切木聚糖酶基因裝載在pET系統(tǒng)載體上，然后轉(zhuǎn)入到大腸桿菌宿主中， 得到一株含目的基因的大腸桿菌工程菌。表達(dá)的產(chǎn)物是細(xì)胞可溶性蛋白，通過(guò)細(xì)胞超聲破碎、熱失活大腸桿菌雜蛋白和親和層析，即可進(jìn)行分離純化得到嗜熱蛋白。工程菌表達(dá)的嗜熱蛋白為嗜熱內(nèi)切木聚糖酶，其氨基酸序列如序列表SEQ ID No. 2所示。該嗜熱內(nèi)切木聚糖酶的最適催化溫度為70°C，最適pH為7. 2，可以催化木聚糖水解，有廣泛的應(yīng)用前景。如在造紙領(lǐng)域，在化學(xué)漂白之前用木聚糖酶對(duì)紙漿進(jìn)行預(yù)處理， 可增加纖維的分離度，使氯氣等化學(xué)漂白劑更好地滲透到紙漿里，從而大大減少化學(xué)漂白劑的用量，同時(shí)可以降低成紙的透氣度，提高緊度；在食品領(lǐng)域，可用于從棉殼、甘蔗渣、玉米芯等天然食物半纖維中制備低聚木糖；在飼料領(lǐng)域，可作為添加劑增進(jìn)飼料營(yíng)養(yǎng)成分的消化、吸收；在紡織領(lǐng)域，可用于苧麻脫膠等過(guò)程改善了勞動(dòng)條件，減少環(huán)境污染，減輕對(duì)纖維的損傷；在釀酒領(lǐng)域，木聚糖酶有助于提高發(fā)酵效率，增加酒精的產(chǎn)率；另外，木聚糖酶在去污洗滌、醫(yī)藥等行業(yè)中也有應(yīng)用。本發(fā)明的嗜熱內(nèi)切木聚糖酶基因與表達(dá)載體重組，形成重組表達(dá)載體，但是不限于特定的表達(dá)載體，優(yōu)選的表達(dá)載體為原核表達(dá)載體，進(jìn)一步優(yōu)先選擇的為pEDSa，將重組表達(dá)載體按常規(guī)方法導(dǎo)入適宜的宿主細(xì)胞，包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。本發(fā)明不限于任何特定的宿主細(xì)胞，只要它能夠表達(dá)所述重組表達(dá)載體，本發(fā)明使用大腸桿菌(E. coli BL21codon plus (DE3)-RIL)菌株。以上技術(shù)方案中所有基本分子生物學(xué)操作均參照“分子克隆實(shí)驗(yàn)指南”(第三版， 科學(xué)出版社，2002年)。


圖1是純化得到的嗜熱內(nèi)切木聚糖酶Cb XynlOB的電泳圖；圖2是嗜熱內(nèi)切木聚糖酶Cb XynlOB的pH_活力曲線(xiàn)；圖3是嗜熱內(nèi)切木聚糖酶Cb XynlOB的溫度-活力曲線(xiàn)；圖4是嗜熱內(nèi)切木聚糖酶Cb XynlOB的熱穩(wěn)定性-活力曲線(xiàn)；圖5是嗜熱內(nèi)切木聚糖酶Cb XynlOB的底物特異性。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 嗜熱內(nèi)切木聚糖酶工程菌的構(gòu)建及其酶的表達(dá)1、熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)的培養(yǎng)及其基因組 DNA的提取。按照DSMZ的配方，配置厭氧培養(yǎng)基(anaerocellum medium)，分裝于厭氧試管中， 每管5ml，培養(yǎng)基封閉后用真空泵將試管中的空氣抽干，并充入一定量的氮?dú)夂投趸嫉幕旌蠚怏w(80% N2和20% CO2)，在厭氧箱中用培養(yǎng)基Iml溶解購(gòu)買(mǎi)于DSMZ的熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)，按照1 %的接菌量接種于5ml試管中，混勻，75°C靜置培養(yǎng)數(shù)天，直至細(xì)菌開(kāi)始生長(zhǎng)起來(lái)。然后轉(zhuǎn)移至裝有IOOml培養(yǎng)基的錐形瓶中 75°C培養(yǎng)數(shù)天，_80°C保存菌體備用。取5ml 小試管培養(yǎng)的熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)，用北京普博欣生物技術(shù)有限責(zé)任公司的細(xì)菌基因組DNA小量提取試劑盒(Bacteria Genomic Mini Preparation Kit)提取細(xì)菌的基因組，所得染色體DNA溶液放4°C冰箱備用。2、引物設(shè)計(jì)及用PCR法提取嗜熱內(nèi)切木聚糖酶目的基因及重組載體的制備嗜熱細(xì)菌熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)基因組中含有幾段預(yù)測(cè)的可能的嗜熱內(nèi)切木聚糖酶基因。選擇核苷酸序列如表SEQ ID No. 1所示的基因作為研究對(duì)象，命名為XynlOB。該酶基因通過(guò)PCR方法從步驟1所得的基因組DNA中擴(kuò)增而得到。兩個(gè)引物是根據(jù)基因的序列及載體的限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)而設(shè)計(jì)的，委托上海生工生物工程公司合成。上游引物5，CCAGTCCCATGGAGAGCGAAGATTATTATGAAAA 3，，劃線(xiàn)部分為 Nco I 的酶切位點(diǎn)；下游引物5’CGACGACTCGAGAAAGTCAATTATTCTGAAAAATGCC 3，，劃線(xiàn)部分為》ιο I的酶切位點(diǎn)；兩個(gè)引物所設(shè)置的酶切位點(diǎn)與表達(dá)載體pET28a的Nco I和Bio I 相匹配，適合于在大腸桿菌中高效表達(dá)。PCR反應(yīng)在 ΙΟΟμ 1反應(yīng)體系中含有1μ 1 Primer star DNA聚合酶，Primer star buffer20 μ 1，模板DNA (基因組DNA) 2 μ 1,2. 5mM dNTP混合物(每種核苷酸濃度25nmol/ L)8y 1，上下游引物各加40pmol，，加ddH20至總體積ΙΟΟμ L· PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性3min ；循環(huán)程序?yàn)?8°C變性15s，56°C退火10s，72°C延伸90s ；最后再72°C延伸20min, 共32個(gè)循環(huán)。用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，分子量大小為1014bp，與預(yù)測(cè)的結(jié)果一致。使用上海捷瑞生物工程有限公司的PCR產(chǎn)物純化試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化。將純化的PCR產(chǎn)物用限制性?xún)?nèi)切酶Nco I和Bio I進(jìn)行雙酶切，酶切體系包括 40 μ 1的目的基因PCR回收產(chǎn)物，Nco I和Xho I各2 μ 1，F(xiàn)D_buffer4. 9 μ 1，37 °C下保溫2 小時(shí)。酶切完畢后用0.8%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，再用DNA凝膠檢測(cè)試劑盒回收酶切后的 DNA片段。用同樣的限制性?xún)?nèi)切酶Nco I和Bio I來(lái)酶切pET28a載體，反應(yīng)體系為60μ 1，體系包括:pET28a 空載體 45 μ 1，Nco I 和 Xho I 各 2 μ 1，F(xiàn)D-buffer 6 μ 1，加 ddH20 5 μ 1 至總體積60 μ 1。37°C下保溫2小時(shí)，然后再用磷酸酶O^astAP)處理去磷酸化，反應(yīng)二十分鐘左右，用0. 8%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，再用膠回收試劑盒回收。在16°C用連接試劑盒來(lái)連接木聚糖酶基因和載體。將連接載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌 DH5a中，用含卡那霉素的瓊脂平板進(jìn)行單克隆菌株的篩選和鑒定。挑取一個(gè)陽(yáng)性的單克隆，加入到含卡那霉素的試管中，37°C ISOrpm/min培養(yǎng)過(guò)夜，取菌液進(jìn)行PCR驗(yàn)證，得到一條大小為1240bp的條帶即為目的基因，證明目的基因已經(jīng)與載體連接并轉(zhuǎn)化到宿主中。測(cè)序正確后，提取重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(E. coli BL21codon plus (DE3)-RIL)中進(jìn)行表達(dá) pET^a-cbxynlOB-his。測(cè)序工作由上海華大基因完成。3、重組載體在宿主細(xì)菌中的表達(dá)將重組的DNA 質(zhì)粒、pEI^8a-cbxynlOB_his 轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(E. coli BL21codon plus(DE3)-RIL)感受態(tài)細(xì)胞中。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備及其載體轉(zhuǎn)化方法參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌，置5ml含卡那霉素的培養(yǎng)液中37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，次日接種到IOOml新鮮的含卡那霉素的2YT培養(yǎng)基中，37°C繼續(xù)培養(yǎng)4h。將初步放大的種子液以
的比例接入IL的2YT培養(yǎng)基中培養(yǎng)(37°C，120rpm/min)，其中加入了 100mg/ml的卡那霉素，當(dāng)0D600達(dá)到0. 8左右時(shí)加入200mg/ml的異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，降低培養(yǎng)溫度至22°C，誘導(dǎo)菌體表達(dá)目的蛋白。誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)夜后4°C，得到本發(fā)明所述工程菌，lOOOOrpm，IOmin離心搜集菌體。然后用50mM，pH8. 0的Tris-HCl緩沖液重懸菌體，超聲破碎(lsXls，30min)后的溶液在70°C下熱失活30min，然后4°C，13000rpm離心30min, 取上清即為粗酶液。利用重組嗜熱酶N-末端含有His-Tag，通過(guò)60 °C熱失活、鎳親和層析 (Ni-Chelating Column)對(duì)重組蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，用150mM咪唑洗脫與層析柱結(jié)合得到目的酶，然后在PH7. 2、溫度56°C條件下，以山毛櫸木聚糖為底物測(cè)定不同處理后的酶活力以及相應(yīng)的蛋白濃度，得到不同處理后的蛋白純化表，如表1所示。表1嗜熱內(nèi)切木聚糖酶Cb XynlOB的蛋白純化表
權(quán)利要求
1.一種嗜熱內(nèi)切木聚糖酶基因工程菌，含有嗜熱內(nèi)切木聚糖酶基因核苷酸序列SEQ ID NO :1。
2.如權(quán)利要求1所述的嗜熱內(nèi)切木聚糖酶基因工程菌，其特征在于所述嗜熱內(nèi)切木聚糖酶基因來(lái)源于熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)。
3.如權(quán)利要求1所述的一種嗜熱內(nèi)切木聚糖酶基因工程菌，其特征在于對(duì)所述的嗜熱內(nèi)切木聚糖酶基因的核苷酸序列SEQ ID NO :1之上進(jìn)行突變、改造或修飾。
4.如權(quán)利要求1所述的一種嗜熱內(nèi)切木聚糖酶基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于， 包括以下步驟A、熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptorbescii DSM 6725)的培養(yǎng)按照DSMZ的配方配置厭氧培養(yǎng)基，按照100體積份的厭氧培養(yǎng)基注入1體積熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)的比例，將熱解纖維素菌 (Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)接種到厭氧培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；B、基因組DNA的提取將步驟A培養(yǎng)的熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)的基因組，得到基因組DNA溶液；C、引物設(shè)計(jì)及用PCR法釣取嗜熱內(nèi)切木聚糖酶目的基因引物設(shè)計(jì)如下上游引物5 CCAGTCCCATGGAGAGCGAAGATTATTATGAAAA 3，，劃線(xiàn)部分為 Nco I 的酶切位占.下游引物5，CGACGACTCGAGAAAGTCAATTATTCTGAAAAATGCC 3，，劃線(xiàn)部分為 Xho I 的酶切位點(diǎn)；以步驟B所得基因組DNA溶液為模板，在上述上游引物和下游引物的參與下進(jìn)行PCR 反應(yīng)，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，再對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到純化的PCR產(chǎn)物，然后用限制性?xún)?nèi)切酶Nco I和B10 I進(jìn)行雙酶切，得到嗜熱內(nèi)切木聚糖酶目的基因；D、構(gòu)建重組表達(dá)載體以pET28a為載體，對(duì)載體用限制性?xún)?nèi)切酶Nco I和)(h0 I進(jìn)行雙酶切，然后用連接試劑盒與步驟C所得嗜熱內(nèi)切木聚糖酶目的基因進(jìn)行連接，得到重組表達(dá)載體；E、將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中將步驟D所得重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌B L 21感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，得到嗜熱內(nèi)切木聚糖酶基因工程菌。
5.如權(quán)利要求1所述的嗜熱內(nèi)切木聚糖酶基因工程菌的構(gòu)建，其特征在于所述的 PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系按以下方法配制DNA聚合酶(Primer star) 1μ 1, DNA聚合酶緩沖液 (Primer star buffer) 20 μ 1，作為模板的基因組DNA溶液2 μ 1，2. 5mM脫氧核苷酸混合物 (dNTP)8 μ 1，上下游引物各加40pmol，加超純水至總體積100 μ 1 ；所述的PCR反應(yīng)的反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性:3min ；然后98°C變性15s，60°C退火10s，72°C延伸90s，再72°C延伸 20min，共30個(gè)循環(huán)；所述的PCR反應(yīng)的反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性^iin ；然后98°C變性15s， 56°C退火10s，72°C延伸90s，最后再72°C延伸20min，共32個(gè)循環(huán)。
6.如權(quán)利要求1所述的嗜熱內(nèi)切木聚糖酶基因工程菌的構(gòu)建，其特征在于步驟C所述的用限制性?xún)?nèi)切酶Nco I和Bio I進(jìn)行雙酶切的酶切體系包括40μ 1純化的PCR產(chǎn)物， 上游引物和下游引物各2 μ 1，限制性?xún)?nèi)切酶緩沖液(FD buffer) 4. 9 μ L·
7.如權(quán)利要求2所述的嗜熱內(nèi)切木聚糖酶基因工程菌的構(gòu)建，其特征在于所述的脫氧核苷酸混合物是脫氧腺嘌呤苷酸、脫氧鳥(niǎo)嘌呤苷酸、脫氧胞嘧啶核苷酸和脫氧胸腺嘧啶核苷酸的混合物，每種核苷酸的濃度均為25nmol/L。
8.如權(quán)利要求1所述的嗜熱內(nèi)切木聚糖酶基因工程菌的構(gòu)建，其特征在于步驟D所述的用限制性?xún)?nèi)切酶Nco I和Bio I進(jìn)行雙酶切的酶切體系包括pET28a空載體45μ 1，上游引物和下游引物各2 μ 1，限制性?xún)?nèi)切酶緩沖液(FDbUffer)6y 1，加超純水5μ 1至總體積 60 μ 1。
9.一種用權(quán)利要求1所述的嗜熱內(nèi)切木聚糖酶基因工程菌制備的嗜熱內(nèi)切木聚糖酶， 其特征在于所述的嗜熱內(nèi)切木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，該嗜熱內(nèi)切木聚糖酶具有以下特性(1)最適反應(yīng)溫度在45-85°C表現(xiàn)催化活力，最適反應(yīng)溫度為70°C ；(2)最適反應(yīng)pH在pH 4. 2-12. O范圍內(nèi)表現(xiàn)催化活力，最適pH為7.2 ；(3)底物特異性能夠有效地催化BirctiwoocK樺木木聚糖)，Beechhood(山毛櫸木聚糖)，Oat Spelts (燕麥木聚糖)，高粘度CMC (高粘度羥甲基纖維素)，低粘度CMC (低粘度羥甲基纖維素)的水解，其中水解的最適底物為Beechhood(山毛櫸木聚糖)；(4)熱穩(wěn)定性將嗜熱內(nèi)切木聚糖酶在不同溫度孵育，表現(xiàn)出很好的熱穩(wěn)定性，其中60°C下保溫 240min仍然保持65%的活力，65°C下保溫150min仍然保持45%的活力；(5)對(duì)一價(jià)金屬離子有很好的抗性。
10.一種如權(quán)利要求6所述的嗜熱內(nèi)切木聚糖酶的制備方法，其特征在于將構(gòu)建在大腸桿菌宿主中的含嗜熱內(nèi)切木聚糖酶的工程菌進(jìn)行放大培養(yǎng)，然后通過(guò)細(xì)胞超聲破碎、熱失活大腸桿菌自主表達(dá)的雜蛋白、分離純化得到嗜熱內(nèi)切木聚糖酶。
11.一種如權(quán)利要求6所述的嗜熱內(nèi)切木聚糖酶的應(yīng)用，其特征在于所述的嗜熱內(nèi)切木聚糖酶用于造紙、食品、飼料、紡織、釀酒和醫(yī)藥的生產(chǎn)領(lǐng)域中。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種嗜熱內(nèi)切木聚糖酶基因工程菌的構(gòu)建及其酶的應(yīng)用。嗜熱內(nèi)切木聚糖酶基因來(lái)源于熱解纖維素菌(Caldicellulosiruptor bescii DSM 6725)；本發(fā)明采用生物工程技術(shù)，通過(guò)細(xì)菌的培養(yǎng)、目的基因釣取、構(gòu)建表達(dá)載體、及將載體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中等步驟構(gòu)建成嗜熱內(nèi)切木聚糖酶基因工程菌，再經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)、收集沉淀、超聲破碎、熱處理、親和層析等步驟純化獲得嗜熱內(nèi)切木聚糖酶。本發(fā)明的嗜熱內(nèi)切木聚糖酶具有很好的熱穩(wěn)定性，及對(duì)金屬離子、有機(jī)溶劑及表面活性劑的抗性，可用于造紙、食品、飼料、紡織、釀酒和醫(yī)藥的生產(chǎn)中。
文檔編號(hào)C12R1/19GK102559567SQ201110406838
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2011年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月8日
發(fā)明者馮雁, 安嬌, 楊廣宇, 田東升, 白挨璽, 謝淵 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)