專利名稱：含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于工業(yè)微生物領(lǐng)域，涉及含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌在提高2-酮基-L-古龍酸混菌發(fā)酵性能中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
氧化葡糖桿菌和巨大芽孢桿菌混菌發(fā)酵體系廣泛用于維生素C的工業(yè)生產(chǎn)中，用于將L-山梨糖轉(zhuǎn)化為維生素C的前體2-酮基-L-古龍酸。但該兩菌體系中，只有氧化葡糖桿菌能夠完成糖酸轉(zhuǎn)化，但其單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)生長及其緩慢，產(chǎn)酸效率很低；而巨大芽孢桿菌作為促進(jìn)氧化葡糖桿菌生長的伴生菌可以提高氧化葡糖桿菌的生長速率和產(chǎn)酸效率。因此提高氧化葡糖桿菌自身的糖酸轉(zhuǎn)化能力是提高混菌發(fā)酵生產(chǎn)效率的關(guān)鍵。分子生物學(xué)操作和代謝工程手段加快了菌株人工進(jìn)化、能夠快速提高菌株特性， 可以基于基因信息有目的地高效改造菌株。專利CN1621518和專利CN1515669獲得了氧化葡糖桿菌進(jìn)行糖酸轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶——山梨酮脫氫酶的核酸序列?；谠撔畔⒖梢詫?duì)氧化葡糖桿菌進(jìn)行分子水平改造，進(jìn)而提高其與巨大芽孢桿菌混合發(fā)酵時(shí)的2-酮基-L-古龍酸混菌發(fā)酵性能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過代謝工程的手段來改造氧化葡糖桿菌，增加其山梨酮脫氫酶基因的拷貝數(shù)，提高氧化葡糖桿菌與巨大芽孢桿菌混菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化L-山梨糖為2-酮基-L-古龍酸的性能，提供一種含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌的用途。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌的用途，是將含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌和巨大芽孢桿菌接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，獲得2-酮基-L-古龍酸。所述含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌的構(gòu)建為(1)山梨酮脫氫酶基因的體外擴(kuò)增采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取氧化葡糖桿菌基因組為模板；以SEQ ID No. 1所示序列為上游引物，以SEQ ID No. 2所示序列為下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收如SEQ ID No. 3所示的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；(2)編碼山梨酮脫氫酶基因載體的構(gòu)建取步驟(1)獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用HindIII酶和BamHI酶雙酶切；取載體pBBRl 用KpnI酶和HindIII酶雙酶切；連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α中，獲得編碼山梨酮脫氫酶基因載體；(3)氧化葡糖桿菌的轉(zhuǎn)化取步驟( 所得編碼山梨酮脫氫酶基因載體在1800V條件下電擊轉(zhuǎn)化入氧化葡糖桿菌，獲得含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌。將含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌和巨大芽孢桿菌接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，使含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌的密度為4X108cfu/ml，使巨大芽孢桿菌的密度為4X 108Cfu/ml，培養(yǎng)條件為在30°C，250rpm條件下培養(yǎng)120h，獲得 2-酮基-L-古龍酸；所述發(fā)酵培養(yǎng)基為按比例稱取L-山梨糖80g，玉米漿20g，尿素12g，KH2PO4Ig, MgSO4O. 5g, CaCO3Ig,加水至 1L，調(diào) pH 為 7. 0，121°C滅菌 20min。實(shí)驗(yàn)證明含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌和巨大芽孢桿菌接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)發(fā)酵，可以使L-山梨糖生產(chǎn)2-酮基-L-古龍酸的糖酸轉(zhuǎn)化率提高。


圖1為含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌和巨大芽孢桿菌混菌發(fā)酵結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。下面的內(nèi)容及實(shí)施例是為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明，但并不用于限制本發(fā)明。本發(fā)明所使用的氧化葡糖桿菌(GluconcAacter oxydans)保藏編號(hào)為CGMCC No. 1. 110，巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)保藏編號(hào)為CGMCC No 1. 459，從中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所)購得。實(shí)施例1含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌的構(gòu)建(1)山梨酮脫氫酶基因的體外擴(kuò)增采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取氧化葡糖桿菌(GluconcAacter oxydans)保藏編號(hào)為CGMCC No. 1. 110基因組為模板，取該基因組溶液1 μ 1,5XFastPfu buffer 4 μ l,20mM 的dNTP2 μ 1，20nM的以SEQ ID No. 1所示序列為上游引物0. 4 μ 1，20ηΜ的以SEQ ID No. 2 所示序列為下游引物0.4 μ 1，無菌水11. 8 μ 1，F(xiàn)astPfu酶0.4 μ 1，在PCR管中混合均勻； 將PCR管放入PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增循環(huán)，擴(kuò)增程序?yàn)?5°C 2min ；95°C 20s, 55°C 35s，72°C 2min，共25個(gè)循環(huán)；72°C 5min ；4°C 30min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，將PCR產(chǎn)物條帶切下，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物如SEQ ID No. 3所示；(2)編碼山梨酮脫氫酶基因載體的構(gòu)建取步驟(1)獲得的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物溶液 8 μ 1，與 1μ 1 IOXdigest buffer,0. 5μ 1 HindIII酶，0. 5 μ 1 BamHI酶混合均勻，在37°C條件下進(jìn)行酶切反應(yīng)2小時(shí)；反應(yīng)后產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，將酶切產(chǎn)物條帶切下，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化酶切PCR產(chǎn)物。取載體 pBBRlMCS溶液 8μ 1，與 1 μ IlOXdigest buffer, 0. 5 μ 1 KpnI 酶，0. 5μ1 HindIII 酶混合均勻，在37°C條件下進(jìn)行酶切反應(yīng)2小時(shí)；反應(yīng)后產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，將酶切產(chǎn)物條帶切下，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化酶切載體產(chǎn)物。取酶切PCR產(chǎn)物5. 5 μ 1，酶切載體產(chǎn)物 3 μ 1，IOXligase buffer 1 μ 1, DNA ligase 0· 5 μ 1，混合均勻，在 22°C條件下進(jìn)行連接反應(yīng)30min。將連接產(chǎn)物用化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α中，涂布于含抗生素的 LB固體培養(yǎng)基上，在37°C條件下培養(yǎng)12h。培養(yǎng)后獲得的單菌落在LB液體培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)12h，用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒，獲得編碼山梨酮脫氫酶基因載體；(3)編碼山梨酮脫氫酶基因載體轉(zhuǎn)化入氧化葡糖桿菌將氧化葡糖桿菌涂布在固體培養(yǎng)基上，在30°C條件下培養(yǎng)48小時(shí)；用2ml無菌水將菌體洗下，冰浴lOmin，4°C，4000rpm離心5min后收集細(xì)胞，用預(yù)冷的無菌水洗一次，10% 甘油洗兩次后，100 μ 1 10%甘油重懸細(xì)胞；與步驟( 所得編碼山梨酮脫氫酶基因載體的水溶液10 μ 1混合均勻置于電轉(zhuǎn)杯中，冰浴5min，將電轉(zhuǎn)杯置于電轉(zhuǎn)儀中1800V電擊；電擊產(chǎn)物與900 μ 1種子培養(yǎng)基混合均勻，在30°C，140rpm條件下培養(yǎng)2小時(shí)，將培養(yǎng)物涂布于固體培養(yǎng)基上，在30°C條件下培養(yǎng)4天，獲得的單菌落轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基中，在30°C，250rpm 條件下培養(yǎng)，獲得含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌；所述固體培養(yǎng)基為L_山梨糖20g，玉米漿3g，牛肉膏3g，酵母浸粉3g，尿素lg，蛋白胨 IOg,瓊脂 20g, KH2PO4Ig,MgSO4O. 2g，CaCO3Ig,加水至 1L，調(diào) pH 為 6. 8，121°C滅菌 20min。所述種子培養(yǎng)基為L_山梨糖20g，玉米漿3g，牛肉膏3g，酵母浸粉3g，尿素lg，蛋白胨 IOg, KH2PO4Ig, MgSO4O. 2g，CaCO3Ig,加水至 1L，調(diào) pH 為 6. 8，121°C滅菌 20min。實(shí)施例2混菌發(fā)酵將實(shí)施例1獲得的含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌和巨大芽孢桿菌接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，使含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌的密度為 4X 108cfu/ml，使巨大芽孢桿菌的密度為4X 108cfu/ml，發(fā)酵條件為在30°C，250rpm下培養(yǎng)120h，獲得2-酮基-L-古龍酸。所述發(fā)酵培養(yǎng)基為按比例稱取L-山梨糖80g，玉米漿20g，尿素12g，KH2PO4Ig, MgSO4O. 5g, CaCO3Ig,加水至 1L，調(diào) pH 為 7. 0，121°C滅菌 20min。實(shí)施例32-酮基-L-古龍酸和L-山梨糖含量測定采用高效液相色譜法(HPLC)。樣品制備取發(fā)酵培養(yǎng)不同時(shí)間的發(fā)酵液ImL于1. 5mL離心管中，lOOOOr/min轉(zhuǎn)速離心3min，取上清100 μ L于1. 5mL離心管中，并加入900 μ L流動(dòng)相(5mM H2SO4)得到稀釋十倍的樣品。振蕩混勻后，用0. 22μπι的纖維素微孔濾膜過濾樣品，得到待測樣品。高效液相色譜條件色譜柱bio-rad HPX-87H，流動(dòng)相5mM H2SO4,流速0. 6mL/ min,柱溫65°C，示差檢測器。檢測結(jié)果見圖1。圖例O 原始氧化葡糖桿菌和巨大芽孢桿菌混菌發(fā)酵；Δ 含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌和巨大芽孢桿菌混菌發(fā)酵。原始氧化葡糖桿菌與巨大芽孢桿菌利用實(shí)施例2的發(fā)酵條件進(jìn)行搭配混菌發(fā)酵的2-酮基-L-古龍酸產(chǎn)率達(dá)到87%;用實(shí)施例1的方法獲得的含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌和巨大芽孢桿菌混菌發(fā)酵的2-酮基-L-古龍酸產(chǎn)率達(dá)到98% ；2-酮基-L-古龍酸產(chǎn)率提高了 12.6%。實(shí)驗(yàn)證明含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌和巨大芽孢桿菌接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)發(fā)酵，可以使L-山梨糖生產(chǎn)2-酮基-L-古龍酸的糖酸轉(zhuǎn)化率提高。
權(quán)利要求
1.含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌的用途，其特征是將含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌和巨大芽孢桿菌接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，獲得2-酮基-L-古龍酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征是所述含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌的構(gòu)建為(1)山梨酮脫氫酶基因的體外擴(kuò)增采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取氧化葡糖桿菌基因組為模板；以SEQ ID No. 1所示序列為上游引物，以SEQ ID No. 2所示序列為下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收如SEQ ID No. 3 所示的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；(2)編碼山梨酮脫氫酶基因載體的構(gòu)建取步驟(1)獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用HindIII酶和BamHI酶雙酶切；取載體pBBRl用KpnI 酶和HindIII酶雙酶切；連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α中，獲得編碼山梨酮脫氫酶基因載體； (3)氧化葡糖桿菌的轉(zhuǎn)化取步驟( 所得編碼山梨酮脫氫酶基因載體在1800V條件下電擊轉(zhuǎn)化入氧化葡糖桿菌，獲得含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征是將含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌和巨大芽孢桿菌接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，使含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌的密度為4X108cfu/ml，使巨大芽孢桿菌的密度為4X 108CfU/ml，培養(yǎng)條件為在 300C，250rpm條件下培養(yǎng)120h，獲得2-酮基-L-古龍酸；所述發(fā)酵培養(yǎng)基為按比例稱取L-山梨糖80g，玉米漿20g，尿素12g，KH2PO4Ig, MgSO4O. 5g, CaCO3Ig,加水至 1L，調(diào) pH 為 7. 0，121°C滅菌 20min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌的用途，是將含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌和巨大芽孢桿菌接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，獲得2-酮基-L-古龍酸。實(shí)驗(yàn)證明含有編碼山梨酮脫氫酶基因載體的氧化葡糖桿菌和巨大芽孢桿菌接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)發(fā)酵，可以使L-山梨糖生產(chǎn)2-酮基-L-古龍酸的糖酸轉(zhuǎn)化率提高。
文檔編號(hào)C12P7/60GK102492762SQ201110407078
公開日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2011年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月9日
發(fā)明者元英進(jìn), 杜瑾 申請(qǐng)人:天津大學(xué)