專利名稱：一種豬骨膠原多肽鈣螯合補鈣劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物制品的加工技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬骨膠原多肽鈣螯合補鈣劑的制備方法。
背景技術(shù)：
我國是一個畜牧業(yè)大國，隨著我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，每年我國約有近1500萬噸的畜禽骨骼產(chǎn)生。對于畜禽骨資源綜合開發(fā)直接影響著畜禽養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益；對骨進(jìn)行加工利用，將會產(chǎn)生極大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益，具有極大地開發(fā)前景。根據(jù)我國的2010年統(tǒng)計，我國的豬骨產(chǎn)量可達(dá)到800多萬噸，并且每年還在上升。面對如此巨大的生物資源， 長期以來對豬骨的加工主要集中在生產(chǎn)骨膠、骨脂、飼料、肥料等方面，很少用于開發(fā)附加值高的產(chǎn)品。這些低技術(shù)含量的加工產(chǎn)品不僅經(jīng)濟(jì)效益低下，而且造成了大量的環(huán)境污染問題。因此，針對大量的畜禽骨資源，開發(fā)新型的精深骨骼產(chǎn)品已成為目前迫切的任務(wù)。畜禽骨骼中的膠原蛋白是營養(yǎng)全價的一種蛋白質(zhì)，利用骨蛋白資源開發(fā)多肽制品是當(dāng)前研究的熱點。采用骨骼所開發(fā)的食品的營養(yǎng)價值等于或超過鮮肉，但價格只相當(dāng)于鮮肉的一半。由于技術(shù)水平的限制，忽視了豬骨營養(yǎng)蛋白資源成分的利用，而豬骨中所含的鈣，卻是人體最易于吸收和消化的鈣源之一。利用動物性蛋白資源開發(fā)多肽制品是當(dāng)前研究的熱點。近幾年有關(guān)酶解畜禽骨骼的報道很多，雖然取得了一定的成績和突破，但由于酶解骨骼的酶的來源不同，成本較高，而且由于沒有找到真正合適的降解骨骼的大工業(yè)生產(chǎn)利用的蛋白酶，能否實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)面臨極大挑戰(zhàn)。因此，探索新的開發(fā)骨骼途徑和方法仍成為骨開發(fā)的亟待解決問題。近年來，有學(xué)者從事微生物發(fā)酵骨泥利用骨中鈣的相關(guān)研究， 他們的研究結(jié)果表明乳酸菌發(fā)酵可以明顯使骨泥液中離子鈣的含量明顯提高，但其發(fā)酵效果有待進(jìn)一步的提高。近幾年資料表明，我國大多數(shù)人群處于缺鈣邊緣甚至嚴(yán)重缺鈣，缺鈣是我國人群中普遍存在的現(xiàn)象。缺鈣可能會引起骨質(zhì)疏松、佝僂癥、小兒抽搐癥等多種疾病。而目前市場上的鈣制劑的發(fā)展歷經(jīng)了三個階段，無機鈣鹽、有機酸鈣鹽以及氨基酸螯合鈣。從吸收率的角度考慮，第三代氨基酸螯合鈣>第二代有機鈣鹽>第一代無機鈣鹽。而近年來，隨著小肽吸收理論的提出，第四代多肽螯合鈣鹽成為研究的熱點。從吸收機制、螯合機制、轉(zhuǎn)運機制、功能性以及穩(wěn)定性方面而言，多肽螯合鈣明顯優(yōu)于氨基酸螯合鈣，充分發(fā)揮了膠原多肽和鈣對人體的雙重營養(yǎng)功能特性。研究表明，要預(yù)防和改善骨質(zhì)疏松，最科學(xué)的方法是同時補充鈣和膠原蛋白。目前，有關(guān)動物骨開發(fā)制備骨膠原多肽螯合鈣的專利都是采用酶解工藝完成，雖然關(guān)于骨骼酶解取得了一定的成績和突破，但由于酶解骨骼所用酶的來源不同，成本較高， 而且由于沒有找到真正合適降解骨骼的大工業(yè)生產(chǎn)利用的蛋白酶，能否實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)仍面臨極大挑戰(zhàn)。因此，探索新的降解骨骼的途徑現(xiàn)在成為骨骼產(chǎn)業(yè)化利用亟待解決的問題
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為解決上述技術(shù)問題的不足，提供一種投入成本低廉的微生物降解豬骨的制備膠原多肽鈣螯合補鈣劑的制備方法，用來提高豬骨加工的附加值，通過選育菌種的混合發(fā)酵，從廢棄豬骨中制備高附加值的功能性補鈣產(chǎn)品一膠原多肽鈣螯合物的制備方法，實現(xiàn)了豬骨骼的綜合利用。本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題的不足，所采用的技術(shù)方案是一種豬骨膠原多肽鈣螯合補鈣劑的制備方法，所述方法包括以下步驟
(1)、豬骨泥的制備取新鮮豬骨，破碎后清洗干凈，121°C高壓蒸煮脫脂40分鐘，然后通過超微粉碎制成豬骨泥；
(2)、骨膠原多肽的制備取蒸餾水、蔗糖和步驟(1)中制備的豬骨泥配制成豬骨泥培養(yǎng)液，其中每升豬骨泥培養(yǎng)液中含有15 20g蔗糖、35 40g豬骨泥，將豬骨泥培養(yǎng)液的pH 值調(diào)至7. 2 7. 4，在121°C條件下滅菌30分鐘，然后接種粘質(zhì)沙雷氏菌和保加利亞乳桿菌的混合菌種，粘質(zhì)沙雷氏菌和保加利亞乳桿菌的配比為1:1或2:1，混合菌種的總接種量為培養(yǎng)液質(zhì)量的3 4%，接種完成后在35°C條件下，以140轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速搖床發(fā)酵培養(yǎng)48 小時，發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，在121°C條件下滅菌30分鐘，然后以6000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心15 分鐘，取上清液，采用活性炭進(jìn)行脫色處理，并經(jīng)過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后冷凍干燥，即得骨膠原多肽，分離出來的骨泥渣儲存?zhèn)溆茫?br> (3)、可溶性骨鈣的制備取步驟(2)中分離出來的骨泥渣與濃度為0.48 mol/L鹽酸混合，每15ml鹽酸加入Ig骨泥渣，50°C水浴3小時，然后以6000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，取上清液，調(diào)整PH值為7.0，再以8000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，去除沉淀將上清液干燥制得可溶性的骨鈣；
(4)、骨膠原多肽鈣螯合物補鈣劑的制備取步驟(2)中制備好的骨膠原多肽，采用蒸餾水溶解，并調(diào)節(jié)PH值為7. 5，然后加入骨膠原多肽質(zhì)量1/3的可溶性骨鈣，在55 60°C 條件下螯合反應(yīng)2 3小時，反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)溶液中加入無水乙醇與水混合溶液，以 5000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心20分鐘，取沉淀物，經(jīng)過濾，冷凍干燥，粉碎，即制得豬骨膠原多肽鈣螯合物補鈣劑，其中無水乙醇與水混合溶液中無水乙醇與水的體積比為9:1。所述步驟(1)中破碎后的豬骨反復(fù)煮沸100°C脫脂2 3小時，然后通過超微粉碎制成豬骨泥。本發(fā)明的有益效果是
(1)本發(fā)明方法提高了豬骨資源的附加值，實現(xiàn)了豬骨中膠原蛋白和骨鈣的綜合開發(fā)利用，防止豬骨遺棄造成的環(huán)境污染，且用到的設(shè)備均為普通設(shè)備，成本低，可操作性強，制備效率高，可用于規(guī)模生產(chǎn)。(2)本發(fā)明方法制備的螯合物補鈣劑在水中的溶解度好，這對于人體對螯合物中鈣元素的生物吸收利用非常有利，且產(chǎn)品在PH 2.0 PH 8.0的范圍內(nèi)溶解度都很高。產(chǎn)品可應(yīng)用于輕工、化工、食品、化妝品、醫(yī)藥等多個領(lǐng)域。
具體實施例方式以下是本發(fā)明的具體實施例，但本發(fā)明不受具體實施例限制。實施例1
(1)、豬骨泥的制備取新鮮豬骨，破碎后清洗干凈，121°c高壓蒸煮脫脂40分鐘，然后通過超微粉碎制成豬骨泥。超微粉碎，是指利用機械或流體動力的方法克服固體內(nèi)部凝聚力使之破碎，從而將3毫米以上的物料顆粒粉碎至10-25微米的操作技術(shù)。(2)、骨膠原多肽的制備取蒸餾水、蔗糖和步驟(1)中制備的豬骨泥配制成豬骨泥培養(yǎng)液，其中每升豬骨泥培養(yǎng)液中含有15g蔗糖、35g豬骨泥，將豬骨泥培養(yǎng)液的PH值調(diào)至7. 2，在121°C條件下滅菌30分鐘，然后接種粘質(zhì)沙雷氏菌和保加利亞乳桿菌的混合菌種，粘質(zhì)沙雷氏菌和保加利亞乳桿菌的配比為2:1，混合菌種的總接種質(zhì)量量為培養(yǎng)液質(zhì)量的3 %，接種完成后在35°C條件下，以140轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速搖床發(fā)酵培養(yǎng)48小時，發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，在121°C條件下滅菌30分鐘，然后以6000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，取上清液，采用活性炭進(jìn)行脫色處理，并經(jīng)過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后冷凍干燥，即得骨膠原多肽，分離出來的骨泥渣儲存?zhèn)溆茫?br> (3)、可溶性骨鈣的制備取步驟(2)發(fā)酵剩余的骨泥渣與濃度為0.48 mol/L鹽酸混合，每15ml鹽酸加入Ig骨泥渣，50°C水浴3小時，然后以6000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，取上清液，調(diào)整PH值為7.0，再以8000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，去除沉淀將上清液干燥制得可溶性的骨鈣；
(4)、骨膠原多肽鈣螯合物補鈣劑的制備取步驟(2)中制備好的骨膠原多肽，用蒸餾水溶解，并調(diào)節(jié)PH值為7. 5，然后加入骨膠原多肽質(zhì)量1/3的可溶性骨鈣，在55°C條件下螯合反應(yīng)2小時，反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)溶液中加入無水乙醇與水混合溶液，以5000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心20分鐘，取沉淀物，經(jīng)過濾，冷凍干燥，粉碎，即制得豬骨膠原多肽鈣螯合物補鈣劑，其中無水乙醇與水混合溶液中無水乙醇與水的體積比為9:1。經(jīng)實驗確定螯合率約為54. 31 士 3. 11%，螯合物得率為79. 23 士4. ，對于所得產(chǎn)品采用茚三酮-硫酸鈉法鑒定為豬骨膠原多肽鈣螯合物。制得的豬骨膠原多肽鈣螯合物的組成成分如下表所示
成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)鈣9. 35膠原多肱71.02水分6. 4其它12. 73
其中粗蛋白(膠原多肽+其他雜質(zhì)蛋白)的含量為81. 57% ；
從表中數(shù)據(jù)可知，所制備的豬骨膠原多肽鈣螯合物的主要成分是多肽和鈣，因此，該產(chǎn)品能完全達(dá)到膠原多肽和鈣互補的效果。
制得的豬骨膠原多肽鈣螯合物的溶解度如下表所示
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制得的豬骨膠原多肽鈣螯合物在不同PH條件下的溶解度如下表所示
從以上結(jié)果分析可知，在水溫接近人體正常的體溫(30 40°C)條件下，螯合物的溶解
5度比較好，這對于人體對螯合物中鈣元素的吸收非常有利。同時在pH為2 12范圍內(nèi)，產(chǎn)品都具有很好的溶解度；但PH為7.0時，其溶解度最小，而隨著酸性或堿性增強，溶解度不斷增加，同時，其在酸性條件下溶解度增加略大于在堿性條件下。表明，在胃腸道吸收時產(chǎn)品也同樣具有很好的溶解度。通過胃腸道模擬檢測豬骨膠原多肽鈣螯合物的持鈣能力，將待測樣0. 5g研碎(模擬牙齒咀嚼或胃內(nèi)崩解)，充分溶于50ml的HCl中(模擬胃酸溶解)。酸液經(jīng)離心(6000轉(zhuǎn)/ 分鐘，20分鐘)，過濾處理收集上清液，測定濾液的pH值。用NaOH溶液調(diào)節(jié)濾液的pH值至 4. 5 5. 0范圍內(nèi)，注意滴加堿液時應(yīng)緩慢，防止沉淀產(chǎn)生并保持溶液處于澄清狀態(tài)。取另一試管中加入IOml磷酸緩沖溶液(pH7. 0 8. 0，模擬小腸中性至弱堿性生理環(huán)境)，用微量注射器向試管內(nèi)注入上述處理好的濾液Iml (模擬鈣離子在小腸中性至弱堿性環(huán)境中的變化)，觀察是否有沉淀產(chǎn)生。制得的豬骨膠原多肽鈣螯合物在模擬胃腸道中的持鈣穩(wěn)定性如下表所示
權(quán)利要求
1.一種豬骨膠原多肽鈣螯合補鈣劑的制備方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(1)、豬骨泥的制備取新鮮豬骨，破碎后清洗干凈，121°c高壓蒸煮脫脂40分鐘，然后通過超微粉碎制成豬骨泥；(2)、骨膠原多肽的制備取蒸餾水、蔗糖和步驟(1)中制備的豬骨泥配制成豬骨泥培養(yǎng)液，其中每IL豬骨泥培養(yǎng)液中含有15 20g蔗糖和35 40g豬骨泥，將豬骨泥培養(yǎng)液的PH值調(diào)至7. 2 7. 4，在121°C條件下滅菌30分鐘，然后接種粘質(zhì)沙雷氏菌和保加利亞乳桿菌的混合菌種，粘質(zhì)沙雷氏菌和保加利亞乳桿菌的配比為1:1或2:1，混合菌種的總接種量為培養(yǎng)液質(zhì)量的3 4%，接種完成后在35°C條件下，以140轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速搖床發(fā)酵培養(yǎng)48小時，發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，在121°C條件下滅菌30分鐘，然后以6000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，取上清液，采用活性炭進(jìn)行脫色處理，并經(jīng)過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后冷凍干燥，即制得骨膠原多肽，分離出來的骨泥渣儲存?zhèn)溆茫?3)、可溶性骨鈣的制備取步驟(2)中分離出來的骨泥渣與濃度為0.48mol/L鹽酸混合，每15ml鹽酸加入Ig骨泥渣，在50°C條件下水浴3小時，然后以6000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，取上清液，調(diào)整pH值為7.0，再以8000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，去除沉淀將上清液冷凍干燥制得可溶性的骨鈣；(4)、骨膠原多肽鈣螯合物補鈣劑的制備取步驟(2)中制備好的骨膠原多肽，采用蒸餾水溶解，并調(diào)節(jié)PH值為7. 5，然后加入骨膠原多肽質(zhì)量1/3的可溶性骨鈣，在55 60°C 條件下螯合反應(yīng)2 3小時，反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)溶液中加入無水乙醇與水混合溶液，以 5000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心20分鐘，取沉淀物，經(jīng)過濾，冷凍干燥，粉碎，即制得豬骨膠原多肽鈣螯合物補鈣劑，其中無水乙醇與水混合溶液中無水乙醇與水的體積比為9:1。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豬骨膠原多肽鈣螯合補鈣劑的制備方法，其特征在于 所述步驟(1)中破碎后的豬骨反復(fù)煮沸100°C脫脂2 3小時，然后通過超微粉碎制成豬骨泥。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種豬骨膠原多肽鈣螯合補鈣劑的制備方法，包括以下步驟1、豬骨泥的制備，取新鮮豬骨破碎、脫脂、粉碎制成豬骨泥；2、骨膠原多肽的制備，配置豬骨泥培養(yǎng)液，接種粘質(zhì)沙雷氏菌和保加利亞乳桿菌的混合菌種，發(fā)酵后離心、過濾、干燥制得骨膠原多肽；3、可溶性骨鈣的制備，取發(fā)酵后剩余的骨泥渣，與鹽酸混合制備可溶性骨鈣；4、骨膠原多肽鈣螯合物補鈣劑的制備，取骨膠原多肽和可溶性骨鈣螯合，制備豬骨膠原多肽鈣螯合物補鈣劑；本發(fā)明方法提高了豬骨資源的附加值，實現(xiàn)了豬骨中膠原蛋白和骨鈣的綜合開發(fā)利用，制備的螯合物補鈣劑在水中的溶解度好，對于人體對螯合物中鈣元素的吸收利用非常有利，并能應(yīng)用于、化工、食品、化妝品、等多個領(lǐng)域。
文檔編號A23L1/304GK102429236SQ201110412878
公開日2012年5月2日 申請日期2011年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月13日
發(fā)明者任廣躍, 劉麗莉, 康懷彬, 張慧蕓, 段續(xù), 肖楓, 趙勝娟, 陳俊亮 申請人:河南科技大學(xué)