專利名稱：熱穩(wěn)定性提高的脂肪酶突變體及其構建方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術，具體涉及ー種熱穩(wěn)定性提高的脂肪酶突變體及其構建方、法。
背景技術：
脂肪酶(Lipase)是ー種用途十分廣泛的生物催化劑，不僅可催化油脂在水相中的水解，也能在非水相中催化酯合成、轉(zhuǎn)酯等反應，常被用于洗滌劑添加剤、食品、制藥エ業(yè)、造紙エ業(yè)和生物能源等方面。其中，南極假絲酵母脂肪酶B是目前最為有效的生物催化劑之一，廣泛用于藥物的手性拆分及生物柴油的生產(chǎn)(Kirk 0, Anderson EM,Karin M(1998)One biocatalyst-many applications The use oi Candida antarcticab-lipase in organic synthesis. Biocatal Biotransform 16(3) : 181-204)。但是エ業(yè)生產(chǎn)所需的苛刻條件和酶穩(wěn)定性之間的矛盾，長久以來一直在制約著脂肪酶的發(fā)展和應用。如為了保證催化效率，許多反應需要在較高溫度下進行，而南極假絲酵母脂肪酶B屬于中溫脂肪酶，它的熱穩(wěn)定性差不僅限制了其應用范圍，而且使酶易于失活，増加了生產(chǎn)成本。因此，獲得一株熱穩(wěn)定性提高的脂肪酶具有重要的エ業(yè)應用價值。半理性設計是一種結(jié)合了理性設計和定向進化兩方面優(yōu)勢的方法，其主g在于構建小而有效的突變庫。目前，半理性設計已成功用于改變酶的底物特異性、熱穩(wěn)定性、對映體選擇性等，并取得了顯著的成績(Reetz MT, Carballeira JD, Peyralans J, HobenreichH,Maichele A,Vogel A (2006a)Expanding the substrate scope of enzymes :Comoiningmutations obtained by casting. Chemistry-a European Journal 12(23) :6031-6038.Reetz MT, D Carballeira J, Vogel A(2006b)Iterative saturation mutagenesis onthe basis of b factors as a strategy for increasing protein thermostability.Angewandte Chemie-International Edition 45(46) :7745-7751.Reetz MT, PrasadS, Carballeira JD, Gumulya Y, Bocola M(2010)Iterative saturation mutagenesisaccelerates laboratory evolution of enzyme stereoselectivity :Rigorouscomparison with traditional methods. J Am Chem Soc 132(26) :9144-9152)。我們首先利用已知的信息進行分析，找出可能的“熱點”，再對這些“熱點”進行飽和突變，構建突變文庫；然后選擇合適的載體和宿主進行表達；最后對文庫進行篩選得到性質(zhì)改變的突變體。再以此突變株作為模板，重復上述過程，直至變體達到所預期的要求。大腸桿菌表達系統(tǒng)具有遺傳背景清楚，目的基因表達水平高，培養(yǎng)周期短，抗污染能力強等特點，是分子生物學研究和生物技術產(chǎn)業(yè)化發(fā)展進程中的重要工具。在前期工作中，發(fā)明人已成功將南極假絲酵母脂肪酶B在大腸桿菌中進行了高效表達。本發(fā)明以大腸桿菌作為宿主細胞，利用半理性設計的方法，獲得了熱穩(wěn)定性顯著提高的脂肪酶突變體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的，在于提供一種熱穩(wěn)定性提高的脂肪酶突變體及其構建方法。本發(fā)明的脂肪酶突變體已于2011年11月17日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCCjii :中國北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所。其分類命名為大腸埃希氏菌，拉丁名Escherichia colio其中，突變體Asp223Gly的保藏編號為CGMCC No. 5390，突變體Leu278Met的保藏編號為CGMCC No. 5389，突變體Asp223Gly/Leu278Met的保藏編號為CGMCC No. 5387，野生型WT的保藏編號為CGMCCNo.5388。本發(fā)明的技術方案是一種熱穩(wěn)定性提高的脂肪酶突變體，由南極假絲酵母脂肪酶B基因出發(fā)，運用多輪定點飽和突變而獲得；所述南極假絲酵母脂肪酶B具有SEQ ID No:I所示的氨基酸殘基序列；所述脂肪酶突變體具有SEQ ID No :2、SEQ ID No :3或SEQ IDNo 4所示的氨基酸殘基序列，SEQ ID No :2、SEQ IDNo :3和SEQ ID No :4均由317個氨基酸組成。上述熱穩(wěn)定性提高的脂肪酶突變體的構建方法，包括以下步驟A、南極假絲酵母脂肪酶B基因的克隆 對南極假絲酵母脂肪酶B基因通過上游引物和下游引物擴增目的基因；上游引物5’ -AATACCATGGCTCTACCTTCCGGTTCG-3’,帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶NcoI識別位點；下游引物5’ -TAACTCGAGGGGGGTGACGATGCCGGA-3’,帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶XhoI識別位點；以Takara的PrimeSTAR為聚合酶，在上游引物和下游引物的參與下進行PCR反應，得到PCR擴增產(chǎn)物；DpnI消化模板，回收，純化該目的片段，將其用限制性內(nèi)切酶NcoI和XhoI進行雙酶切后與經(jīng)同樣酶雙酶切的質(zhì)粒pET22b (Novagen)進行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞中，將轉(zhuǎn)化細胞涂布于含有100ug/ml氨芐的LB平板上篩選陽性克隆，得到重組質(zhì)粒，將該重組質(zhì)粒命名為pET22b-CALB ；B、南極假絲酵母脂肪酶B的結(jié)構分析及熱點確定對南極假絲酵母脂肪酶B的晶體結(jié)構進行分析(ID :1TCA)，脂肪酶的催化三聯(lián)體為自N端起第104位的絲氨酸、第187位的天冬氨酸和第224位的組氨酸，選取催化絲氨酸周圍的氨基酸殘基進行B因子的分析，確定下列B因子較高的殘基作為飽和突變的熱點自N端起第278位亮氨酸，285位纈氨酸，277位亮氨酸，281位甘氨酸，223位天冬氨酸；C、南極假絲酵母脂肪酶B突變體庫的建立及突變體的篩選Cl、根據(jù)熱點構建飽和突變體庫并導入宿主細胞以重組質(zhì)粒pET22b-CALB作為模板，針對步驟B中確定的熱點，分別在與第278位亮氨酸、第285位纈氨酸、第277位亮氨酸、第281位甘氨酸和第223位天冬氨酸相對應的核苷酸處利用NNK代替原有密碼子，設計簡并引物，并進行全質(zhì)粒PCR反應，構建5個定點飽和突變PCR擴增產(chǎn)物，反應結(jié)束后，DpnI消化模板，回收，純化后的PCR產(chǎn)物直接電擊導入大腸桿菌Rosetta(DE3)中，將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌直接涂布于含有100ug/ml氨芐和含有2% (v/v)乳化好的三丁酸甘油脂的LB抗性平板上，在37°C下培養(yǎng)16-24小時，得到針對5個熱點的飽和突變體庫；C2、從飽和突變體庫中篩選熱穩(wěn)定性提高的突變體將步驟Cl中37°C培養(yǎng)后的LB抗性平板在4°C下放置I天，進行初步篩選，將產(chǎn)生透明圈的菌落，接種于含有100ug/ml氨芐LB培養(yǎng)基的96孔板中，于37°C過夜培養(yǎng)，得到分屬5個突變體庫的母板；從培養(yǎng)好的母板中吸取20ul液體至新的含有100ug/ml氨芐LB培養(yǎng)基的96孔板中，37°C培養(yǎng)3h，4°C放置30min，再加入終濃度為ImM的IPTG，15°C培養(yǎng)24h ；利用凍融破碎的方法裂解菌體，得到粗酶液；將所得到的粗酶液在49°C下孵育15min,再于冰上放置IOmin,室溫放置15min,測定姆孔的殘余活力；將從5個突變體庫中篩選到的陽性突變體接入5ml小試管中，至0D600為0. 6-0. 8時，加入IPTG至終濃度ImM，15°C誘導表達，超聲破碎后測定粗酶液的T5tl15,確定熱穩(wěn)定性最高的突變體，進行測序，至此，完成了第一輪篩選，得到兩個熱點的優(yōu)秀突變體，分別是D223G 和 L278M ；以L278M的基因作為模板，進行迭代飽和突變針對285位纈氨酸、277位亮氨酸、281位甘氨酸和223位天冬氨酸位點設計飽和突變庫，并參考上述步驟進行新ー輪的篩選； 經(jīng)過多輪的迭代飽和突變，獲得了三株熱穩(wěn)定性明顯提高的菌株，測定脂肪酶核苷酸序列得出三株突變體分別為Asp223Gly、Leu278Met和Asp223Gly/Leu278Met。步驟A中所述的PCR反應的反應條件為98°C 2min ;然后98°C 10sec，55°C 15sec，72°C lmin，共 25 個循環(huán)；最后 72°C IOmin0步驟C I中所述的該PCR反應使用TaKaRa公司的PrimeSTAR DNA聚合酶，PCR反應條件為98°C 2min ;然后 98°C 10sec，55°C 15sec，72°C 7min，共 25 個循環(huán)；最后 72°C IOmin0上述熱穩(wěn)定性提高的脂肪酶突變體的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No 5,SEQ IDNo 6 或 SEQ ID No 7 所示。上述熱穩(wěn)定性提高的脂肪酶突變體應用于洗滌劑、添加剤、食品、制藥、造紙、或生物能源エ業(yè)生產(chǎn)中。與野生型南極假絲酵母脂肪酶B相比，本發(fā)明的脂肪酶突變體的熱穩(wěn)定性獲得了提高，以各自的T5tl15及48°C的半衰期t1/2來表示熱穩(wěn)定性的提高，本發(fā)明的脂肪酶突變體的提聞幅度如表I所不表I
15t1/2(48°C)提
脂肪酶突變體氨基酸取代位置 T5015 (0C) t1/2(48°C)(min)
ft倍數(shù)
_野生型___46.12__3.81__I _
_ 突變體 I__Asp223Gly__48.60 __13.323.5
—突變體 2__Leu278Met__49.23 __24.15__6.3 _
__ 突變體 3 _[ Asp223Gly/Leu278Met I _ 62.50 J_49.1612.9 _本發(fā)明運用半理性設計的方法，對南極假絲酵母脂肪酶B基因進行多輪定點飽和突變，獲取脂肪酶突變體，這些突變體包含氨基酸突變D223G、L278M及它們的組合。以各自的T5tl15及48°C的半衰期t1/2來表示，脂肪酶突變體的熱穩(wěn)定性得到了提高。具有較高的實際應用價值和廣闊的市場前景。


圖I為脂肪酶突變體Asp223Gly的反向測序峰圖；圖2為脂肪酶突變體Leu278Met的反向測序峰圖；圖3、圖4為脂肪酶突變體Asp223Gly/Leu278Met的反向測序峰圖。
具體實施例方式下述實施例中所用的方法，如無特殊說明均為常規(guī)方法，具體步驟可以參見((Molecular Cloning A Laboratory Manual))(Sambrook, J. ,Russell,Dsvid ff. ,Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd edition, 2001, NY, Cold Spring Harbor) 所用引物均由上海生工合成。實施例I野生型南極假絲酵母脂肪酶B基因的克隆野生型南極假絲酵母脂肪酶B基因由南京金斯瑞公司合成，通過上游引物5’_AATACCATGGCTCTACCTTCCGGTTCG-3’ (帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶NcoI識別位點)和下游引物5’-TAACTCGAGGGGGGTGACGATGCCGGA-3’ (帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶XhoI識別位點)擴增目的基因，該PCR反應使用Takara的PrimeSTAR聚合酶，PCR反應條件為98°C 2min,然后 98°C 10sec，55°C 15sec，72°C lmin，共 25 個循環(huán)；最后 72°C IOmin0 反應結(jié)束后，對 PCR擴增產(chǎn)物進行I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到Ikb大小的條帶，與預期結(jié)果相符。DpnI消化模板，回收，純化該目的片段，將其用限制性內(nèi)切酶NcoI和XhoI進行雙酶切后與經(jīng)同樣酶雙酶切的質(zhì)粒pET22b (Novagen)進行連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta (DE3)感受態(tài)細胞中，將轉(zhuǎn)化細胞涂布于含有100ug/ml氨芐的LB平板上篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒，對其進行測序，測序結(jié)果表明克隆的南極假絲酵母脂肪酶B基因序列正確，且正確連入pET22b中，將該重組質(zhì)粒命名為pET22b-CALB。實施例2南極假絲酵母脂肪酶B的結(jié)構分析及熱點確定對南極假絲酵母脂肪酶B的晶體結(jié)構進行分析(ID :1TCA)，脂肪酶的催化三聯(lián)體為自N端起第104位的絲氨酸，第187位的天冬氨酸，第224位的組氨酸。選取催化絲氨酸周圍的氨基酸殘基進行B因子的分析，確定一系列的B因子較高的殘基(自N端起，第278位亮氨酸，285位纈氨酸，277位亮氨酸，281位甘氨酸，223位天冬氨酸)作為飽和突變的熱點。實施例3飽和突變體庫的建立及突變體的篩選用下述方法篩選具有較好熱穩(wěn)定性的南極假絲酵母脂肪酶B的變體，具體過程包括以下步驟I、根據(jù)熱點構建飽和突變體庫并導入宿主細胞以實施例I中克隆的重組質(zhì)粒pET22b_CALB作為模板，針對實施例2中確定的熱點，分別在第278位亮氨酸，285位纈氨酸，277位亮氨酸，281位甘氨酸，223位天冬氨酸相對應的核苷酸處利用NNK代替原有密碼子，設計簡并引物，并進行全質(zhì)粒PCR構建5個定點飽和突變PCR擴增產(chǎn)物，該PCR反應使用TaKaRa公司的PrimeSTAR DNA聚合酶，PCR反應條件是98°C 2min ;然后 98°C IOsec, 55°C 15sec, 72°C 7min,共 25 個循環(huán)；最后 72°C IOmin0反應結(jié)束后，對于5個定點飽和突變的PCR擴增產(chǎn)物分別進行I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，DpnI消化模板，回收，純化后的PCR產(chǎn)物直接電擊導入大腸桿菌Rosetta(DE3)中。將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌直接涂布于含有100ug/ml氨芐和含有2% (v/v)乳化好的三丁酸甘油脂的LB抗性平板上，在37°C下培養(yǎng)16-24小時，得到針對5個熱點的飽和突變體庫。2、在飽和突變體庫中篩選熱穩(wěn)定性提高的突變體將步驟I中37°C培養(yǎng)后的平板在4°C下放置I天，進行初歩篩選。將產(chǎn)生透明圈的菌落，接種于含有100ug/ml氨芐LB培養(yǎng)基的96孔板中，于37°C過夜培養(yǎng)，得到分屬5個突變庫的母板。從培養(yǎng)好的母板中吸取20ul液體至新的含有100ug/ml氨芐LB培養(yǎng)基的96孔板中，37°C培養(yǎng)3h，4°C放置30min，再加入終濃度為ImM的IPTG，15°C培養(yǎng)24h。
利用凍融破碎的方法裂解菌體，得到粗酶液。將所得到的粗酶液在49°C下孵育15min,再于冰上放置IOmin,室溫放置15min,測定姆孔的殘余活力。將5個突變庫中篩選到的陽性突變體接入5ml小試管中，至0D600為0. 6-0. 8時，加入IPTG至終濃度ImM，15°C誘導表達，超聲破碎后測定粗酶液的T5tl15,確定熱穩(wěn)定性最高的突變體，進行測序，至此，完成了第一輪篩選。第一輪篩選得到了兩個熱點的優(yōu)秀突變體，分別是D223G和L278M，而277、281、285三個熱點的突變體庫并沒有篩選到優(yōu)秀突變體。以突變體L278M的基因作為模板，進行迭代飽和突變針對285位纈氨酸，277位亮氨酸，281位甘氨酸，223位天冬氨酸位點設計飽和突變庫，并參考上述步驟進行新ー輪的篩選。3、經(jīng)過多輪的迭代飽和突變，獲得了三株熱穩(wěn)定性明顯提高的菌株，測定脂肪酶核苷酸序列得出三株突變體分別為Asp223Gly、Leu278Met和雙點突變Asp223Gly/Leu278Met0圖I為脂肪酶突變體Asp223Gly的反向測序峰圖。圖2為脂肪酶突變體Leu278Met的反向測序峰圖。圖3、圖4為脂肪酶突變體Asp223Gly/Leu278Met的反向測序峰圖。實施例3南極假絲酵母脂肪酶B變體的熱穩(wěn)定性測定與活力測定為了測定脂肪酶變體的T5tl15活力及半衰期，需要對酶進行分離提純。將超聲破碎得到的粗酶液通過Ni2+離子親和柱進行純化，透析過夜即可得到純的脂肪酶變體組分。脂肪酶活力，半衰期及T5tl15的測定方法脂肪酶活力測定的方法為pNPC 法(p-nitrophenyl caprylate) (Cai JG, XieYA, Song B, Wang YP, Zhang ZM, Feng Y(2011)Fervidobacterium changbaicum Iipl Identiiication， cloning， and characterization oi the thermophilic lipase asa new member of bacterial lipase family v.Appl Microbiol Biotechnol 89(5)1463-1473.)。酶活的定義為pH7. 5、37°C下反應每分鐘產(chǎn)生Iumol對硝基苯酚的酶量為一個活力単位。脂肪酶在48°C下半衰期的測定方法為在48°C下孵育酶液，在不同處理時間取樣，PNPC法測定脂肪酶殘余活力百分比。以殘余活力百分比的In值對時間t(min)作圖，直線的斜率為失活常數(shù)kinac;t，由t1/2 = ln2/kinact得到脂肪酶在該溫度下的半衰期。脂肪酶的T5tl15測定方法為將一定濃度的酶液分裝到PCR管中，利用PCR儀在不同溫度下保溫15min，再于冰上放置lOmin，室溫15min，測定每管中的殘余活力。以殘余活力百分比的In值對保溫溫度T(°C)作圖，得到斜率k，由T5tl15= ln2/k得到脂肪酶的し15。以下列出本發(fā)明中的熱穩(wěn)定性提高的三種脂肪酶突變體的氨基酸殘基序列和相應的三種脂肪酶突變體基因的核苷酸序列。<210>SEQ ID NO 1<211>317<212>PRT〈213〉南極假絲酵母脂肪酶B氨基酸序列〈400〉ILeu Rro Ser Gly Ser Asp Rro Ala Phe SerGln Rro Lys Ser ValLeu Asp Ala Gly Leu5101520Thr Cys Gln Gly Ala Ser Rro Ser Ser ValSer Lys Rro lie LeuLeu Val Rro Gly Thr25303540Gly Thr Thr Gly Rro Gln Ser Phe Asp SerAsn Trp lie Rro LeuSer Thr Gln Leu Gly45505560Tyr Thr Rro Cys Trp lie Ser Rro Rro RroPhe Met Leu Asn AspThr Gln Val Asn Thr65707580Glu Tyr Met Val Asn Ala lie Thr Ala LeuTyr Ala Gly Ser GlyAsn Asn Lys Leu Rro859095100Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu ValAla Gln Trp Gly LeuThr Phe Phe Rro Ser105110115120lie Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu Met AlaPhe Ala Rro Asp TyrLys Gly Thr Val Leu125130135140Ala Gly Rro Leu Asp Ala Leu Ala Val SerAla Rro Ser Val TrpGln Gln Thr Thr Gly145150155160Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn AlaGly Gly Leu Thr Glnlie Val Rro Thr Thr165170175180Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu lie ValGln Rro Gln Val SerAsn Ser Rro Leu Asp185190195200Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys Asn ValGln Ala Gln Ala ValCys Gly Rro Leu Phe205210215220Val lie Asp His Ala Gly Ser Leu Thr SerGln Phe Ser Tyr ValVal Gly Arg Ser Ala225230235240Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg SerAla Asp Tyr Gly lieThr Asp Cys Asn Rro245250255260
Leu Rro Ala Asn Asp Leu Thr Rro Glu GlnLys Val Ala Ala AlaAla Leu Leu Ala Rro265270275280
Ala Ala Ala Ala lieVal Ala Gly Rro LysGln Asn Cys Glu RroAsp Leu Met Rro Tyr285290295300Ala Arg Rro Phe AlaVal Gly Lys Arg ThrCys Ser Gly lie ValThr Rro305310315317<210>SEQ ID NO 2<211>317<212>PRT〈213〉南極假絲酵母脂肪酶B變體Asp223Gly的氨基酸殘基序列 <400>2Leu Rro Ser Gly SerAsp Rro Ala Phe SerGln Rro Lys Ser ValLeu Asp Ala Gly Leu5101520Thr Cys Gln Gly AlaSer Rro Ser Ser ValSer Lys Rro lie LeuLeu Val Rro Gly Thr25303540Gly Thr Thr Gly RroGln Ser Phe Asp SerAsn Trp lie Rro LeuSer Thr Gln Leu Gly45505560Tyr Thr Rro Cys Trplie Ser Rro Rro RroPhe Met Leu Asn AspThr Gln Val Asn Thr65707580Glu Tyr Met Val AsnAla lie Thr Ala LeuTyr Ala Gly Ser GlyAsn Asn Lys Leu Rro859095100Val Leu Thr Trp SerGln Gly Gly Leu ValAla Gln Trp Gly LeuThr Phe Phe Rro Ser105110115120lie Arg Ser Lys ValAsp Arg Leu Met Ala Phe Ala Rro Asp TyrLys Gly Thr Val Leu125130135140Ala Gly Rro Leu AspAla Leu Ala Val SerAla Rro Ser Val TrpGln Gln Thr Thr Gly145150155160Ser Ala Leu Thr ThrAla Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Glnlie Val Rro The Thr165170175180Asn Leu Tyr Ser AlaThr Asp Glu lie ValGln Rro Gln Val SerAsn Ser Rro Leu Asp185190195200Ser Ser Tyr Leu PheAsn Gly Lys Ash ValGln Ala Gln Ala ValCys Gly Rro Leu Phe205210215220Val lie Gly His AlaGly Ser Leu Thr SerGln Phe Ser Tyr ValVal Gly Arg Ser Ala225230235240Leu Arg Ser Thr ThrGly Gln Ala Arg SerAla Asp Tyr Gly lieThr Asp Cys Asn Rro245250255260Leu Rro Ala Asn AspLeu Thr Rro Glu GlnLys Val Ala Ala AlaAla Leu Leu Ala Rro265270275280Ala Ala Ala Ala lieVal Ala Gly Rro LysGln Asn Cys Glu RroAsp Leu Met Rro Tyr285290295300L0137JAla Arg Rro Phe AlaVal Gly Lys Arg ihrCys Ser Gly lie Valihr Rro305310315317<210>SEQ ID NO 3<211>317<212>PRT〈213〉南極假絲酵母脂肪酶B變體Leu278Met的氨基酸蘇序列<400>3Leu Pro Ser Gly SerAsp Rro Ala Phe SerGin Rro Lys Ser ValLeu Asp Ala Gly Leu5101520Thr Cys Gin Gly AlaSer Rro Ser Ser ValSer Lys Rro lie LeuLeu Val Rro Gly Thr25303540Gly Thr Thr Gly RroGin Ser Phe Asp SerAsn Trp lie Rro LeuSer Thr Gin Leu Gly45505560Tyr Thr Rro Cys Trplie Ser Rro Rro RroPhe Met Leu Asn AspThr Gin Val Asn Thr65707580Glu Tyr Met Val AsnAla lie Thr Ala LeuTyr Ala Gly Ser GlyAsn Asn Lys Leu Rro859095100Val Leu Thr Trp SerGin Gly Gly Leu ValAla Gin Trp Gly LeuThr Phe Phe Rro Ser105110115120lie Arg Ser Lys ValAsp Arg Leu Met AlaPhe Ala Rro Asp TyrLys Gly Thr Val Leu125130135140Ala Gly Rro Leu AspAla Leu Ala Val SerAla Rro Ser Val TrpGin Gin Thr Thr Gly145150155160Ser Ala Leu Thr ThrAla Leu Arg Asn AlaGly Gly Leu Thr Ginlie Val Rro Thr Thr165170175180Asn Leu Tyr Ser AlaThr Asp Glu lie ValGin Rro Gin Val SerAsn Ser Rro Leu Asp185190195200Ser Ser Tyr Leu PheAsn Gly Lys Asn ValGin Ala Gin Ala ValCys Gly Rro Leu Phe205210215220Val lie Asp His AlaGly Ser Leu Thr SerGin Phe Ser Tyr ValVal Gly Arg Ser Ala225230235240Leu Arg Ser Thr ThrGly Gin Ala Arg SerAla Asp Tyr Gly lieThr Asp Cys Asn Rro245250255260Leu Rro Ala Asn AspLeu Thr Rro Glu GinLys Val Ala Ala AlaAla Leu Met Ala Rro265270275280Ala Ala Ala Ala lieVal Ala Gly Rro LysGin Asn Cys Glu RroAsp Leu Met Rro Tyr285290295300Ala Arg Rro Phe AlaVal Gly Lys Arg ThrCys Ser Gly lie ValThr Rro305310315317
<210>SEQ ID NO 4<211>317<212>PRT〈213〉南極假絲酵母脂肪酶B變體Asp223Gly/Leu278Met的氨基酸殘基序列<400>4Leu Pro Ser Gly SerAsp Pro Ala Phe SerGin Pro Lys Ser ValLeu Asp Ala Gly Leu5101520Thr Cys Gin Gly AlaSer Pro Ser Ser ValSer Lys Pro lie LeuLeu Val Pro Gly Thr25303540Gly Thr Thr Gly ProGin Ser Phe Asp SerAsn Trp lie Pro LeuSer Thr Gin Leu Gly45505560Tyr Thr Pro Cys Trplie Ser Pro Pro ProPhe Met Leu Asn AspThr Gin Val Asn Thr65707580Glu Tyr Met Val AsnAla lie Thr Ala LeuTyr Ala Gly Ser GlyAsn Asn Lys Leu Pro859095100Val Leu Thr Trp SerGin Gly Gly Leu ValAla Gin Trp Gly LeuThr Phe Phe Pro Ser105110115120lie Arg Ser Lys ValAsp Arg Leu Met AlaPhe Ala Pro Asp TyrLys Gly Thr Val Leu125130135140Ala Gly Pro Leu AspAla Leu Ala Val SerAla Pro Ser Val TrpGin Gin Thr Thr Gly145150155160Ser Ala Leu Thr ThrAla Leu Arg Asn AlaGly Gly Leu Thr Ginlie Val Pro Thr Thr165170175180Asn Leu Tyr Ser AlaThr Asp Glu lie ValGin Pro Gin Val SerAsn Ser Pro Leu Asp185190195200Ser Ser Tyr Leu PheAsn Gly Lys Asn ValGin Ala Gin Ala ValCys Gly Pro Leu Phe205210215220Val lie Gly His AlaGly Ser Leu Thr SerGin Phe Ser Tyr ValVal Gly Arg Ser Ala225230235240Leu Arg Ser Thr ThrGly Gin Ala Arg SerAla Asp Tyr Gly lieThr Asp Cys Asn Pro245250255260Leu Pro Ala Asn AspLeu Thr Pro Glu GinLys Val Ala Ala AlaAla Leu Met Ala Pro265270275280Ala Ala Ala Ala lieVal Ala Gly Pro LysGin Asn Cys Glu ProAsp Leu Met Pro Tyr285290295300Ala Arg Pro Phe AlaVal Gly Lys Arg ThrCys Ser Gly lie ValThr Pro305310315317<210>SEQ ID NO 5<211>954<212>DNA
〈213〉南極假絲酵母脂肪酶B變體Asp223Gly基因的核苷酸序列 〈400>5CTACCTTCCG GTTCGGACCC TGCCTTTTCGCAGCCCAAGT CGGTGCTCGA TGCGGGTCTG60ACCTGCCAGG GTGCTTCGCC ATCCTCGGTCTCCAAACCCA TCCTTCTCGT CCCCGGAACC120GGCACCACAG GTCCACAGTC GTTCGACTCGAACTGGATTC CCCTCTCAAC GCAGTTGGGT180TACACACCCT GCTGGATCTC ACCCCCGCCGTTCATGCTCA ACGACACCCA GGTCAACACG240GAGTACATGG TCAACGCCAT CACCGCGCTCTACGCTGGTT CGGGCAACAA CAAACTTCCC、300GTGCTTACCT GGTCCCAGGG TGGTCTGGTTGCACAGTGGG GTCTGACCTT CTTCCCCAGT360ATCAGGTCCA AGGTCGATCG ACTTATGGCCTTTGCGCCCG ACTACAAGGG CACCGTCCTC420GCCGGCCCTC TCGATGCACT CGCGGTTAGTGCACCCTCCG TATGGCAGCA AACCACCGGT480TCGGCACTCA CCACCGCACT CCGAAACGCAGGTGGTCTGA CCCAGATCGT GCCCACCACC540AACCTCTACT CGGCGACCGA CGAGATCGTTCAGCCTCAGG TGTCCAACTC GCCACTCGAC600TCATCCTACC TCTTCAACGG AAAGAACGTCCAGGCACAGG CCGTGTGTGG GCCGCTGTTC660GTCATCGGTC ATGCAGGCTC GCTCACCTCGCAGTTCTCCT ACGTCGTCGG TCGATCCGCC720CTGCGCTCCA CCACGGGCCA GGCTCGTAGTGCAGACTATG GCATTACGGA CTGCAACCCT780CTTCCCGCCA ATGATCTGAC TCCCGAGCAAAAGGTCGCCG CGGCTGCGCT CCTGGCGCCG840GCAGCTGCAG CCATCGTGGC GGGTCCAAAGCAGAACTGCG AGCCCGACCT CATGCCCTAC900GCCCGCCCCT TTGCAGTAGG CAAAAGGACCTGCTCCGGCA TCGTCACCCC CTGA954<210>SEQ IDNO 6<211>954<212>DNA〈213〉南極假絲酵母脂肪酶B變體Leu278Met基因的核苷酸序列<400>6CTACCTTCCG GTTCGGACCC TGCCTTTTCGCAGCCCAAGT CGGTGCTCGA TGCGGGTCTG60ACCTGCCAGG GTGCTTCGCC ATCCTCGGTCTCCAAACCCA TCCTTCTCGT CCCCGGAACC120GGCACCACAG GTCCACAGTC GTTCGACTCGAACTGGATTC CCCTCTCAAC GCAGTTGGGT180TACACACCCT GCTGGATCTC ACCCCCGCCGTTCATGCTCA ACGACACCCA GGTCAACACG240GAGTACATGG TCAACGCCAT CACCGCGCTCTACGCTGGTT CGGGCAACAA CAAACTTCCC300GTGCTTACCT GGTCCCAGGG TGGTCTGGTTGCACAGTGGG GTCTGACCTT CTTCCCCAGT360ATCAGGTCCA AGGTCGATCG ACTTATGGCCTTTGCGCCCG ACTACAAGGG CACCGTCCTC420GCCGGCCCTC TCGATGCACT CGCGGTTAGTGCACCCTCCG TATGGCAGCA AACCACCGGT480TCGGCACTCA CCACCGCACT CCGAAACGCAGGTGGTCTGA CCCAGATCGT GCCCACCACC540AACCTCTACT CGGCGACCGA CGAGATCGTTCAGCCTCAGG TGTCCAACTC GCCACTCGAC600TCATCCTACC TCTTCAACGG AAAGAACGTCCAGGCACAGG CCGTGTGTGG GCCGCTGTTC660GTCATCGACC ATGCAGGCTC GCTCACCTCGCAGTTCTCCT ACGTCGTCGG TCGATCCGCC720CTGCGCTCCA CCACGGGCCA GGCTCGTAGTGCAGACTATG GCATTACGGA CTGCAACCCT780CTTCCCGCCA ATGATCTGAC TCCCGAGCAAAAGGTCGCCG CGGCTGCGCT CATGGCGCCG840GCAGCTGCAG CCATCGTGGC GGGTCCAAAGCAGAACTGCG AGCCCGACCT CATGCCCTAC900GCCCGCCCCT TTGCAGTAGG CAAAAGGACCTGCTCCGGCA TCGTCACCCC CTGA954<210>SEQ IDNO 7
<211>954<212>DNA〈213〉南極假絲酵母脂肪酶B變體Asp223Gly/eu278Met基因的核苷酸序列<400>7CTACCTTCCG GTTCGGACCC TGCCTTTTCGCAGCCCAAGT CGGTGCTCGA TGCGGGTCTG60ACCTGCCAGG GTGCTTCGCC ATCCTCGGTCTCCAAACCCA TCCTTCTCGT CCCCGGAACC120GGCACCACAG GTCCACAGTC GTTCGACTCGAACTGGATTC CCCTCTCAAC GCAGTTGGGT180TACACACCCT GCTGGATCTC ACCCCCGCCGTTCATGCTCA ACGACACCCA GGTCAACACG240GAGTACATGG TCAACGCCAT CACCGCGCTCTACGCTGGTT CGGGCAACAA CAAACTTCCC300GTGCTTACCT GGTCCCAGGG TGGTCTGGTTGCACAGTGGG GTCTGACCTT CTTCCCCAGT360ATCAGGTCCA AGGTCGATCG ACTTATGGCCTTTGCGCCCG ACTACAAGGG CACCGTCCTC420GCCGGCCCTC TCGATGCACT CGCGGTTAGTGCACCCTCCG TATGGCAGCA AACCACCGGT480TCGGCACTCA CCACCGCACT CCGAAACGCAGGTGGTCTGA CCCAGATCGT GCCCACCACC540AACCTCTACT CGGCGACCGA CGAGATCGTTCAGCCTCAGG TGTCCAACTC GCCACTCGAC600TCATCCTACC TCTTCAACGG AAAGAACGTCCAGGCACAGG CCGTGTGTGG GCCGCTGTTC660GTCATCGGGC ATGCAGGCTC GCTCACCTCGCAGTTCTCCT ACGTCGTCGG TCGATCCGCC720CTGCGCTCCA CCACGGGCCA GGCTCGTAGTGCAGACTATG GCATTACGGA CTGCAACCCT780CTTCCCGCCA ATGATCTGAC TCCCGAGCAAAAGGTCGCCG CGGCTGCGCT CATGGCGCCG840GCAGCTGCAG CCATCGTGGC GGGTCCAAAGCAGAACTGCG AGCCCGACCT CATGCCCTAC900 GCCCGCCCCT TTGCAGTAGG CAAAAGGACCTGCTCCGGCA TCGTCACCCC CTGA95權利要求
1.一種熱穩(wěn)定性提高的脂肪酶突變體，其特征在干由南極假絲酵母脂肪酶B基因出發(fā)，運用多輪定點飽和突變而獲得；所述南極假絲酵母脂肪酶B具有SEQ ID No :1所示的氨基酸殘基序列；所述脂肪酶突變體具有SEQ ID No :2、SEQ ID No :3或SEQ ID No :4所示的氨基酸殘基序列，SEQ ID No :2、SEQ ID No 3和SEQ ID No :4均由317個氨基酸組成。
2.根據(jù)權利要求I所述的熱穩(wěn)定性提高的脂肪酶突變體的構建方法，其特征在于包括以下步驟 A、南極假絲酵母脂肪酶B基因的克隆 對南極假絲酵母脂肪酶B基因通過上游引物和下游引物擴增目的基因； 上游引物5 ’ -AATACCATGGCTCTACCTTCCGGTTCG-3 ’，帶下劃線堿其為限制性內(nèi)切酶NcoI識別位點； 下游引物5 ’ -TAACTCGAGGGGGGTGACGATGCCGGA-3 ’，帶下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶XhoI識別位點； 以Takara的PrimeSTAR為聚合酶，在上游引物和下游引物的參與下進行PCR反應，得到PCR擴增產(chǎn)物；DpnI消化模板，回收，純化該目的片段，將其用限制性內(nèi)切酶NcoI和XhoI進行雙酶切后與經(jīng)同樣酶雙酶切的質(zhì)粒pET22b (Novagen)進行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞中，將轉(zhuǎn)化細胞涂布于含有100ug/ml氨芐的LB平板上篩選陽性克隆，得到重組質(zhì)粒，將該重組質(zhì)粒命名為pET22b-CALB ； B、南極假絲酵母脂肪酶B的結(jié)構分析及熱點確定 對南極假絲酵母脂肪酶B的晶體結(jié)構進行分析(ID :1TCA)，脂肪酶的催化三聯(lián)體為自N端起第104位的絲氨酸、第187位的天冬氨酸和第224位的組氨酸，選取催化絲氨酸周圍的氨基酸殘基進行B因子的分析，確定下列B因子較高的殘基作為飽和突變的熱點自N端起第278位亮氨酸，285位纈氨酸，277位亮氨酸，281位甘氨酸，223位天冬氨酸； C、南極假絲酵母脂肪酶B突變體庫的建立及突變體的篩選 Cl、根據(jù)熱點構建飽和突變體庫并導入宿主細胞 以重組質(zhì)粒pET22b-CALB作為模板，針對步驟B中確定的熱點，分別在與第278位亮氨酸、第285位纈氨酸、第277位亮氨酸、第281位甘氨酸和第223位天冬氨酸相對應的核苷酸處利用NNK代替原有密碼子，設計簡并引物，并進行全質(zhì)粒PCR反應，構建5個定點飽和突變PCR擴增產(chǎn)物，反應結(jié)束后，DpnI消化模板，回收，純化后的PCR產(chǎn)物直接電擊導入大腸桿菌Rosetta(DE3)中，將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌直接涂布于含有100ug/ml氨芐和含有2% (v/V)乳化好的三丁酸甘油脂的LB抗性平板上，在37°C下培養(yǎng)16-24小時，得到針對5個熱點的飽和突變體庫； C2、從飽和突變體庫中篩選熱穩(wěn)定性提高的突變體 將步驟C I中37°C培養(yǎng)后的LB抗性平板在4°C下放置I天，進行初步篩選，將產(chǎn)生透明圈的菌落，接種于含有100ug/ml氨節(jié)LB培養(yǎng)基的96孔板中，于37°C過夜培養(yǎng),得到分屬5個突變體庫的母板； 從培養(yǎng)好的母板中吸取20ul液體至新的含有100ug/ml氨芐LB培養(yǎng)基的96孔板中，37°C培養(yǎng)3h，4°C放置30min，再加入終濃度為ImM的IPTG，15°C培養(yǎng)24h ； 利用凍融破碎的方法裂解菌體，得到粗酶液；將所得到的粗酶液在49°C下孵育15min，再于冰上放置lOmin，室溫放置15min，測定每孔的殘余活力；將從5個突變體庫中篩選到的陽性突變體接入5ml小試管中，至0D600為0. 6-0. 8吋，加入IPTG至終濃度ImM，15°C誘導表達，超聲破碎后測定粗酶液的T5tl15,確定熱穩(wěn)定性最高的突變體，進行測序，至此，完成了第一輪篩選，得到兩個熱點的優(yōu)秀突變體，分別是D223G和 L278M ； 以L278M的基因作為模板，進行迭代飽和突變針對285位纈氨酸、277位亮氨酸、281位甘氨酸和223位天冬氨酸位點設計飽和突變庫，并參考上述步驟進行新ー輪的篩選； 經(jīng)過多輪的迭代飽和突變，獲得了三株熱穩(wěn)定性明顯提高的菌株，測定脂肪酶核苷酸序列得出三株突變體分別為Asp223Gly、Leu278Met 和 Asp223Gly/Leu278Met。
3.如權利要求2所述的熱穩(wěn)定性提高的脂肪酶突變體的構建方法，其特征在于步驟A中所述的PCR反應的反應條件為98°C 2min ;然后98°C 10sec，55°C 15sec，72°C lmin，共25個循環(huán)；最后72°C IOmin0
4.如權利要求I所述的熱穩(wěn)定性提高的脂肪酶突變體，其特征在于步驟Cl中所述的該PCR反應使用TaKaRa公司的PrimeSTAR DNA聚合酶，PCR反應條件為98°C 2min ;然后980C IOsec, 55°C 15sec，72で 7min，共 25 個循環(huán)；最后 72で IOmin0
5.根據(jù)權利要求I所述的熱穩(wěn)定性提高的脂肪酶突變體的基因，其特征在于所述的熱穩(wěn)定性提高的脂肪酶突變體的基因的核苷酸序列如SEQ ID No 5, SEQ ID No :6或SEQID No 7 所示。
6.根據(jù)權利要求I所述的熱穩(wěn)定性提高的脂肪酶突變體的應用，其特征在于所述的熱穩(wěn)定性提高的脂肪酶突變體應用于洗滌劑、添加剤、食品、制藥、造紙、或生物能源エ業(yè)生產(chǎn)中。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種熱穩(wěn)定性提高的脂肪酶突變體及其構建方法。熱穩(wěn)定性提高的脂肪酶突變體由南極假絲酵母脂肪酶B基因出發(fā)，運用多輪定點飽和突變而獲得；所述南極假絲酵母脂肪酶B具有SEQ ID No1所示的氨基酸殘基序列；所述脂肪酶突變體具有SEQ ID No2、SEQ ID No3或SEQ ID No4所示的氨基酸殘基序列，SEQ ID No2、SEQ ID No3和SEQ ID No4均由317個氨基酸組成。本發(fā)明運用半理性設計的方法，對南極假絲酵母脂肪酶B基因進行多輪定點飽和突變，獲取脂肪酶突變體，這些突變體包含氨基酸突變D223G、L278M及它們的組合。以各自的T5015及48℃的半衰期t1/2來表示，脂肪酶突變體的熱穩(wěn)定性得到了提高。具有較高的實際應用價值和廣闊的市場前景。
文檔編號C12N15/63GK102660517SQ20111040692
公開日2012年9月12日 申請日期2011年12月8日 優(yōu)先權日2011年12月8日
發(fā)明者馮雁, 楊廣宇, 謝淵 申請人:上海交通大學