專利名稱：一種模擬體內(nèi)環(huán)境誘導(dǎo)脂肪基質(zhì)細胞為神經(jīng)干細胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制品技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種模擬體內(nèi)環(huán)境誘導(dǎo)脂肪基質(zhì)細胞為神經(jīng)干細胞的方法。
背景技術(shù)：
近年來，神經(jīng)干細胞作為移植治療神經(jīng)退行性疾病的種子細胞，在基礎(chǔ)研究與臨床試驗中引起了眾多學(xué)者的關(guān)注。神經(jīng)干細胞的誘導(dǎo)一直是神經(jīng)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中一個難點。主要原因在于誘導(dǎo)環(huán)境中因子種類選擇、因子濃度的確定以及神經(jīng)干細胞狀態(tài)長期維持； 使用外來因子誘導(dǎo)而成的神經(jīng)干細胞移植治療的爭論。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種模擬體內(nèi)環(huán)境誘導(dǎo)脂肪基質(zhì)細胞為神經(jīng)干細胞的方法，該方法采用鼠類腦組織不同的部位如海馬、大腦皮層和小腦部位等外環(huán)境所含可溶性物質(zhì)作為生理誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)鼠類皮下組織中的脂肪基質(zhì)細胞為神經(jīng)干細胞從而實現(xiàn)在生理條件下促使和加速種子細胞的形成。本發(fā)明的上述目的是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一種模擬體內(nèi)環(huán)境誘導(dǎo)脂肪基質(zhì)細胞為神經(jīng)干細胞的方法，含以下步驟(1)選取離體鼠類腦組織中的海馬、大腦皮層或小腦部位，置于DMEM F12培養(yǎng)基中，經(jīng)搖床震蕩和離心處理后，取上清液，過濾后滅菌獲得鼠類腦組織中的海馬、大腦皮層或小腦可溶性物質(zhì)，保存?zhèn)溆茫?2)選取離體鼠類皮下脂肪組織，采用I型膠原酶消化后，使用胎牛血清或新牛血清終止消化，過濾，取濾液，離心后棄去上清液，在下層物質(zhì)中加入培養(yǎng)基重懸細胞，接種， 在培養(yǎng)基和體積百分含量為10%的胎牛血清或新牛血清中培養(yǎng)后，細胞擴增至第二代，經(jīng)流式鑒定確認為脂肪基質(zhì)細胞；(3)取步驟O)中獲得的脂肪基質(zhì)細胞進行預(yù)處理后獲得的重懸后脂肪基質(zhì)細胞，取出重懸后脂肪基質(zhì)細胞，加入培養(yǎng)基和步驟(1)中制備的鼠類腦組織中海馬、大腦皮層或小腦可溶性物質(zhì)，將細胞懸液培養(yǎng)后，通過鼠類腦組織中的海馬、大腦皮層或小腦可溶性物質(zhì)誘導(dǎo)脂肪基質(zhì)細胞成神經(jīng)干細胞。在上述步驟中步驟(1)中搖床震蕩時的溫度為4°C，震蕩時間為1_池。步驟(1)中離心時的溫度為4°C，離心機的轉(zhuǎn)速為18000Xg，離心時間為 20-40min。步驟(2)中I型膠原酶的體積百分含量為0. 5-1. 5%，消化時間為20-40min ；所述培養(yǎng)基為 DMEM、DMEM/高糖、DMEM/低糖或 DMEM F12，其中 DMEM 為 Dulbecco ‘ sModified Eagle Medium培養(yǎng)基的縮寫，下同。步驟(2)中離心時的轉(zhuǎn)速為1000-1200r/min，離心時間為l-10min。
步驟(3)中所述培養(yǎng)基為DMEM、DMEM/高糖、DMEM/低糖、DMEM F12或神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基，關(guān)于神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基，可參閱本申請人早期的申請?zhí)枮?2134314. 4的專利。步驟(3)中脂肪基質(zhì)細胞進行預(yù)處理的具體過程為取步驟O)中培養(yǎng)的脂肪基質(zhì)細胞，經(jīng)胰酶消化后，收集細胞，離心，棄去上清液，下層物質(zhì)采用培養(yǎng)基重懸細胞，得重懸后脂肪基質(zhì)細胞，其中所述胰酶的體積百分含量為0. 125-0. 25%。步驟(3)中獲得的重懸后脂肪基質(zhì)細胞的濃度為1. 0-3. OX IO6個細胞/mL。步驟(3)中重懸后脂肪基質(zhì)細胞與培養(yǎng)基的體積比為1 1-4，重懸后脂肪基質(zhì)細胞與步驟(1)中制備的鼠類腦組織中的海馬、大腦皮層或小腦可溶性物質(zhì)的體積比為 1 1-4。步驟(3)中將細胞懸液培養(yǎng)時的條件為在37°C，體積百分含量為5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點本發(fā)明中的方法與目前使用的其他因子誘導(dǎo)方法相比，本發(fā)明方法為神經(jīng)干細胞的誘導(dǎo)提供了一個生理環(huán)境，避免了當(dāng)前一些“誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞所成球為腫瘤化”的觀點；而且比起目前常用方法，大大的縮短了誘導(dǎo)為神經(jīng)干細胞的時間。


圖1是實施例1-3中采用的離體鼠類腦組織；圖2是是實施例1-3中采用的離體鼠類腦組織中的海馬、大腦皮層和小腦部位；圖3是是實施例1-3中獲得的離體鼠類腦組織中的海馬、大腦皮層和小腦三個部位的可溶性物質(zhì)；圖4是是實施例1-3中采用的離體鼠類脂肪基質(zhì)細胞第2天倒置相差顯微鏡觀察 200 X圖示；圖5是是實施例1-3中采用的離體鼠類脂肪基質(zhì)細胞第2天倒置相差顯微鏡觀察 400 X圖示；圖6是是實施例1-3中離體鼠類脂肪基質(zhì)細胞流式鑒定中的陰性對照；圖7是是實施例1-3中離體鼠類脂肪基質(zhì)細胞流式鑒定結(jié)果CD^為陽性；圖8是是實施例1-3中離體鼠類脂肪基質(zhì)細胞流式鑒定結(jié)果CD44為陽性；圖9是是實施例1-3中離體鼠類脂肪基質(zhì)細胞流式鑒定結(jié)果CD90為陽性；圖10是實施例1中脂肪基質(zhì)細胞于含海馬可溶性物質(zhì)的DMEM F12培養(yǎng)基中誘導(dǎo) Id倒置相差顯微鏡觀察，100X ；圖11是實施例1中脂肪基質(zhì)細胞于含海馬可溶性物質(zhì)的DMEM F12培養(yǎng)基中誘導(dǎo) Id倒置相差顯微鏡觀察，200 X ；圖12是實施例2中脂肪基質(zhì)細胞于含大腦皮層可溶性物質(zhì)的DMEM F12培養(yǎng)基中誘導(dǎo)Id倒置相差顯微鏡觀察，100X ；圖13是實施例2中脂肪基質(zhì)細胞于含大腦皮層可溶性物質(zhì)的DMEM F12培養(yǎng)基中誘導(dǎo)Id倒置相差顯微鏡觀察，200 X ；圖14是實施例3中脂肪基質(zhì)細胞于含小腦可溶性物質(zhì)的DMEM F12培養(yǎng)基中誘導(dǎo) Id倒置相差顯微鏡觀察，100X ；
圖15是實施例3中脂肪基質(zhì)細胞于含小腦可溶性物質(zhì)的DMEM F12培養(yǎng)基中誘導(dǎo) Id倒置相差顯微鏡觀察，200 X ；圖16是實施例1-3中P2脂肪基質(zhì)細胞于20ng/mLEGF、bFGF和B-27中誘導(dǎo)5d倒置相差顯微鏡觀察，100X (對照)，其中P2是細胞第二代(passage 2)的簡寫；圖17是實施例1-3中P2脂肪基質(zhì)細胞于20ng/mLEGF、bFGF和B-27中誘導(dǎo)5d倒置相差顯微鏡觀察200 X (對照)；圖18是實施例1中P2脂肪基質(zhì)細胞于含海馬因子中誘導(dǎo)Id nestin表達免疫熒光鑒定陽性，200 X ；圖19是實施例1中中P2脂肪基質(zhì)細胞于含海馬因子中誘導(dǎo)Id DAPI染核，200X ；圖20是實施例2中P2脂肪基質(zhì)細胞于含大腦皮層因子中誘導(dǎo)Id nestin表達免疫熒光鑒定陽性，200 X ；圖21是實施例2中P2脂肪基質(zhì)細胞于含大腦皮層因子中誘導(dǎo)Id DAPI染核， 200 X ；圖22是實施例3中P2脂肪基質(zhì)細胞于含小腦因子中誘導(dǎo)Id nestin表達免疫熒光鑒定陽性，200 X ；圖23是實施例3中P2脂肪基質(zhì)細胞于含小腦因子中誘導(dǎo)Id DAPI染核，200 X ；圖M是實施例1-3中P2脂肪基質(zhì)細胞誘導(dǎo)Id nestin表達免疫熒光鑒定陰性對照，200 X ；圖25是實施例1-3中P2脂肪基質(zhì)細胞誘導(dǎo)Id DAPI染核陰性對照，200 X ；圖沈是實施例1中P2脂肪基質(zhì)細胞于含海馬因子中誘導(dǎo)Id⑶133表達免疫熒光鑒定陽性，200 X ；圖27是實施例1中P2脂肪基質(zhì)細胞于含海馬因子中誘導(dǎo)Id DAPI染核，200 X ；圖28是實施例2中P2脂肪基質(zhì)細胞于含大腦皮層因子中誘導(dǎo)Id⑶133表達免疫熒光鑒定陽性，200 X ；圖四是實施例2中P2脂肪基質(zhì)細胞于含大腦皮層因子中誘導(dǎo)Id DAPI染核， 200 X ；圖30是實施例3中P2脂肪基質(zhì)細胞于含小腦因子中誘導(dǎo)Id⑶133表達免疫熒光鑒定陽性，200 X ；圖31是實施例3中P2脂肪基質(zhì)細胞于含小腦因子中誘導(dǎo)Id DAPI染核，200 X ；圖32是實施例1-3中P2脂肪基質(zhì)細胞誘導(dǎo)Id⑶133表達免疫熒光鑒定陰性對照，200 X ；圖33是實施例1-3中P2脂肪基質(zhì)細胞誘導(dǎo)Id DAPI染核陰性對照，200X ；圖34是實施例1中P2脂肪基質(zhì)細胞于含海馬因子中誘導(dǎo)Id nestin表達共聚焦顯微鏡鑒定陽性，800X ；圖35是實施例1中P2脂肪基質(zhì)細胞于含海馬因子中誘導(dǎo)Id DAPI染核，800X ；圖36是實施例2中P2脂肪基質(zhì)細胞于含大腦皮層因子中誘導(dǎo)Id nestin表達共聚焦顯微鏡鑒定陽性，800X ；圖37是實施例2中P2脂肪基質(zhì)細胞于含大腦皮層因子中誘導(dǎo)Id DAPI染核， 800 X ；
圖38是實施例3中P2脂肪基質(zhì)細胞于含小腦因子中誘導(dǎo)Id nestin表達共聚焦顯微鏡鑒定陽性，800X ；圖39是實施例3中P2脂肪基質(zhì)細胞于含小腦因子中誘導(dǎo)Id DAPI染核，800X ；圖40是實施例1-3中P2脂肪基質(zhì)細胞誘導(dǎo)Id nestin表達共聚焦顯微鏡鑒定陰性對照，800 X ；圖41是實施例1-3中P2脂肪基質(zhì)細胞誘導(dǎo)Id DAPI染核陰性對照，800X ；圖42是實施例1-3中P2脂肪基質(zhì)細胞于含海馬因子中誘導(dǎo)Id⑶133表達共聚焦顯微鏡鑒定陽性，800X ；圖43是實施例1中P2脂肪基質(zhì)細胞于含海馬因子中誘導(dǎo)Id DAPI染核，800X ；圖44是實施例2中P2脂肪基質(zhì)細胞于含大腦皮層因子中誘導(dǎo)Id⑶133表達共聚焦顯微鏡鑒定陽性，800X ；圖45是實施例2中P2脂肪基質(zhì)細胞于含大腦皮層因子中誘導(dǎo)Id DAPI染核， 800 X ；圖46是實施例3中P2脂肪基質(zhì)細胞于含小腦因子中誘導(dǎo)Id⑶133表達共聚焦顯微鏡鑒定陽性，800X ；圖47是實施例3中P2脂肪基質(zhì)細胞于含小腦因子中誘導(dǎo)Id DAPI染核，800X ；圖48是實施例1-3中P2脂肪基質(zhì)細胞誘導(dǎo)Id⑶133表達共聚焦顯微鏡鑒定陰性對照，800 X ；圖49是實施例1-3中P2脂肪基質(zhì)細胞誘導(dǎo)Id DAPI染核陰性對照，800X ；圖50是實施例1-3中采用western blot法檢測脂肪基質(zhì)細胞nestin蛋白表達情況和P2脂肪基質(zhì)細胞于含海馬、大腦皮層和小腦因子中誘導(dǎo)Idnestin蛋白表達情況，其中1條帶為P2脂肪基質(zhì)細胞nestin蛋白表達情況，2,3,4條帶分別為P2脂肪基質(zhì)細胞于含海馬、腦皮層和小腦因子中誘導(dǎo)Id nestin蛋白表達情況；圖51是實施例1-3中采用western blot法檢測脂肪基質(zhì)細胞CD133蛋白表達情況和P2脂肪基質(zhì)細胞于含海馬、大腦皮層和小腦因子中誘導(dǎo)Id CD133蛋白表達情況，其中 1條帶為P2脂肪基質(zhì)細胞CD133蛋白表達情況，2,3,4條帶分別為P2脂肪基質(zhì)細胞于含海馬、腦皮層和小腦因子中誘導(dǎo)Id CD133蛋白表達情況；圖52是實施例1-3中1、2、3、4條帶為內(nèi)參GAPDH表達情況，western blot法檢測。
具體實施例方式實施例1(一 )大鼠海馬可溶性物質(zhì)的提取步驟(1)將離體鼠類腦組織中的海馬部位，置于裝有2mL冷的DMEM F12培養(yǎng)基的離心管中，如圖1、2和3中所示；其中DMEM F12購自hyclone公司，下同；(2)將裝有海馬部位的離心管置于4°C的搖床震蕩2小時；(3)在4°C下高速離心30分鐘，離心機轉(zhuǎn)速為18000Xg(rcf)；(4)取離心管上清液，過濾滅菌(圖3)，分裝，做好標(biāo)記，-80°C超低溫保存，備用。( 二)脂肪間基質(zhì)細胞的取材、培養(yǎng)
(1)將鼠類離體脂肪組織少許置于體積百分含量為的2mL I型膠原酶消化30 分鐘；(2)使用胎牛血清或新牛血清終止消化，400目濾網(wǎng)過濾，取濾液，lOOOr/min離心 5分鐘；(3)棄離心后上清液，加入DMEM F12培養(yǎng)基2mL重懸細胞，接種到培養(yǎng)瓶里，以 DMEM F12+體積百分含量為10%的胎牛血清為培養(yǎng)基，此處DMEM F12培養(yǎng)基還可以采用 DMEM、DMEM/高糖、DMEM/低糖、DMEM F12或神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基等替代，在37°C、體積百分含量為5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(4)細胞擴增至第二代(圖4、5)，采用顯微鏡，在200X和400X下可以發(fā)現(xiàn)細胞呈梭形生長，進行流式鑒定和誘導(dǎo)。(三)脂肪間基質(zhì)細胞的流式鑒定(1)采用體積百分含量為0. 25%的胰酶消化2瓶長滿的脂肪基質(zhì)細胞，PBS清洗3 次；(2)分別使用IOOyL PBS將細胞重懸成4管(1管為陰性對照)，其余3管一次加入流式抗體⑶四，⑶44和⑶90，室溫孵育5分鐘；(3)將細胞收集后，重懸，加入抗體，即可上機，流式細胞儀檢測結(jié)果如圖6、7、8和 9中所示，使用流式細胞儀對細胞表面⑶29，⑶44和⑶90表達的鑒定呈陽性，說明分離獲得的是脂肪基質(zhì)細胞；(四)使用大鼠海馬可溶性物質(zhì)誘導(dǎo)脂肪基質(zhì)細胞成神經(jīng)干細胞(1)取5瓶長滿的脂肪基質(zhì)細胞，使用體積百分含量為0. 25%胰酶消化，收集細胞，1000r/min離心5分鐘；(2)棄上清液，使用3mLDMEM F12培養(yǎng)基重懸細胞，取ImL細胞懸液(約為1. OX IO6 個細胞)，獲得脂肪基質(zhì)細胞，加入3mLDMEM F12培養(yǎng)基和ImL大鼠海馬可溶性物質(zhì)；(3)將離心管中5mL細胞懸液接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，在37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中培
養(yǎng) ；(4)觀察并拍照(圖10-17)，從圖10-11、16-17中的P2脂肪基質(zhì)細胞于含海馬可溶性物質(zhì)中誘導(dǎo)Id倒置相差顯微鏡觀察100X、200X可以看出細胞生長呈球形，即通過鼠類腦組織中的海馬可溶性物質(zhì)誘導(dǎo)脂肪細胞基質(zhì)獲得了神經(jīng)干細胞(即神經(jīng)球)，同時將P2 脂肪基質(zhì)細胞于20ng/mLEGF、bFGF和B-27中誘導(dǎo)5d倒置相差顯微鏡觀察，在其IOOX (對照)和200X(對照)可以看出該細胞生長呈球形，也獲得了神經(jīng)干細胞。(五)神經(jīng)干細胞鑒定由于nestin蛋白和⑶133蛋白均為神經(jīng)干細胞高親和表達蛋白，實驗中常用此蛋白來鑒定神經(jīng)干細胞。本實驗通過免疫熒光(圖18-19、26-27、24-25)、激光共聚焦(圖 34-35,42-43,40-41)、western blot 來鑒定 nestin 蛋白和 CD133 蛋白的表達(圖 50-52)。 使用以上3種方法來對神經(jīng)干細胞的鑒定。其中免疫熒光包括如下步驟(1)收集神經(jīng)干細胞于離心管中，用磷酸緩沖液(PBS)清洗2遍；O)4%多聚甲醛固定20分鐘，PBS清洗3次；(3) 1 % Triton 破膜 10 分鐘；
G) PBS 清洗3次；(5)山羊封閉血清37度封閉30分鐘；(6) —抗(抗-nestin和抗-CD133抗體，稀釋比例為1 200)孵育，過夜后，37°C 復(fù)溫1小吋；(7) PBS 清洗3次;(8) ニ抗(羊抗兔，稀釋比例為1 200) 37 °C孵育1小吋；(9) PBS 清洗3次;(10)加入DAPI，涂片于熒光顯微鏡觀察，拍照。其中激光共聚焦顯微鏡觀察簡要步驟(1)收集神經(jīng)干細胞于離心管中，用磷酸緩沖液(PBS)清洗2遍；O) 4%多聚甲醛固定20分鐘，PBS清洗3次；(3) 1 % Triton 破膜 10 分鐘；(4) PBS 清洗3次;(5)山羊封閉血清37度封閉30分鐘；(6) —抗(抗-nestin和抗-CD133抗體，稀釋比例為1 200)孵育，過夜后，37°C 復(fù)溫1小吋；(7) PBS 清洗3次;(8) ニ抗(羊抗兔，稀釋比例為1 200)37°C孵育1小時；(9) PBS 清洗3次;(10)加入DAPI，涂片于激光共聚焦顯微鏡觀察，拍照。其中Western blot包括以下步驟(1)分離膠和積層膠，制膠板；(2)蛋白變性準備蛋白樣本(收集到的神經(jīng)干細胞的蛋白，其中含有nestin蛋白和⑶133蛋白)，加入等體積的2 X上樣Buffer稀釋，置于沸水中煮IOmin (預(yù)染marker 煮 5min)；(3)加樣每孔加入20 40 μ L樣品(4)電泳置于電泳槽中電泳45min，恒定電流90mA O塊板)，如為1塊板則電流為 50mA ；(5)取出膠板，用切割刀修好膠；(6)將膠置于轉(zhuǎn)膜液中浸泡；(7)按順序放好下列物質(zhì)黑面ヰ海綿ヰ濾紙ヰ膠ヰNC膜ヰ濾紙(用吸管趕去氣泡)一海綿；(8)置于轉(zhuǎn)膜槽中于，黑面對黑面，加上冰塊，加入轉(zhuǎn)膜液；(9)裝好電極，于恒定電壓100V下，90min ；(10)麗春紅染膜；(11)用TBST洗去麗春紅；(12)封閉加入5%脫脂奶粉+TBST，常溫搖床搖Ih ；(13)回收封閉液，加入ー抗(抗-nestin抗體和抗-CD133抗體，用5% BSA+TBS 稀釋，稀釋倍數(shù)為1 200)；
(14)置于4°C搖床搖過夜；(15)回收ー抗，TBST 洗膜，lOmin，共 3次；(16)加入ニ抗(ニ抗為辣根過氧化酶羊抗兔，用5%脫脂奶粉+TBS稀釋，稀釋倍數(shù)為1 1000)，常溫搖床搖Ih;(17)回收ニ抗，TBST 洗膜，lOmin，共 3次；(18)將膜置于發(fā)光液中浸泡約Imin ；(19)將膜鋪于曝光盒中，于暗室中曝光，洗膠片。目前普遍認為nestin蛋白和⑶133是神經(jīng)干細胞高親和表達的蛋白，免疫熒光和激光共聚焦顯微鏡是利用抗原抗體結(jié)合的原理來鑒定的，western blot方法是先將神經(jīng)干細胞里nestin蛋白和CD133蛋白提取出來，然后電泳，利用抗原抗體特異結(jié)合的原理來檢測。Western blot中的條帶就是蛋白質(zhì)顯示出來的。免疫熒光來鑒定nestin蛋白和⑶133蛋白的表達見圖18、19、沈和27，圖片中的結(jié)果表明，通過鼠類腦組織中的海馬可溶性物質(zhì)誘導(dǎo)脂肪細胞基質(zhì)獲得了神經(jīng)干細胞(即神經(jīng)球)。激光共聚焦來鑒定nestin蛋白和⑶133蛋白的表達，如圖34、35、42和43的結(jié)果表明，通過鼠類腦組織中的海馬可溶性物質(zhì)誘導(dǎo)脂肪細胞基質(zhì)獲得了神經(jīng)干細胞(即神經(jīng)球)。Western blot來鑒定nestin蛋白和CD133蛋白的表達，如圖50-52所示，圖片中的結(jié)果表明，通過鼠類腦組織中的海馬可溶性物質(zhì)誘導(dǎo)脂肪細胞基質(zhì)獲得了神經(jīng)干細胞 (即神經(jīng)球)，其中nestin蛋白有3個亞型，有3個分子量，Nestin蛋白的分子量依次是 110、177 和 270KD，CD133 的分子量是 120KD。實施例2(一 )大鼠大腦皮層可溶性物質(zhì)的提取步驟(1)將離體鼠類腦組織中的大腦皮層部位，置于裝有2mL冷的DMEM F12培養(yǎng)基的離心管中，如圖1、2和3中所示；(2)將裝有大腦皮層部位離心管置于4°C的搖床震蕩2小時；(3)在4°C下高速離心20分鐘，離心機轉(zhuǎn)速為18000Xg(rcf)；(4)取離心管上清液，分別過濾滅菌(圖3)，井分裝，做好標(biāo)記，-80°C超低溫保存，( ニ )脂肪間基質(zhì)細胞的取材、培養(yǎng)(1)將鼠類離體脂肪組織少許置于體積百分含量為的2mL I型膠原酶消化30 分鐘；(2)使用胎牛血清終止消化，400目濾網(wǎng)過濾，取濾液，1000r/min離心5分鐘；(3)棄離心后上清液，加入DMEM F12培養(yǎng)基2mL重懸細胞，接種到培養(yǎng)瓶里，以 DMEM F12+體積百分含量為10%的胎牛血清為培養(yǎng)基，在37°C、體積百分含量為5% CO2培
養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(4)細胞擴增至第二代(圖4、5)，采用顯微鏡，在200X和400X下可以發(fā)現(xiàn)細胞呈梭形生長。進行流式鑒定和誘導(dǎo)。(三)脂肪間基質(zhì)細胞的流式鑒定
(1)采用體積百分含量為0. 25%的胰酶消化2瓶長滿的脂肪基質(zhì)細胞，PBS清洗3 次；(2)分別使用IOOyL PBS將細胞重懸成4管(1管為陰性對照)，其余3管一次加入流式抗體⑶四，⑶44和⑶90，室溫孵育5分鐘；(3)將細胞收集后，重懸，加入抗體，即可上機，流式細胞儀檢測結(jié)果如圖6、7、8和 9中所示，使用流式細胞儀對細胞表面⑶29，⑶44和⑶90表達的鑒定呈陽性，說明分離獲得的是脂肪基質(zhì)細胞。(四)使用大鼠大腦皮層可溶性物質(zhì)誘導(dǎo)脂肪基質(zhì)細胞成神經(jīng)干細胞(1)取5瓶長滿的脂肪基質(zhì)細胞，使用體積百分含量為0. 25%胰酶消化，收集細胞，1000r/min離心5分鐘；(2)棄上清液，使用3mLDMEM F12培養(yǎng)基重懸細胞，然后分到離心管中，每管ImL細胞懸液(約為1.0 X IO6個細胞)，獲得脂肪基質(zhì)細胞，在離心管中加3mL DMEM F12培養(yǎng)基和ImL大鼠大腦皮層可溶性物質(zhì)；(3)將離心管中5mL細胞懸液接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，在37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中培
Jf ；(4)觀察并拍照(圖10-17)，從圖10-11、16-17中的P2脂肪基質(zhì)細胞于含海馬可溶性物質(zhì)中誘導(dǎo)Id倒置相差顯微鏡觀察100X、200X可以看出細胞生長呈球形，即通過鼠類腦組織中的海馬可溶性物質(zhì)誘導(dǎo)脂肪細胞基質(zhì)獲得了神經(jīng)干細胞(即神經(jīng)球)，同時將P2 脂肪基質(zhì)細胞于20ng/mLEGF、bFGF和B-27中誘導(dǎo)5d倒置相差顯微鏡觀察，在其IOOX (對照)和200X(對照)可以看出該細胞生長呈球形，也獲得了神經(jīng)干細胞。(五)神經(jīng)干細胞鑒定由于nestin蛋白和⑶133蛋白均為神經(jīng)干細胞高親和表達蛋白，實驗中常用此蛋白來鑒定神經(jīng)干細胞。本實驗通過免疫熒光(圖22-23、24-25、28-四)、激光共聚焦(圖 36-37,40-41,44-45,48-49)、westernblot 來鑒定 nestin 蛋白和 CD133 蛋白的表達(圖 50-5 。使用以上3種方法來對神經(jīng)干細胞的鑒定。由于nestin蛋白和⑶133蛋白均為神經(jīng)干細胞高親和表達蛋白，實驗中常用此蛋白來鑒定神經(jīng)干細胞。本實驗通過免疫熒光(圖18-19、26-27、24-25)、激光共聚焦(圖 34-35,42-43,40-41)、western blot 來鑒定 nestin 蛋白和 CD133 蛋白的表達(圖 50-52)。 使用以上3種方法來對神經(jīng)干細胞的鑒定。目前普遍認為nestin蛋白和⑶133是神經(jīng)干細胞高親和表達的蛋白，免疫熒光和激光共聚焦顯微鏡是利用抗原抗體結(jié)合的原理來鑒定的，western blot方法是先將神經(jīng)干細胞里nestin蛋白和CD133蛋白提取出來，然后電泳，利用抗原抗體特異結(jié)合的原理來檢測。Western blot中的條帶就是蛋白質(zhì)顯示出來的。檢測方法同實施例1中所述。免疫熒光來鑒定nestin蛋白和⑶133蛋白的表達見圖20、21、觀和29，圖片中的結(jié)果表明，通過鼠類腦組織中的大腦皮層可溶性物質(zhì)誘導(dǎo)脂肪細胞基質(zhì)獲得了神經(jīng)干細胞 (即神經(jīng)球)。激光共聚焦來鑒定nestin蛋白和⑶133蛋白的表達，如圖36、37、44和45中的結(jié)果表明，通過鼠類腦組織中的大腦皮層可溶性物質(zhì)誘導(dǎo)脂肪細胞基質(zhì)獲得了神經(jīng)干細胞 (即神經(jīng)球)。
Western blot來鑒定nestin蛋白和CD133蛋白的表達，如圖50-52所示，圖片中的結(jié)果表明，通過鼠類腦組織中的大腦皮層可溶性物質(zhì)誘導(dǎo)脂肪細胞基質(zhì)獲得了神經(jīng)干細胞(即神經(jīng)球)，其中nestin蛋白有3個亞型，有3個分子量，Nestin蛋白的分子量依次是 110、177 和 270KD，CD133 的分子量是 120KD。綜上所述，脂肪基質(zhì)細胞在大鼠皮層可溶性物質(zhì)中誘導(dǎo)后，為表達nestin和 ⑶133陽性的神經(jīng)干細胞。實施例3(一 )大鼠小腦可溶性物質(zhì)的提取步驟(1)將離體鼠類腦組織中的小腦部位，置于裝有2mL冷的DMEM F12培養(yǎng)基的離心管中，如圖1、2和3中所示；(2)將裝有小腦的離心管置于4°C的搖床震蕩2小時；(3)在4°C下高速離心30分鐘，離心機轉(zhuǎn)速為18000Xg(rcf)；(4)取離心管上清液，分別過濾滅菌(圖3)，井分裝，做好標(biāo)記，-80°C超低溫保存，( ニ )脂肪間基質(zhì)細胞的取材、培養(yǎng)(1)將鼠類離體脂肪組織少許置于體積百分含量為的2mL I型膠原酶消化30 分鐘；(2)使用胎牛血清終止消化，400目濾網(wǎng)過濾，取濾液，1000r/min離心5分鐘；(3)棄離心后上清液，加入DMEM F12培養(yǎng)基2mL重懸細胞，接種到培養(yǎng)瓶里，以 DMEM F12+體積百分含量為10%的胎牛血清為培養(yǎng)基，在37°C、體積百分含量為5% CO2培
養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(4)細胞擴增至第二代(圖4、5)，采用顯微鏡，在200X和400X下可以發(fā)現(xiàn)細胞呈梭形生長。進行流式鑒定和誘導(dǎo)。(三)脂肪間基質(zhì)細胞的流式鑒定(1)采用體積百分含量為0. 25%的胰酶消化2瓶長滿的脂肪基質(zhì)細胞，PBS清洗3 次；(2)分別使用100 μ LPBS將細胞重懸成4管(1管為陰性對照)，其余3管一次加入流式抗體⑶四，⑶44和⑶90，室溫孵育5分鐘；(3)將細胞收集后，重懸，加入抗體，即可上機，流式細胞儀檢測結(jié)果如圖6、7、8和 9中所示，使用流式細胞儀對細胞表面⑶29，⑶44和⑶90表達的鑒定呈陽性，說明分離獲得的是脂肪基質(zhì)細胞。(四)使用大鼠小腦可溶性物質(zhì)誘導(dǎo)脂肪基質(zhì)細胞成神經(jīng)干細胞(1)取5瓶長滿的脂肪基質(zhì)細胞，使用體積百分含量為0. 25%胰酶消化，收集細胞，1000r/min離心5分鐘；(2)棄上清液，使用3mLDMEM F12培養(yǎng)基重懸細胞，然后分到離心管中，每管ImL細胞懸液(約為1.0 X IO6個細胞)，獲得脂肪基質(zhì)細胞，在離心管中加3mL DMEM F12培養(yǎng)基和ImL大鼠小腦可溶性物質(zhì)；(3)將離心管中5mL細胞懸液接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，在37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中培
Jf ；
(4)觀察并拍照(圖10-17)，從圖10-11、16-17中的P2脂肪基質(zhì)細胞于含海馬可溶性物質(zhì)中誘導(dǎo)Id倒置相差顯微鏡觀察100X、200X可以看出細胞生長呈球形，即通過鼠類腦組織中的海馬可溶性物質(zhì)誘導(dǎo)脂肪細胞基質(zhì)獲得了神經(jīng)干細胞(即神經(jīng)球)，同時將P2 脂肪基質(zhì)細胞于20ng/mLEGF、bFGF和B-27中誘導(dǎo)5d倒置相差顯微鏡觀察，在其100X (對照)和200X(對照)可以看出該細胞生長呈球形，也獲得了神經(jīng)干細胞。(五)神經(jīng)干細胞鑒定由于nestin蛋白和⑶133蛋白均為神經(jīng)干細胞高親和表達蛋白，實驗中常用此蛋白來鑒定神經(jīng)干細胞。本實驗通過免疫熒光(圖22-23、24-25、30-31和32-3 、激光共聚焦(圖 38-39、40-41、46-47、48-49)、western blot 來鑒定 nestin 蛋白和 CD133 蛋白的表達(圖50-5 。使用以上3種方法來對神經(jīng)干細胞的鑒定。檢測方法同實施例1中所述。免疫熒光來鑒定nestin蛋白和⑶133蛋白的表達見圖22、23、30和31，圖片中的結(jié)果表明，通過鼠類腦組織中的小腦可溶性物質(zhì)誘導(dǎo)脂肪細胞基質(zhì)獲得了神經(jīng)干細胞(即神經(jīng)球)。激光共聚焦來鑒定nestin蛋白和⑶133蛋白的表達，如圖38、39、46和47中的結(jié)果表明，通過鼠類腦組織中的小腦可溶性物質(zhì)誘導(dǎo)脂肪細胞基質(zhì)獲得了神經(jīng)干細胞(即神經(jīng)球)。Western blot來鑒定nestin蛋白和CD133蛋白的表達，如圖50-52所示，圖片中的結(jié)果表明，通過鼠類腦組織中的小腦可溶性物質(zhì)誘導(dǎo)脂肪細胞基質(zhì)獲得了神經(jīng)干細胞 (即神經(jīng)球)，其中nestin蛋白有3個亞型，有3個分子量，Nestin蛋白的分子量依次是 110、177 和 270KD，CD133 的分子量是 120KD。綜上所述，脂肪基質(zhì)細胞在大鼠小腦可溶性物質(zhì)中誘導(dǎo)后，為表達nestin和 ⑶133陽性的神經(jīng)干細胞。實際上，采用離體鼠類腦組織中的海馬、大腦皮層和小腦部位中的兩種或者三種， 也可以采用本發(fā)明中的方法誘導(dǎo)脂肪基質(zhì)細胞形成神經(jīng)干細胞，此處不再列挙。以上實施例僅用于闡述本發(fā)明，而本發(fā)明的保護范圍并非僅僅局限于以上實施例。所述技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員依據(jù)以上本發(fā)明公開的范圍，均可實現(xiàn)本發(fā)明的目的。
權(quán)利要求
1.一種模擬體內(nèi)環(huán)境誘導(dǎo)脂肪基質(zhì)細胞為神經(jīng)干細胞的方法，其特征是含以下步驟(1)選取離體鼠類腦組織中的海馬、大腦皮層或小腦部位，置于DMEMF12培養(yǎng)基中，經(jīng)搖床震蕩和離心處理后，取上清液，過濾后滅菌獲得鼠類腦組織中的海馬、大腦皮層或小腦可溶性物質(zhì)，保存?zhèn)溆茫?2)選取離體鼠類皮下脂肪組織，采用I型膠原酶消化后，使用胎牛血清或新牛血清終止消化，過濾，取濾液，離心后棄去上清液，在下層物質(zhì)中加入培養(yǎng)基重懸細胞，接種，在培養(yǎng)基和體積百分含量為10%的胎牛血清或新牛血清中培養(yǎng)后，細胞擴增至第二代，經(jīng)流式鑒定確認為脂肪基質(zhì)細胞；(3)取步驟O)中獲得的脂肪基質(zhì)細胞進行預(yù)處理后獲得的重懸后脂肪基質(zhì)細胞，取出重懸后脂肪基質(zhì)細胞，加入培養(yǎng)基和步驟(1)中制備的鼠類腦組織中海馬、大腦皮層或小腦可溶性物質(zhì)，將細胞懸液培養(yǎng)后，通過鼠類腦組織中的海馬、大腦皮層或小腦可溶性物質(zhì)誘導(dǎo)脂肪基質(zhì)細胞成神經(jīng)干細胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的模擬體內(nèi)環(huán)境誘導(dǎo)脂肪基質(zhì)細胞為神經(jīng)干細胞的方法，其特征是步驟(1)中搖床震蕩時的溫度為4°C，震蕩時間為IH
3.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的模擬體內(nèi)環(huán)境誘導(dǎo)脂肪基質(zhì)細胞為神經(jīng)干細胞的方法，其特征是步驟(1)中離心時的溫度為4°C，離心機的轉(zhuǎn)速為18000Xg，離心時間為 20-40min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的模擬體內(nèi)環(huán)境誘導(dǎo)脂肪基質(zhì)細胞為神經(jīng)干細胞的方法，其特征是步驟O)中I型膠原酶的體積百分含量為0. 5-1. 5%，消化時間為20-40min ；所述培養(yǎng)基為DMEM、DMEM/高糖、DMEM/低糖或DMEM F12。
5.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的模擬體內(nèi)環(huán)境誘導(dǎo)脂肪基質(zhì)細胞為神經(jīng)干細胞的方法，其特征是步驟O)中離心時的轉(zhuǎn)速為1000-1200r/min，離心時間為l-10min。
6.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的模擬體內(nèi)環(huán)境誘導(dǎo)脂肪基質(zhì)細胞為神經(jīng)干細胞的方法，其特征是步驟(3)中所述培養(yǎng)基為DMEM、DMEM/高糖、DMEM/低糖、DMEM F12或神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權(quán)利要求6中所述的模擬體內(nèi)環(huán)境誘導(dǎo)脂肪基質(zhì)細胞為神經(jīng)干細胞的方法，其特征是步驟(3)中脂肪基質(zhì)細胞進行預(yù)處理的具體過程為取步驟O)中培養(yǎng)的脂肪基質(zhì)細胞，經(jīng)胰酶消化后，收集細胞，離心，棄去上清液，下層物質(zhì)采用培養(yǎng)基重懸細胞，得重懸后脂肪基質(zhì)細胞，其中所述胰酶的體積百分含量為0. 125-0. 25%。
8.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的模擬體內(nèi)環(huán)境誘導(dǎo)脂肪基質(zhì)細胞為神經(jīng)干細胞的方法，其特征是步驟(3)中獲得的重懸后脂肪基質(zhì)細胞的濃度為1. 0-3. OX IO6個細胞/mL。
9.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的模擬體內(nèi)環(huán)境誘導(dǎo)脂肪基質(zhì)細胞為神經(jīng)干細胞的方法， 其特征是步驟(3)中重懸后脂肪基質(zhì)細胞與培養(yǎng)基的體積比為1 1-4，重懸后脂肪基質(zhì)細胞與步驟(1)中制備的鼠類腦組織中的海馬、大腦皮層或小腦可溶性物質(zhì)的體積比為 1 1-4。
10.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的模擬體內(nèi)環(huán)境誘導(dǎo)脂肪基質(zhì)細胞為神經(jīng)干細胞的方法， 其特征是步驟C3)中將細胞懸液培養(yǎng)時的條件為在37°C，體積百分含量為5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
全文摘要
一種模擬體內(nèi)環(huán)境誘導(dǎo)脂肪基質(zhì)細胞為神經(jīng)干細胞的方法，(1)選取離體鼠類腦組織中海馬、大腦皮層或小腦部位，獲得其可溶性物質(zhì)；(2)選取離體鼠類皮下脂肪組織，獲得脂肪基質(zhì)細胞；(3)取脂肪基質(zhì)細胞進行預(yù)處理后獲得的重懸后脂肪基質(zhì)細胞，加入培養(yǎng)基和鼠類腦組織中海馬可溶性物質(zhì)、大腦皮層或小腦可溶性物質(zhì)，將細胞懸液培養(yǎng)后，通過鼠類腦組織中的海馬、大腦皮層或小腦可溶性物質(zhì)誘導(dǎo)脂肪基質(zhì)細胞成神經(jīng)干細胞。該方法采用鼠類腦組織的海馬、大腦皮層和小腦部位等外環(huán)境所含可溶性物質(zhì)作為生理誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)鼠類皮下組織中的脂肪基質(zhì)細胞為神經(jīng)干細胞，實現(xiàn)在生理條件下促使和加快種子細胞的形成。
文檔編號C12N5/0797GK102559588SQ201110410788
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月9日
發(fā)明者姜曉丹, 李鵬 申請人:姜曉丹, 李鵬