專利名稱：利用葡萄糖產丁二酸的基因工程菌株及其發(fā)酵產酸方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物工程技術領域，涉及利用葡萄糖產丁二酸的基因工程菌株及其發(fā)酵產酸方法，具體是一株高效利用葡萄糖生長并產丁二酸重組菌株及其利用該菌株發(fā)酵生產丁二酸的方法。
背景技術：
丁二酸(succinic acid)又稱琥珀酸，被廣泛應用于醫(yī)藥、農藥、染料、香料、油漆、 食品和塑料等行業(yè)，作為C4平臺化合物，可用于合成1，4-丁二醇、四氫呋喃、γ - 丁內酯等有機化學品以及聚丁二酸丁二醇酯(PBQ類生物可降解材料，被美國能源部認為是未來 12種最有價值的生物煉制產品之一。丁二酸的生產方法主要包括化學合成法和微生物發(fā)酵法，利用微生物發(fā)酵法轉化可再生資源(葡萄糖、木糖等)，由于原料來源廣泛且價格低廉，污染小，環(huán)境友好，且在發(fā)酵過程中可以吸收固定CO2,能有效緩解溫室效應，開辟了溫室氣體二氧化碳利用的新途徑，今年來成為研究的熱點。丁二酸的生產菌株主要集中在Armerobiospirillum succiniciproducens^Actinobacillus succinogenes、Mannheimia succiniciproducens、 重組谷氨酸棒桿菌和重組大腸桿菌。利用野生菌株生產丁二酸雖然獲得了較高的產物濃度，但培養(yǎng)過程培養(yǎng)基成本較高，且甲酸、乙酸等副產物積累較多，阻礙了其工業(yè)化進程。 E. coli由于遺傳背景清楚、易操作、易調控、培養(yǎng)基要求簡單和生長迅速等優(yōu)點，近年來被廣泛用于研究以獲得產丁二酸優(yōu)秀菌株。現(xiàn)有產丁二酸重組大腸桿菌的構建思路主要包括失活副產物生成途徑的關鍵酶 (如丙酮酸甲酸裂解酶與乳酸脫氫酶)、增強丁二酸合成途徑中酶(如磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)的活性以及外源導入可以弓I導合成丁二酸的酶(如丙酮酸羧化酶)提高其對葡萄糖的利用率以及生產速率。其中，五coli NZNlll由于同時失活了丙酮酸甲酸裂解酶與乳酸脫氫酶，NADH不能及時再生為NAD+，引起胞內輔酶NAD(H)的不平衡(NADH/NAD+比例超過2)， 最終導致厭氧條件下菌株不能利用葡萄糖。其自發(fā)突變株五coli AFPlll由于突變了葡萄糖專性轉運系統(tǒng)中的PtsG基因，降低了在EMP途徑中NADH的產生速率，恢復了 NAD(H) 平衡，使得菌株在厭氧條件下能夠利用葡萄糖，且產物主要為丁二酸，在有氧厭氧兩階段發(fā)酵培養(yǎng)AFPlll過程中，丁二酸質量收率達到96%，生產強度為1.21 g-L-1·^1.因此，在高產丁二酸大腸桿菌菌株構建過程中，確保胞內輔酶NAD(H)的平衡是重組大腸桿菌高產丁二酸的關鍵因素之一。大腸桿菌中NAD(H)的生物合成及分解途徑如圖1所示，涉及其合成的基因主要有三個(/7/ M，/7a^，/7a^)，涉及分解代謝的基因主要有兩個、naD,yrfE\而NAD+和NADH相互之間的轉化反應則多達300多個。相關研究表明，利用DNA重組技術改造NAD(H)生物合成途徑是提高NAD (H)總量的有效手段。San等人(Metab Eng, 2002, 4: 238-247 ；Metab Eng, 2002, 4: 182-192)在研究輔因子調控對大腸桿菌代謝流分布的影響過程中，通過過量表達煙酸轉磷酸核糖激酶(NAPRTase)使胞內NAD(H)總量提高了 41. 7% ；Heuser等人(Eng Life Sci, 2007, 7: 343-353)通過過量表達煙酸轉磷酸核糖激酶和NAD合成酶， 或者同時表達這兩個酶，使菌株胞內NAD(H)總量提高了 2倍多，并將其應用到酶轉化合成 (R)-甲基-3-羥基丁胺過程中，使得NAD (H)的量不再成為限制因素，從而提高了酶轉化的效率。眾多科學實踐也證明利用發(fā)酵調控手段可有效調節(jié)NAD (H)總量與NADH/NAD+比例， 進而有效提高底物的利用率和產物生產水平。在利用SeiccheiromycGS cerevisiae TMB3001 (Biotechnol Bioeng, 2002, 78 172-178)禾口/7W1Sari腫 oxysporum (J Biosci Bioeng, 2004，97: 299-304. Enzyme Micro Technol, 2005，36: 100-106)發(fā)酵木糖生產乙醇的過程中添加乙偶姻作為外源電子受體，有效地增加了胞內NAD+含量，提高了乙醇的產率； San等人(Metab Eng, 2002，4: 182-192)在利用大腸桿菌生產1，2-丙二醇過程中，發(fā)現(xiàn)在稀釋率為0. 1 IT1恒化厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)中，隨著碳源還原性的增大，胞內NADH/NAD+比率從 0.51(葡萄糖酸)增加到0. 75(葡萄糖)和0. 94 (山梨醇)，并導致中心代謝流產物乙醇 (消耗2 mol NADH)對乙酸(不消耗NADH)的比率分別為0. 29,1和3. 62。煙酸磷酸核糖轉移酶是NAD (H)合成過程中的限速步驟酶且需要ATP的參與(見圖1)。在大腸桿菌中磷酸烯醇式丙酮酸通過磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶生成草酰乙酸，在此過程中沒有ATP的生成，但是在feciBm subtilis中，磷酸烯醇式丙酮酸是通過磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶生成草酰乙酸的，在此過程中有ATP的生成，并且Millard等在大腸桿菌中過量表達五COli /7/7C和/74，研究發(fā)現(xiàn)過量表達/7/7C可以使琥珀酸作為混合酸發(fā)酵的主要產物，且產量較出發(fā)菌株提高3. 5倍，而過量表達對發(fā)酵結果沒有影響，但在 /7/7C缺陷菌株中，的過量表達能夠提高琥珀酸的產量。本申請發(fā)明人團隊在先專利申請涉及一株可以利用木糖發(fā)酵產丁二酸的基因工程菌株，并進行了菌株專利保藏，專利申請?zhí)?01110380396. 3，申請日2011年11月25日，生物材料保藏編號CCTCC NO :M2011207。 該菌株可以高效利用木糖發(fā)酵產丁二酸，但是不能利用葡萄糖發(fā)酵生產丁二酸。若以缺乏乳酸脫氫酶基因，丙酮酸甲酸裂解酶基因和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因活性，并過量表達磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的菌株大腸桿菌BA204為出發(fā)菌株，再過量表達煙酸磷酸核糖轉移酶后，得到能夠高效利用葡萄糖生長并產丁二酸基因工程菌。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供了一種能高效利用葡萄糖生長并產丁二酸的基因工程菌株及其構建方法，并利用該菌株厭氧發(fā)酵生產丁二酸，達到菌株的構建方法簡單方便，構建得到的菌株發(fā)酵方法簡單可行，易于工業(yè)化，產酸能力強的目的，從而大大降低生產成本， 提高經濟效益。為實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術方案。一、本發(fā)明提供一株產丁二酸基因工程菌菌株，其分類命名為大腸埃希氏菌 BA205 (.Escherichia coli BA205)，其保藏編號為 CCTCC NO :M 2011447。二、本發(fā)明所述的大腸埃希氏菌BA205的構建方法，其特征在于以缺乏乳酸脫氫酶(LDH)基因，丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因活性的菌株大腸桿菌為出發(fā)菌株，利用同源重組技術敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因，并過量共表達磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和煙酸磷酸核糖轉移酶后，得到能夠高效利用葡萄糖生長并產丁二酸大腸埃希氏菌 BA205。
4
進一步地，所述的具體構建步驟如下
(1)以缺乏乳酸脫氫酶基因(7 /Μ)，丙酮酸甲酸裂解酶基因(/7/7召)活性的五C^i NzmiI菌株為出發(fā)菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因，得到同時缺 1 IdhA、PflB琳ppc的感受態(tài)菌株；(2)合成一對5’端帶有酶切位點的引物，以
Bacillus subtil is基因組DNA為模板，純化擴增出的pck基因后，表達質粒pTrc99a用與引物所設計的酶切位點一致的酶雙酶切、連接獲得重組質粒pTrC99a-/7C々；
(3)合成一對5’端帶有相同酶切位點的引物，以大腸桿菌K12基因組DNA為模板，純化擴增出的卯M基因后，已構建的重組質粒pTrc99a-/x^用與引物所設計的酶切位點一致的酶單酶切、連接獲得重組質粒命c^-Pck-pncB ；
(4)將重組質粒pTrc99a-/7d-/7/7Ci 導入步驟(1)得到的感受態(tài)菌株，獲得陽性轉化子；
(5)利用步驟(4)的陽性轉化子過量共表達磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和煙酸磷酸核糖轉移酶，恢復其在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力，得到高效利用葡萄糖代謝產丁二酸基因工程菌大腸埃希氏菌BA205。三、利用本發(fā)明所述的大腸埃希氏菌BA205發(fā)酵生產丁二酸的方法，其特征在于采用兩階段發(fā)酵方式，有氧階段提高生物量，厭氧階段發(fā)酵產酸。進一步地，具體步驟如下。將大腸埃希氏菌BA205按1%(ν/ν)接種量接種入有氧階段發(fā)酵培養(yǎng)基中有氧培養(yǎng)，當有氧培養(yǎng)菌體OD6tltl至0. 4 0. 6用0. 3 mM的IPTG誘導至0D6(1(1=3時，按接種量10% 轉接至厭氧階段發(fā)酵培養(yǎng)基中厭氧發(fā)酵。其中所述的有氧階段發(fā)酵培養(yǎng)基是現(xiàn)有技術中有氧培養(yǎng)產丁二酸大腸桿菌的常規(guī)培養(yǎng)基；所述的厭氧階段發(fā)酵培養(yǎng)基是以葡萄糖為碳源的產丁二酸大腸桿菌用發(fā)酵培養(yǎng)基。本發(fā)明的有益效果在于以缺乏乳酸脫氫酶基因，丙酮酸甲酸裂解酶基因和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因活性，并過量表達磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的菌株大腸桿菌 BA204為出發(fā)菌株，再過量表達煙酸磷酸核糖轉移酶后，得到能夠高效利用葡萄糖生長并產丁二酸基因工程菌，克服了原BA204菌株不能利用葡萄糖的缺陷，增強了本菌株的適應范圍。


圖1大腸桿菌中NAD(H)的生物合成及分解途徑。圖2重組質粒pTrc99a_/7d的構建圖譜。圖3重組質粒^\Tcma-pck-pncB的構建圖譜。
圖4 PCR產物pck的瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖。圖5 PCR產物pncB的瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖。圖6重組質粒pTrc99a-/7d的雙酶切鑒定圖。圖7重組質粒識rc^^-pck-pncB的雙酶切鑒定圖。本發(fā)明的微生物分類命名為大腸埃希氏菌込k2臨〔Escherichia coli BA205)，保藏日期為2011年12月7日，保藏單位全稱為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱為CCTCC，保藏單位地址中國.武漢.武漢大學；保藏編號CCTCC NO: M 2011447。
具體實施例方式下面的實施例對本發(fā)明作詳細說明，但對本發(fā)明沒有限制。本發(fā)明所述的安普霉素抗性基因的來源是pIJ773，購自南京師范大學邵蔚藍教授處。本發(fā)明所述的能夠誘導表達λ重組酶的質粒的來源是pKD46，購自htrovegen 公司。本發(fā)明所述的能夠誘導產生FLP重組酶的質粒的來源是pCP20，購自htrovegen 公司。本發(fā)明所述的feciB^s subtilis基因組的來源是購自ATCC 23857。本發(fā)明所述的表達質粒用pTrc99a的來源是購自htrovegen公司。本發(fā)明所述的出發(fā)菌株萬.co/i NZmil (CGSC#: 7726)的來源是Biotechnol Bioeng, 2001，74:89 95。實施例1
本實施例說明利用同源重組技術敲除出發(fā)菌株Nzmii中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 PPC基因，得到消除安普霉素抗性菌株的過程。1、利用LB培養(yǎng)基，于37 °C、有氧條件下培養(yǎng)大腸桿菌NZWll至OD6tltl=O. 4 0. 6， 制備成電轉感受態(tài)。2、將質粒pKD46電轉入感受態(tài)的大腸桿菌NZmil。電擊條件為200 Ω，25 μ F， 電擊電壓2. 3 kV，電擊時間4 5 ms。電擊后迅速將菌體加入預冷1 mL的SOC培養(yǎng)基，150 r/min、3(TC培養(yǎng)1 h之后涂布于帶氨芐青霉素(amp)的LB培養(yǎng)基平板篩選出陽性轉化子大腸桿菌 NZmil (PKD46)。3、在LB培養(yǎng)基中加入10 mM的L-阿拉伯糖，于30°C下誘導質粒pKD46表達出λ
重組酶，制成電轉感受態(tài)。4、以兩側帶有FRT位點的安普霉素抗性基因為模板，利用高保真PCR擴增系統(tǒng)，以質粒PIJ773為模板，并設計兩端帶有PPC同源片段的擴增引物，擴增出線性DNA同源片段， 引物序列如下
上游帶同源臂引物Η1-Ρ1，下劃線為同源片段
5' -ATGAACGAACAATATTCCGCATTGCGTAGTAATGTCAGTATGCTCGGCATTCCGGGGATCCGTCGAC C-3，。下游帶同源臂引物Η2-Ρ2，下劃線為同源片段
5， -AGCACGAGGGTTTGCAGAAGAGGAAGATTAGCCGGTATTACGCATACCTGTAGGCTGGAGCTGCTT C-3，。反應體系帶同源臂的上下游引物(100 pmol/yL)各0.5 yL;模板DNA(100 ng/ μ L) 0.5 μ L ； 10 X buffer 5 μ L ； dNTPs (10 mM)各 1 μ L ;DMS0 (100%) 2.5 μ L ； Pyrobest DNA 聚合酶(2. 5 U/ μ L) 1 μ L ；ddH20 36/35. 5 μ L ；總體積 50 μ L。反應條件94°C，2min ； (94°C 45 sec ；50°C 45 sec ；72°C 90 sec;10 個循環(huán))； (94°C 45 sec ；50°C 45 sec ；72°C 90 sec;15 個循環(huán))；72°C，5 min。線性DNA片段的鑒定如圖2。
5、電轉線性DNA片段至已誘導表達λ重組酶的大腸桿菌NZWll (pKD46)感受態(tài)， 并涂布于帶安普霉素的LB平板篩選出陽性重組子，并進行了 PCR鑒定，電泳圖如圖3所示。6、陽性重組子制成感受態(tài)后倒入能誘導表達FLP重組酶的質粒PCP20，于42°C熱激表達FLP重組酶后即可消除安普霉素抗性。利用一對平板，進行平行點樣，能夠在無抗性平板上生長，但不能在抗性平板上生長的均極為已經敲除抗性的菌株。實施例2
本實施例說明構建過量共表達磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和煙酸磷酸核糖轉移酶的表達質粒，恢復重組菌株在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力，得到菌株federidia coli BA205的方法。1、構建pTrc99a_/7d質粒，其過程包括 (1)合成帶有SacI和Xba I酶切位點的引物，
上游引物5’ - CGAGCTCATGAACTCAGTTGATTTGACCG -3，。下游引物5，-GCTCTAGAGCATTCCGTCAATTAAAACAAG -3，。(2)以Bacillus subtil is基因組DNA為模板，PCR擴增目的基因片段，反應條件為94°C，5 min ； (94°C 45 s，53°C 45 s，72°C 100 s, ；35 個循環(huán))；72°C，10 min。純化擴增出的Pd基因后，表達質粒用pTrc99a分別用feci和損al雙酶切、連接獲得重組質粒 pTrc99a_/ d2、過量共表達磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和煙酸磷酸核糖轉移酶的表達質粒，其過程包括
(1)合成上下游引物都帶有/ ^ III酶切位點的引物， 上游引物5’ - CCCAAGCTTATGACACAATTCGCTTCTCCTG-3，。下游引物5，-CCCAAGCTTCACTTGTCCACCCGTAAATGG-3，。(2)以大腸桿菌K12系列為模板，PCR擴增目的基因片段，反應條件為94°C，5 min ； (940C 45 s，55°C 45 s，72°C 1 min, ；35 個循環(huán))；72°C，10 min。純化擴增出的召基因后，質粒pTrc99a-/ d用Hind III單酶切、連接獲得重組質粒pTrc99a-/7d-/7/ c召。
3、將質粒pTrc99a_/7d -pncB導入實施例1的同時缺乏IdhA、pflB和ppc的感受態(tài)菌株，獲得的陽性轉化子即為本發(fā)明的新構建菌株^scAericAia coli BA205。實施例3
本實施例說明過量共表達新構建的重組大腸菌株federicAia coli BA205與實施例 1得到的消除安普霉素抗性菌株的NAD(H)總量及NADH/NAD+比例的比較，及兩者發(fā)酵過程中耗糖及產酸能力的對比。當導入質粒pTrcma-pck-pncB后，消除安普霉素抗性菌株過量共表達磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和煙酸磷酸核糖轉移酶恢復了厭氧條件下重組菌的氧化還原平衡， NAD(H)的總量有明顯的提高，同時也恢復了厭氧條件下代謝葡萄糖的能力，同時主要的產物是丁二酸，無甲酸和乳酸的積累。將大腸埃希氏菌BA205按1%(ν/ν)接種量接種入有氧階段發(fā)酵培養(yǎng)基中有氧培養(yǎng)，當有氧培養(yǎng)菌體OD6tltl至0. 4 0. 6用0. 3 mM的IPTG誘導至0D6(1(1=3時，按接種量10% 轉接至厭氧階段發(fā)酵培養(yǎng)基中厭氧發(fā)酵。其中所述的有氧階段發(fā)酵培養(yǎng)基是現(xiàn)有技術中有氧培養(yǎng)產丁二酸大腸桿菌的常規(guī)培養(yǎng)基；本實施例中的培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基。所述的厭氧階段發(fā)酵培養(yǎng)基是以葡萄糖為碳源的產丁二酸大腸桿菌用發(fā)酵培養(yǎng)基。本實施例中的培養(yǎng)基如下。厭氧血清瓶發(fā)酵用培養(yǎng)基為LB+葡萄糖(20g/L) +堿式碳酸鎂0. 48g+ +Amp (氨芐青霉素 50 μ g/mL) +0. 3mM IPTG+0. 5mM NA (煙酸)。厭氧血清瓶培養(yǎng)后各種參數(shù)的測定結果見表1。表1厭氧血清瓶培養(yǎng)后各種參數(shù)的測定結果
權利要求
1.一株產丁二酸基因工程菌菌株，其分類命名為大腸埃希氏菌BA205 ^Escherichia coli BA205)，其保藏登記號為 CCTCC M 2011447。
2.權利要求1所述的大腸埃希氏菌BA205的構建方法，其特征在于其特征在于以缺乏乳酸脫氫酶基因，丙酮酸甲酸裂解酶基因活性的菌株大腸桿菌為出發(fā)菌株，利用同源重組技術敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，并過量共表達磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和煙酸磷酸核糖轉移酶后，得到能夠高效利用葡萄糖生長并產丁二酸大腸埃希氏菌BA205。
3.根據(jù)權利要求1所述的大腸埃希氏菌BA205的構建方法，其特征在于具體構建步驟如下(1)以缺乏乳酸脫氫酶基因，丙酮酸甲酸裂解酶基因活性的五coliNZmil菌株為出發(fā)菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，得到同時缺乏7o^、/7/7i 和PPC的感受態(tài)菌株；(2)合成一對5’端帶有酶切位點的引物，以Bacillussubtil is基因組DNA為模板，純化擴增出的Pd基因后，表達質粒pTrC99a用與引物所設計的酶切位點一致的酶雙酶切、連接獲得重組質粒pTrc99a-/7d ；(3)合成一對5’端帶有相同酶切位點的引物，以大腸桿菌K12基因組DNA為模板，純化擴增出的/^M基因后，已構建的重組質粒pTrC99a-/x^用與引物所設計的酶切位點一致的酶單酶切、連接獲得重組質粒識Tc^^a-pck-pncB ；(4)將重組質粒pTrc99a-/7d-/7/7Ci 導入步驟(1)得到的感受態(tài)菌株，獲得陽性轉化子；(5)利用步驟(4)的陽性轉化子過量共表達磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和煙酸磷酸核糖轉移酶，恢復其在厭氧條件下代謝葡萄糖的能力，得到高效利用葡萄糖代謝產丁二酸基因工程菌大腸埃希氏菌BA205。
4.利用權利要求1所述的大腸埃希氏菌BA205發(fā)酵生產丁二酸的方法，其特征在于采用兩階段發(fā)酵方式，有氧階段提高生物量，厭氧階段發(fā)酵產酸。
5.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于將大腸埃希氏菌BA205按1%(ν/ν)接種量接種入有氧階段發(fā)酵培養(yǎng)基中有氧培養(yǎng)，當有氧培養(yǎng)菌體0D_至0. 4 0. 6用0. 3 mM的 IPTG誘導至0D_=3時，按接種量10%轉接至厭氧階段發(fā)酵培養(yǎng)基中厭氧發(fā)酵。
6.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于所述的厭氧階段發(fā)酵培養(yǎng)基是以葡萄糖為碳源的產丁二酸大腸桿菌用發(fā)酵培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程技術領域，涉及利用葡萄糖產丁二酸的基因工程菌株及其發(fā)酵產酸方法。本發(fā)明的產丁二酸基因工程菌菌株分類命名為大腸埃希氏菌BA205，其保藏號登記號為CCTCCNOM2011447。其構建過程主要以缺乏乳酸脫氫酶(LDH)基因，丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因活性的菌株大腸桿菌為出發(fā)菌株，利用同源重組技術敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因，并過量共表達磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和煙酸磷酸核糖轉移酶后，大幅度提高了丁二酸的合成效率。其發(fā)酵方法采用兩階段發(fā)酵方式，有氧階段提高生物量，厭氧階段發(fā)酵產酸。
文檔編號C12N15/09GK102533626SQ20111041313
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月13日 優(yōu)先權日2011年12月13日
發(fā)明者劉嶸明, 姜岷, 張常青, 梁麗亞, 歐陽平凱, 茍冬梅, 陳可泉, 韋萍, 馬江鋒 申請人:南京工業(yè)大學