專利名稱：嗜熱羧酸酯酶基因工程菌的構(gòu)建及其酶的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，具體涉及一種嗜熱羧酸酯酶基因工程菌的構(gòu)建、利用該工程菌制備的嗜熱羧酸酯酶及該酶在工業(yè)中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
嗜熱酶(thermophilic enzyme, 55-80 °C )由于在高溫下仍然具有很好的催化活性及熱穩(wěn)定性，所以與常溫酶和中溫酶相比在工業(yè)中有更廣泛的應(yīng)用。最早開發(fā)的嗜熱酶是1969年從美國黃石國家森林公園火山溫泉中分離的一種水生棲熱菌(Thermusaquaticus)yTl株分離提取的Taq DNA聚合酶，圓錐網(wǎng)團(tuán)菌 DSM6724 (Dictyoglomus turgidum DSM6724)是一種嗜熱細(xì)菌，能在 70 75 °C 生長。從此，嗜熱酶開始引起人們的重視，開始成為研究的焦點(diǎn)，許多具有水解酶活性的嗜熱酶相繼得到開發(fā)，并在許多領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用。今年來，從來源于海底熱流及溫泉的嗜熱細(xì)菌和古菌中分離出很多嗜熱酶和超嗜熱酶(hyperthermophilic enzyme,80-113°C ), 為現(xiàn)在分子酶學(xué)技術(shù)展現(xiàn)了新的應(yīng)用前景(王柏婧等，微生物學(xué)報(bào)，2002,42 =259-262 ； Fujiware S, et al. J. Biosci. Bioeng. 2002,94(6) :518-525 ；蔡錦剛等，Appl Microbiol Biotechnol (2011)89 :1463-1473)。嗜熱酶作為生物催化劑，與常溫酶及中溫酶相比有很多優(yōu)點(diǎn)(1)酶制劑制備的成本低。因?yàn)槭葻崦敢话阌泻芎玫臒岱€(wěn)定性，可以在室溫下分離提純和包裝運(yùn)輸，并且能長久地保持活力；( 動力學(xué)反應(yīng)快。反應(yīng)溫度的升高可以加快分子運(yùn)動速度，加快催化反應(yīng)；(3)減少了能耗。高溫反應(yīng)對反應(yīng)器冷卻系統(tǒng)的要求標(biāo)準(zhǔn)降低；(4)提高了產(chǎn)物的純度。 在高于70°C的催化溫度下，很少有雜菌生存，從而減少了細(xì)菌代謝物對最終產(chǎn)物的污染。嗜熱酶由于其很好的高溫反應(yīng)活性，近年來已經(jīng)在食品釀造工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、環(huán)境保護(hù)、遺傳工程等領(lǐng)域得到應(yīng)用，其良好前景備受關(guān)注。酯解的酶主要分為兩大類羧酸酯酶(carboxylesterase，EC 3. 1. 1. 1，羧酸酯水解酶)，是指能夠催化水解羧酸酯生成羧酸和醇的非特異性酯類，在結(jié)構(gòu)上與脂肪酶均屬于 α/β水解酶家族，，在氨基酸序列上按絲氨酸-天冬氨酸-組氨酸(Ser-Asp-His)排列，稱為SAH三聯(lián)體結(jié)構(gòu)，絲氨酸(Ser)、天冬氨酸(Asp)、組氨酸(His)構(gòu)成了典型的酶的活性區(qū)域。另一類是脂肪酶(EC 3. 1.1. 3，三?；视退饷?，催化三?；视偷乃?。它們在動物，植物，微生物中廣泛存在。微生物羧酸酯酶作為重要的工業(yè)酶類，可以催化酯水解、酯合成、酯交換等具有重要應(yīng)用價(jià)值的反應(yīng)，并具有良好的區(qū)域選擇性和立體選擇性。由于在食品工業(yè)，生物去污劑，醫(yī)藥和親酯化學(xué)來源酶的生產(chǎn)方面有多樣的應(yīng)用，羧酸酯酶在生物技術(shù)領(lǐng)域扮演著極其重要的角色。來源于嗜熱微生物的熱穩(wěn)定的酶類由于遺傳的穩(wěn)定性和高溫下催化的高效性，使它們有很好的潛在商業(yè)應(yīng)用價(jià)值，已越來越受到關(guān)注。嗜熱菌來源的羧酸酯酶由于在高溫和有機(jī)溶劑中很好的穩(wěn)定性，不僅可以延長酯酶的使用時(shí)間，還能擴(kuò)大其應(yīng)用范圍，已成為生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)?？傊?，羧酸酯酶表現(xiàn)出很好的區(qū)域和立體選擇性，其催化反應(yīng)不需要輔因子，有很好的有機(jī)溶劑穩(wěn)定性和激活作用，這使它成為化學(xué)合成和食品加工過程中很好的生物催化劑。一般的羧酸酯酶穩(wěn)定性差、易失活，與理想的生物催化劑有很大差距，這樣嗜熱酶就表現(xiàn)出很多的優(yōu)勢。最近博恩朔伊爾(Bornscheuer)和耶格(Jaeger) 等總結(jié)了羧酸酯酶和脂肪酶的性質(zhì)和應(yīng)用。因此，開發(fā)在高溫環(huán)境下具有較高催化活力的羧酸酯酶應(yīng)用于工業(yè)領(lǐng)域，有很好的前景和價(jià)值，也有利于研究羧酸酯酶的催化機(jī)制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是在嗜熱細(xì)菌中提取一種嗜熱羧酸酯酶的基因；本發(fā)明的目的之二是利用上述嗜熱羧酸酯酶基因通過生物化學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建一種嗜熱羧酸酯酶基因工程菌；本發(fā)明的目的之三是利用上述嗜熱羧酸酯酶基因工程菌制備一種熱穩(wěn)定性好、催化效率高的嗜熱羧酸酯酶；本發(fā)明的目的之四是通過對嗜熱羧酸酯酶的理化性質(zhì)的研究，提供嗜熱羧酸酯酶在工業(yè)生產(chǎn)中的多種用途。圓錐網(wǎng)團(tuán)菌DSM 67 是一株極度嗜熱的細(xì)菌，分離于堪察加半島的一個(gè)火山口，可以降解纖維素，果膠，淀粉，但是只在固體多糖和纖維素的培養(yǎng)基中生長是很微弱的， 其最適生長溫度為75°C。菌種購買于德國微生物菌種保藏中心DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen),通過NCBI對Dictyoglomus turgidum DSM6724 的全基因組進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)其全基因組的243301-M4539區(qū)域的1239bp的核苷酸可以編碼一種羧酸酯酶，可以將其DNA分子中表達(dá)嗜熱羧酸酯酶活性的基因序列稱為嗜熱羧酸酯酶基因DthtA。由于嗜熱的圓錐網(wǎng)團(tuán)菌DSM 67 是一株厭氧細(xì)菌，培養(yǎng)條件復(fù)雜，人工培養(yǎng)比較困難，因此直接用培養(yǎng)厭氧菌來生產(chǎn)嗜熱羧酸酯酶成本比較高且周期比較長。將嗜熱羧酸酯酶基因轉(zhuǎn)入培養(yǎng)條件簡單的常溫宿主如大腸桿菌內(nèi)，能夠有效地解決上述問題。本發(fā)明的嗜熱羧酸酯酶基因工程菌已于2011年10月M日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCCJia 中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院 3號，中國科學(xué)院微生物研究所。保藏編號為CGMCC No. 5386。其分類命名為大腸埃希氏菌，拉丁名!Escherichia coli。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種嗜熱羧酸酯酶基因工程菌的構(gòu)建，包括以下步驟A、嗜熱圓錐網(wǎng)團(tuán)菌DSM 67 的培養(yǎng)按照DSMZ的配方配置厭氧培養(yǎng)基，按照100體積份的厭氧培養(yǎng)基注入1體積份圓錐網(wǎng)團(tuán)菌DSM 67M的比例將圓錐網(wǎng)團(tuán)菌DSM 67M接種到厭氧培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；B、基因組DNA的提取將步驟A培養(yǎng)的嗜熱圓錐網(wǎng)團(tuán)菌DSM 67M用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取嗜熱圓錐網(wǎng)團(tuán)菌DSM 6724的基因組，得到基因組DNA溶液；C、引物設(shè)計(jì)及用PCR法釣取嗜熱羧酸酯酶目的基因引物設(shè)計(jì)如下上游引物5，GATATACCATGGCGCTCCCAGCCCTCTTCTTTCTT3’，劃線部分為 Nco I 的酶切位點(diǎn)；下游引物5，CGCCGCGGATCCGGTCTTTTCCTTTGCTCAAATAAC3’,劃線部分為BamH I 的酶切位點(diǎn)；以步驟B所得基因組DNA溶液為模板，在上述上游引物和下游引物的參與下進(jìn)行 PCR反應(yīng)，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，再對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到純化的PCR產(chǎn)物，然后用限制性內(nèi)切酶Nco I和BamH I進(jìn)行雙酶切，得到含有粘性末端的嗜熱羧酸酯酶目的基因；D、構(gòu)建重組表達(dá)載體以pET28a為載體，對載體用限制性內(nèi)切酶Nco I和BamH I進(jìn)行雙酶切，然后用連接試劑盒與步驟C所得含有粘性末端的嗜熱羧酸酯酶目的基因進(jìn)行連接，得到重組表達(dá)載體；E、將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中將步驟D所得重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BLP感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，得到嗜熱羧酸酯酶基因工程菌。所述的PCR反應(yīng)的反應(yīng)體系按以下方法配制DNA聚合酶(Primer star) 1 μ 1，DNA 聚合酶緩沖液(Primer star buffer) 20 μ 1，作為模板的基因組DNA溶液2 μ 1，2. 5mM脫氧核苷酸混合物((1^ )8111，上下游引物各加40 11101，加超純水至總體積10(^1 ；所述的PCR 反應(yīng)的反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性:3min ；然后98°C變性15s，退火10s，72°C延伸90s，再72°C 延伸20min，共30個(gè)循環(huán)；然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增時(shí)設(shè)置5個(gè)退火溫度梯度，分別是 50. 20C >52. 50C >56. 2°C >60. 2°C和 63. 5°C。步驟C所述的用限制性內(nèi)切酶Nco I和BamH I進(jìn)行雙酶切的酶切體系包括40 μ 1 純化的PCR產(chǎn)物，上游引物和下游引物各2 μ 1，限制性內(nèi)切酶緩沖液(FDbuffer) 4. 9 μ 1。所述的脫氧核苷酸混合物是脫氧腺嘌呤苷酸、脫氧鳥嘌呤苷酸、脫氧胞嘧啶核苷酸和脫氧胸腺嘧啶核苷酸的混合物。步驟D所述的用限制性內(nèi)切酶Nco I和BamH I進(jìn)行雙酶切的酶切體系包括 pET28a空載體45 μ 1，上游引物和下游引物各2 μ 1，限制性內(nèi)切酶緩沖液(FDbuffer) 6 μ 1， 加超純水5 μ 1至總體積60 μ 1。用上述嗜熱羧酸酯酶基因工程菌制備的嗜熱羧酸酯酶，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，該嗜熱羧酸酯酶具有以下特性(1)最適反應(yīng)溫度在30-95°C表現(xiàn)催化活力，最適反應(yīng)溫度為80°C ；(2)最適反應(yīng)pH在pH 6. 8-9范圍內(nèi)穩(wěn)定性較高，最適反應(yīng)pH為8. 0 ；(3)底物特異性能夠有效地催化對硝基苯酚酯及三丁酸甘油酯的水解，其中水解的最適底物為對硝基苯酚辛酸酯；(4)熱穩(wěn)定性將嗜熱羧酸酯酶在不同溫度孵育，表現(xiàn)出很好的熱穩(wěn)定性，其中50°C、65°C孵育 120h仍然保持約90%的活力，75°C孵育IOOh以上仍有50%的活力；(5)金屬離子、有機(jī)溶劑及表面活性劑對嗜熱羧酸酯酶活力的影響
對各種金屬離子、有機(jī)溶劑及表面活性劑都有很好的抗性。上述嗜熱羧酸酯酶的制備方法，是將構(gòu)建在大腸桿菌宿主中的含嗜熱羧酸酯酶的工程菌進(jìn)行放大培養(yǎng)，然后通過細(xì)胞超聲破碎、熱失活大腸桿菌自主表達(dá)的雜蛋白、分離純化得到嗜熱羧酸酯酶。上述嗜熱羧酸酯酶用于食品工業(yè)、生物去污劑和工業(yè)酶的生產(chǎn)領(lǐng)域中。本發(fā)明的嗜熱羧酸酯酶基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 1所示，嗜熱羧酸酯酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID No. 2所示。羧酸酯酶可以催化酯水解、酯合成、酯交換等具有重要應(yīng)用價(jià)值的反應(yīng)，并具有良好的區(qū)域選擇性和立體選擇性，在食品工業(yè)，生物去污劑，醫(yī)藥和親酯化學(xué)來源酶的生產(chǎn)方面有多樣的應(yīng)用，它在生物技術(shù)領(lǐng)域扮演著極其重要的角色。本發(fā)明的嗜熱羧酸酯酶基因與表達(dá)載體重組，形成重組表達(dá)載體，但是不限于特定的表達(dá)載體，優(yōu)選的表達(dá)載體為原核表達(dá)載體，進(jìn)一步優(yōu)先選擇的為pEDSa。將重組表達(dá)載體按常規(guī)方法導(dǎo)入適宜的宿主細(xì)胞，適宜的宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。本發(fā)明不限于任何特定的宿主細(xì)胞，只要它能夠表達(dá)所述重組表達(dá)載體，本發(fā)明使用BLP-E. coli BL (DE3) codon plus 菌株。以上技術(shù)方案中所有基本分子生物學(xué)操作均參照“分子克隆實(shí)驗(yàn)指南”(第三版， 科學(xué)出版社，2002年)。本發(fā)明的嗜熱羧酸酯酶催化反應(yīng)所利用的底物范圍為能參與水解、合成、轉(zhuǎn)酯反應(yīng)發(fā)生的化學(xué)物質(zhì)，在優(yōu)選的方案中，本發(fā)明使用對硝基苯酚脂肪酸酯作為底物。


圖1為純化得到的嗜熱羧酸酯酶DtEstA的電泳圖；圖2為嗜熱羧酸酯酶D讓StA的溫度一活力曲線；圖3為嗜熱羧酸酯酶D讓StA的pH-活力曲線；圖4為嗜熱羧酸酯酶D讓StA的底物特異性；圖5為嗜熱羧酸酯酶D讓StA的熱穩(wěn)定性。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 嗜熱酶工程菌的構(gòu)建及其酶的表達(dá)(1)嗜熱圓錐網(wǎng)團(tuán)菌DSM 6724的培養(yǎng)及其基因組DNA的提取按照DSMZ的配方，配置厭氧培養(yǎng)基(anaerocellum medium)，分裝于厭氧試管中， 每管5ml，培養(yǎng)基封閉后用真空泵將試管中的空氣抽干，并充入一定量的氮?dú)夂投趸嫉幕旌蠚怏w(80% N2和20% CO2)，在厭氧箱中用培養(yǎng)基Iml溶解購買于DSMZ的圓錐網(wǎng)團(tuán)菌 DSM 6724，按照的接菌量接種于5ml試管中，混勻，75°C靜置培養(yǎng)數(shù)天，直至細(xì)菌開始生長起來。然后轉(zhuǎn)移至裝有IOOml培養(yǎng)基的錐形瓶中75°C培養(yǎng)數(shù)天，_80°C保存菌體備用。取5ml小試管培養(yǎng)的嗜熱圓錐網(wǎng)團(tuán)菌DSM 6724，用北京普博欣生物技術(shù)有限責(zé)任公司的細(xì)菌基因組DNA小量提取試劑盒(Bacteria Genomic Mini Preparation Kit)提取細(xì)菌的基因組，所得染色體DNA溶液放4°C冰箱備用。(2)引物設(shè)計(jì)及用PCR法釣取羧酸酯酶目的基因及重組載體的制備
嗜熱細(xì)菌Dictyoglomus turgidum DSM 67 基因組中含有幾段預(yù)測的可能的羧酸酯酶基因。選擇核苷酸序列如表SEQ ID No. 1所示的基因作為研究對象，命名為DthtA。 該酶基因通過PCR方法從步驟(1)所得的基因組DNA中擴(kuò)增而得到。兩個(gè)引物是根據(jù)基因的序列及載體的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)而設(shè)計(jì)的，委托上海生工生物工程公司合成。上游引物5，GATATACCATGGCGCTCCCAGCCCTCTTCTTTCTT3，，劃線部分為 Nco I 的酶切位點(diǎn)；下游引物5，CGCCGCGGATCCGGTCTTTTCCTTTGCTCAAATAAC3’,劃線部分為BamH I 的酶切位點(diǎn)；兩個(gè)引物所設(shè)置的酶切位點(diǎn)與表達(dá)載體pET28a的Nco I和BamH I相匹配，適合于在大腸桿菌中高效表達(dá)。PCR反應(yīng)在100 μ 1反應(yīng)體系中含有1 μ 1 DNA聚合酶(Primer star)，DNA聚合酶緩沖液(Primer star buffer) 20 μ 1，模板 DNA(基因組 DNA) 2 μ 1,2. 5mM dNTP 混合物 (脫氧核苷酸混合物，由脫氧腺嘌呤苷酸、脫氧鳥嘌呤苷酸、脫氧胞嘧啶核苷酸和脫氧胸腺嘧啶核苷酸混合而成，每種核苷酸濃度25nmol/L) 8 μ 1，上下游引物各加40pmol，加超純水 (ddH20)至總體積100 μ 1。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性3min ；循環(huán)程序?yàn)?8°C變性15s, 退火10s，72°C延伸90s ；最后再72°C延伸20min，共30個(gè)循環(huán)，PCR擴(kuò)增時(shí)設(shè)置了 5個(gè)退火溫度梯度，分別是50. 2 0C 52. 5 0C 56. 2 °C 60. 2 °C 63. 5°C。用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物，分子量大小為IMObp，與預(yù)測的結(jié)果一致。使用上海捷瑞生物工程有限公司的PCR產(chǎn)物純化試劑盒對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化。將純化的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶Nco I和BamH I行雙酶切，酶切體系包括 40 μ 1的目的基因PCR回收產(chǎn)物，Nco I和BamH I各2 μ 1，F(xiàn)D-buffer4. 9 μ 1，37 °C下保溫 2小時(shí)。酶切完畢后用0. 8%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，再用DNA凝膠檢測試劑盒回收酶切后的DNA片段。用同樣的限制性內(nèi)切酶Nco I和BamH I來酶切pET28a載體，反應(yīng)體系為60 μ 1， 體系包括pET28a 空載體 45 μ 1，Nco I 和 BamH I 各 2 μ 1，F(xiàn)D-buffer 6 μ 1，加 ddH20 5 μ 1 至總體積60μ 1。37°C下保溫2小時(shí)，然后再用磷酸酶O^astAP)處理去磷酸化，反應(yīng)二十分鐘左右，用0. 8%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，再用膠回收試劑盒回收。在16°C用連接試劑盒來連接羧酸酯酶基因和載體。將連接載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌 DH5a中，用含卡那霉素的瓊脂平板進(jìn)行單克隆菌株的篩選和鑒定。挑取一個(gè)陽性的單克隆，加入到含卡那霉素的試管中，37°C ISOrpm/min培養(yǎng)過夜，取菌液進(jìn)行PCR驗(yàn)證，得到一條大小為1240bp的條帶即為目的基因，證明目的基因已經(jīng)與載體連接并轉(zhuǎn)化到宿主中。 測序正確后，提取重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到hcherichia coli BL21 (DE3) CodonPlus中進(jìn)行表達(dá) pET28a-dtuestA_his。測序工作由上海華大基因完成。(3)重組載體在宿主細(xì)菌中的表達(dá)重組的DNA 質(zhì)粒，pET28a-dtuestA-his 轉(zhuǎn)化到 Escherichia coli BL21 (DE3) CodonPlus感受態(tài)細(xì)胞中。大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備及其載體轉(zhuǎn)化方法參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。挑取陽性轉(zhuǎn)化菌，置5ml含卡那霉素的培養(yǎng)液中37°C振蕩培養(yǎng)過夜，次日接種到 IOOml新鮮的含卡那霉素的2YT培養(yǎng)基中，37°C繼續(xù)培養(yǎng)4h。將初步放大的種子液以的比例接入IL的2YT培養(yǎng)基中培養(yǎng)(370C 120rpm/min)，其中加入了 100mg/ml的卡那霉素，當(dāng)0D600達(dá)到0. 8左右時(shí)加入200mg/ml的異丙基-β _D_硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，降低培養(yǎng)溫度至22°C，誘導(dǎo)菌體表達(dá)目的蛋白。誘導(dǎo)表達(dá)過夜后4°C，得到本發(fā)明所述工程菌， IOOOOrpm, IOmin離心搜集菌體。然后用50mM，pH8. 0的Tris-HCl緩沖液重懸菌體，超聲破碎(lsXls，30min)后的溶液在70°C下熱失活30min，然后4°C，13000rpm離心30min，取上清即為粗酶液。因?yàn)橹亟M嗜熱酶N-末端含有His-Tag，應(yīng)用鎳親和層析(Ni-Chelating Column)對重組蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，用200mM咪唑洗脫與層析柱結(jié)合得到嗜熱酶。應(yīng)用 SDS-PAGE (12% )電泳檢測重組蛋白的純度，可見45KDa附近可見一條電泳條帶，如圖1所示。實(shí)施例2 重組嗜熱羧酸酯酶D讓StA的特性(1)最適反應(yīng)溫度反應(yīng)溫度是影響酶催化活力的重要因素。一般而言，嗜熱酶在高溫下有更高的活力，考慮到底物的穩(wěn)定性，本發(fā)明的羧酸酯酶催化的反應(yīng)檢測的最高溫度為95°C。以對硝基苯酚辛酸酯作為底物，在30-95°C溫度范圍內(nèi)測定D讓StA的的羧酸酯酶活力。由圖2可見，其活力在30-80°C溫度范圍內(nèi)隨溫度的升高而升高，在80°C以上，活力開始下降，所以 DtEstA的最適溫度為80°C。酯酶活力的檢測以對硝基苯酚辛酸酯作為羧酸酯酶水解底物，反應(yīng)體系為1ml， 緩沖體系為50mMTris-HCl (pH8. 0)，對硝基苯酚辛酸酯的終濃度為0. 2mM，加入10 μ 1的酶液，在不同的溫度下用浸島UV-2550型紫外-可見分光光度計(jì)在405nm下測定對硝基苯酚的吸光度值得變化。一個(gè)羧酸酯酶活力單位被定義為最適溫度下一分鐘內(nèi)從對硝基苯酯中釋放1微摩爾對硝基苯酚(ε = 0.016 μ M-l. cm-1)所需的酶量。(2)最適反應(yīng)的pH酶所處的環(huán)境的pH值會影響酶分子中帶電氨基酸的解離狀態(tài)機(jī)酶的構(gòu)象，這樣就會影響酶的催化活力。以對硝基苯酚辛酸酯作為底物，反應(yīng)體系為1ml，底物濃度為 0. 2mM。在75°C下測定嗜熱酶在pH4. 0-10. 0范圍內(nèi)的酶活力的變化，每個(gè)pH下測定3組平行數(shù)據(jù)，取平均值為酶活力值。所使用的緩沖液為寬范圍PHbuffer 以乙酸、N-2-羥乙基哌嗪-N' -2-乙磺酸(HEPS)、N-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPQ、3_環(huán)己胺基丙磺酸(CAPS)和2-碼啉乙磺酸(MES))為基礎(chǔ)，分別在75°C精確配制IOOmM不同pH的緩沖液。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3可以看出嗜熱酯酶D讓StA的最適pH為8.0。(3)底物特異性以不同的對硝基苯酚酯為底物，包括pNPC4，pNPC8, pNPCIO, pNPC12, pNPC14，在 75°C，pH8. 0的條件下測定DtuestA的底物特異性。反應(yīng)體系為1ml，底物濃度為0. 2mM。每種底物測定3組平行數(shù)據(jù)，取平均值為酶活力值。以底物對相對酶活力作圖即得DtuestA 底物選擇性的曲線。同時(shí)也測定了 DtuestA對于脂肪酶底物的活力，包括三甘油丁酸酯，三甘油辛酸酯。其中對于三甘油丁酸酯的為80U/mg，對于三甘油辛酸酯的活力幾乎為零，可以看出DtuestA確實(shí)是一個(gè)酯酶，結(jié)果如圖4。(4)熱穩(wěn)定性以對硝基苯酚辛酸酯作為底物來測定嗜熱酯酶DtuestA的熱穩(wěn)定性，將酶 (0. 663mg/ml)在50_80°C溫度范圍內(nèi)保溫，觀測酶在不同保溫時(shí)間的活力變化。選擇的保溫溫度為50 V，65°C，750C，80°C，85°C和90 V。以殘余活力對保溫溫度作圖，如圖5所示。(5)金屬離子、有機(jī)溶劑及表面活性劑對酶活力的影響選擇一系列一價(jià)、二價(jià)、三價(jià)金屬離子，主要包括K+、Na+、NH4+、Mg2+、Ni2+、i^2+、Mn2+、 Zn2+和Ca2+。觀測在不同濃度條件下它們對酶活力的影響，結(jié)果如表1所示。表1金屬離子對嗜熱羧酶酷酶D讓StA活力的影響
權(quán)利要求
1.一種嗜熱羧酸酯酶基因工程菌的構(gòu)建，所述的嗜熱羧酸酯酶基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1所示，其特征在于包括以下步驟A、嗜熱圓錐網(wǎng)團(tuán)菌DSM67M的培養(yǎng)按照DSMZ的配方配置厭氧培養(yǎng)基，按照100體積份的厭氧培養(yǎng)基注入1體積份圓錐網(wǎng)團(tuán)菌DSM 67M的比例將圓錐網(wǎng)團(tuán)菌DSM 67M接種到厭氧培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)；B、基因組DNA的提取將步驟A培養(yǎng)的嗜熱圓錐網(wǎng)團(tuán)菌DSM 6724用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取嗜熱圓錐網(wǎng)團(tuán)菌DSM 6724的基因組，得到基因組DNA溶液；C、引物設(shè)計(jì)及用PCR法釣取嗜熱羧酸酯酶目的基因引物設(shè)計(jì)如下上游引物5，GATATACCATGGCGCTCCCAGCCCTCTTCTTTCTT 3’，劃線部分為 Nco I 的酶切位點(diǎn)；下游引物:5，CGCCGCGGATCCGGTCTTTTCCTTTGCTCAAATAAC3，，劃線部分為 BamH I 的酶切位點(diǎn)；以步驟B所得基因組DNA溶液為模板，在上述上游引物和下游引物的參與下進(jìn)行PCR 反應(yīng)，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，再對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到純化的PCR產(chǎn)物，然后用限制性內(nèi)切酶Nco I和BamH I進(jìn)行雙酶切，得到含有粘性末端的嗜熱羧酸酯酶目的基因；D、構(gòu)建重組表達(dá)載體以pET28a為載體，對載體用限制性內(nèi)切酶Nco I和BamH I進(jìn)行雙酶切，然后用連接試劑盒與步驟C所得含有粘性末端的嗜熱羧酸酯酶目的基因進(jìn)行連接，得到重組表達(dá)載體；E、將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中將步驟D所得重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BLP感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)，得到嗜熱羧酸酯酶基因工程菌。
2.如權(quán)利要求1所述的嗜熱羧酸酯酶基因工程菌的構(gòu)建，其特征在于所述的PCR 反應(yīng)的反應(yīng)體系按以下方法配制DNA聚合酶(Primer star) 1 μ 1，DNA聚合酶緩沖液 (Primer star buffer) 20 μ 1，作為模板的基因組DNA溶液2 μ 1，2. 5mM脫氧核苷酸混合物 ((1^ )8111，上下游引物各加40 11101，加超純水至總體積10(^1 ；所述的PCR反應(yīng)的反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性3min ；然后98°C變性15s，退火10s, 72°C延伸90s,再72°C延伸20min，共 30個(gè)循環(huán)；然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增時(shí)設(shè)置5個(gè)退火溫度梯度，分別是50. 2°C、52.5°C、 56. 2°C>60. 2°C和 63. 5°C。
3.如權(quán)利要求1所述的嗜熱羧酸酯酶基因工程菌的構(gòu)建，其特征在于步驟C所述的用限制性內(nèi)切酶Nco I和BamH I進(jìn)行雙酶切的酶切體系包括40 μ 1純化的PCR產(chǎn)物，上游引物和下游引物各2 μ 1，限制性內(nèi)切酶緩沖液(FD buffer) 4. 9 μ 1。
4.如權(quán)利要求2所述的嗜熱羧酸酯酶基因工程菌的構(gòu)建，其特征在于所述的脫氧核苷酸混合物是脫氧腺嘌呤苷酸、脫氧鳥嘌呤苷酸、脫氧胞嘧啶核苷酸和脫氧胸腺嘧啶核苷酸的混合物。
5.如權(quán)利要求1所述的嗜熱羧酸酯酶基因工程菌的構(gòu)建，其特征在于步驟D所述的用限制性內(nèi)切酶Nco I和BamH I進(jìn)行雙酶切的酶切體系包括pET28a空載體45 μ 1，上游引物和下游引物各2 μ 1，限制性內(nèi)切酶緩沖液(FD buffer) 6μ 1,加超純水5 μ 1至總體積\60 μ 1。
6.一種用權(quán)利要求1所述的嗜熱羧酸酯酶基因工程菌制備的嗜熱羧酸酯酶，其特征在于所述的嗜熱羧酸酯酶的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，該嗜熱羧酸酯酶具有以下特性(1)最適反應(yīng)溫度在30-95°C表現(xiàn)催化活力，最適反應(yīng)溫度為80°C ；(2)最適反應(yīng)pH在pH 6. 8-9范圍內(nèi)穩(wěn)定性較高，最適反應(yīng)pH為8. 0 ；(3)底物特異性能夠有效地催化對硝基苯酚酯及三丁酸甘油酯的水解，其中水解的最適底物為對硝基苯酚辛酸酯；(4)熱穩(wěn)定性將嗜熱羧酸酯酶在不同溫度孵育，表現(xiàn)出很好的熱穩(wěn)定性，其中50°C、65°C孵育120h 仍然保持約90%的活力，75°C孵育IOOh以上仍有50%的活力；(5)金屬離子、有機(jī)溶劑及表面活性劑對嗜熱羧酸酯酶活力的影響對各種金屬離子、有機(jī)溶劑及表面活性劑都有很好的抗性。
7.—種如權(quán)利要求6所述的嗜熱羧酸酯酶的制備方法，其特征在于將構(gòu)建在大腸桿菌宿主中的含嗜熱羧酸酯酶的工程菌進(jìn)行放大培養(yǎng)，然后通過細(xì)胞超聲破碎、熱失活大腸桿菌自主表達(dá)的雜蛋白、分離純化得到嗜熱羧酸酯酶。
8.—種如權(quán)利要求6所述的嗜熱羧酸酯酶的應(yīng)用，其特征在于所述的嗜熱羧酸酯酶用于食品工業(yè)、生物去污劑和工業(yè)酶的生產(chǎn)領(lǐng)域中。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種嗜熱羧酸酯酶基因工程菌的構(gòu)建及其酶的應(yīng)用。嗜熱羧酸酯酶(DtEstA)基因來源于嗜熱圓錐網(wǎng)團(tuán)菌DSM6724(Dictyoglomus turgidumDSM6724)；本發(fā)明采用生物工程技術(shù)，通過細(xì)菌的培養(yǎng)、目的基因釣取、構(gòu)建表達(dá)載體、及將載體轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中等步驟構(gòu)建成嗜熱羧酸酯酶基因工程菌，再經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)、收集沉淀、超聲破碎、熱處理、親和層析等步驟純化獲得嗜熱羧酸酯酶DtEstA。本發(fā)明的嗜熱羧酸酯酶DtEstA具有很好的熱穩(wěn)定性，及對金屬離子、有機(jī)溶劑及表面活性劑的抗性，可用作化學(xué)合成和食品加工過程中很好的生物催化劑。
文檔編號C12N9/18GK102559718SQ20111040684
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月8日
發(fā)明者馮雁, 李彬春, 楊廣宇, 白挨璽, 鄭翠紅 申請人:上海交通大學(xué)