專(zhuān)利名稱(chēng)：一種人白細(xì)胞介素29的變異體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種畢赤酵母制備重組人白細(xì)胞介素四變異體的方法及其重組工程菌。屬于生物工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
人白細(xì)胞介素^(interleukin 29，IL-29)是近年發(fā)現(xiàn)的一種新的細(xì)胞因子， 其結(jié)構(gòu)和功能與I型干擾素(interferon，IFN)相似，因此又稱(chēng)為IFN-λ 1 (Sh印pard P， Kindsvogel W, Xu W, et al. (2003)IL-28, IL_29and tneir class II cytokine receptor IL-28R. Nature Immunol. 4(1) :63-68 ；Kotenko SV,Gallagber G,Baurin W,et al. (2003) IFN-Xs mediate antiviral protection through a distinct class II cytoKine receptor complex. Nature Immunol.4 (1) :69-77)。人IL-四基因定位于19號(hào)染色體長(zhǎng)臂(19ql3. 13)，包含5個(gè)外顯子，其基因結(jié)構(gòu)與IL-IO家族成員的基因結(jié)構(gòu)相似，但與I型干擾素的基因結(jié)構(gòu)(只含一個(gè)外顯子) 有明顯差異(Onoguchi K, Yoneyama M, Takemura A, et al. (2007)Viral infections activate types I and III interferon genes through a common mechanism. J Biol Chem. 282 (10) :7576-7581)。IL-29 的 mRNA 全長(zhǎng) 856bp，其開(kāi)放讀碼框?yàn)?603bp,編碼的蛋白質(zhì)肽鏈含200個(gè)氨基酸殘基，肽鏈氨基端的19個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成信號(hào)肽序列，因此，人 IL-29的成熟肽是含181個(gè)氨基酸殘基的多肽鏈。IL-四基因表達(dá)盒中啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)與I 型干擾素的非常相似，都包含與干擾素啟動(dòng)子結(jié)合蛋白3、干擾素啟動(dòng)子結(jié)合蛋白7的結(jié)合位點(diǎn)以及至少有ー個(gè)功能性的核因子κ B結(jié)合位點(diǎn)。人IL-四通過(guò)與細(xì)胞膜上的受體復(fù)合物結(jié)合，起始信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)和發(fā)揮生物學(xué)作用。IL-四和IL-觀共用ー個(gè)由ILj8Rl和IL-10R2組成的異ニ聚體受體復(fù)合物，其中 IL-28R1為結(jié)合亞基，IL-10R2為輔助亞基。ILj8Rl是IL-四和IL-28的共用受體中所特有的結(jié)合亞基，對(duì)IL-29的細(xì)胞應(yīng)答具有特異性，輔助亞基IL-10R2也是I型干擾素、 IL-10、IL-22和IL-26的受體組成部分，其在造血和非造血細(xì)胞中普遍表達(dá)，對(duì)IL-29的細(xì)胞應(yīng)答無(wú)特異性(Witte K, Gruetz G, Volk HD, et al. (2009)Despite IFN-Iambda receptor expression, blooa immune cells, but not keratmocytes or melanocytes, have an impaired response to type III interferons implications for therapeutic applications of these cytokines. Genes Immun. 10(8) :702-714)。人IL-29與I型干擾素共享相同的Jak-STAT信號(hào)傳導(dǎo)途徑，激活相同的 Jak-STAT (janus kinase-signal transducer of transcription)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進(jìn) ー組共同的基因表達(dá)。IL-四首先與其受體復(fù)合物形成II28R1-IL29-IL10R2三元絡(luò)合物，然后通過(guò)定位在細(xì)胞內(nèi)的兩條受體鏈轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，啟動(dòng)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使STAT1、STAT2、 STAT3、STAT4和STAT5的酪氨酸殘基磷酸化，然后促使ISGF3 (干擾素刺激基因幻進(jìn)入細(xì)胞核與ISRE (干擾素刺激應(yīng)答元件)相互作用，從而產(chǎn)生效應(yīng)(Zhou Ζ, Hamming 0J, Ank N, et al. (2007)Tvpe III interferon (IFN) induces a type I IFN-Iike responsem a restricted subset of cells througn signaling pathways involving both the Jak-STAT pathway and the mitogen-activated protein kinases. J Virol. 81 (14) 7749-7758)。因此，IL-四表現(xiàn)出ー些與I型干擾素相同的性質(zhì)，如抗病毒、抗增殖、體內(nèi)抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)活性。研究發(fā)現(xiàn)，人體表達(dá)ILjSRl的細(xì)胞譜系較少，人體不同器官的ILjSRl表達(dá)水平有明顯差異。在胃腸道、呼吸系統(tǒng)、心臟和ー些腺體細(xì)胞的IL-28R1高水平表達(dá)，而大腦細(xì)胞表達(dá)水平最低(Katrin W,Ellen ff,Robert S，et al. (2010) IL-28A，IL-28B，and IL-29 Promising cytokines with type I interieron-like properties.しytokine & wowth Factor Reviews. 21 (4) :237-251)。這種受體分布的組織差異性，提示IL-四的生物學(xué)作用具有較獨(dú)特的細(xì)胞靶向性，即IL-四作用的靶細(xì)胞呈局限性，由此可避免IL-四對(duì)多種細(xì)胞產(chǎn)生廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，從而有效的降低毒性作用。已有研究表明，對(duì)IL-28B肽鏈中的氨基酸殘基進(jìn)行誘變，可使IL-28B變異體的抗病毒活性發(fā)生顯著改變(Gad HH, Dellgren C，Hamming 0J, et al. (2009) Interferon{lambda}is functionally an interferon but structurally related to the interleukin-lOfamily. J. Biol. Chem. 284,20869-20875)。由于 IL-28B 與 IL-29 的同源性高達(dá)81%，而且兩者共用相同的受體，由此提示IL-四變異體具有潛在的臨床應(yīng)用前景，有希望研制開(kāi)發(fā)出臨床療效高而副作用比I型干擾素更小的新一代干擾素藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種利用酵母表達(dá)重組人IL-四變異體(hILj9t)的制備方法及其酵母工程菌。本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下(1)本發(fā)明的第一方面，提供ー種hIL-四變異體的重組真核表達(dá)載體，該載體是將pPIC9KM(源于hvitrogen公司，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室改造并已申請(qǐng)專(zhuān)利，申請(qǐng)?zhí)枮?201110410391.0)與本發(fā)明所述的hIL-四變異體編碼基因(SEQ ID No :1)經(jīng)過(guò)重組而獲得，該重組真核表達(dá)載體為pPIC9KM-hILj9t，如圖1所示；該重組載體表達(dá)的產(chǎn)物是肽鏈中有2個(gè)氨基酸殘基發(fā)生突變的hIL-四變異體(SEQ ID No 2)；而且，本發(fā)明將pPIC9KM 的α因子中的限制性?xún)?nèi)切酶》ιο I識(shí)別位點(diǎn)CTC GAG與蛋白酶Kex2的識(shí)別位點(diǎn)GAG AAA AGA (編碼產(chǎn)物為Glu-Lys-Arg)，通過(guò)PCR方法引入hIL-四變異體編碼基因(SEQ ID No 1)的氨基端，使該重組真核表達(dá)載體表達(dá)的hIL-四變異體(SEQ ID No:2)的肽鏈不會(huì)因引入限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)而增加額外的氨基酸殘基。(2)本發(fā)明的第二方面，提供一種表達(dá)人IL-四變異體的重組酵母工程菌GS115/ hILj9t，該工程菌是畢赤酵母GS115anvitrogen公司)被本發(fā)明所述的重組真核表達(dá)載體pPIC9KM-hIL-29t轉(zhuǎn)化而獲得，而且pPIC9KM中的信號(hào)肽基因序列與hIL-四變異體的編碼基因均已整合到該工程菌的基因組中，因此該工程菌可分泌性表達(dá)hIL-四變異體至培養(yǎng)液中。(3)本發(fā)明的第三方面，提供一種制備hIL-四變異體肽的方法，該方法包括以下步驟a)培養(yǎng)上述重組酵母工程菌，于培養(yǎng)液中添加0.5 (ν/ν)的甲醇為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)重組酵母工程菌表達(dá)hIL-四變異體；b)離心培養(yǎng)液去除菌體和不溶物，收集培養(yǎng)液上清經(jīng)過(guò)超濾濃縮和透析除鹽處理；c)除鹽后的培養(yǎng)上清用強(qiáng)陽(yáng)離子交換層析柱分離純化培養(yǎng)液中的hIL-四變異體，收集含有hIL-四變異體的洗脫液；d)將含有hIL-四變異體的洗脫液用分子篩層析方法進(jìn)ー步純化；e)用SDS-PAGE和Western blotting方法分析鑒定純化的hIL-四變異體。


圖1為重組真核表達(dá)質(zhì)粒pPIC9KM-hIL_29t的構(gòu)建圖譜圖2為人IL-四變異體編碼基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果圖3為重組真核表達(dá)質(zhì)粒pPIC9KM-hIL_29t的雙酶切鑒定結(jié)果圖4為純化的重組hIL-四變異體的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)ー步闡述本發(fā)明的操作方法，這些實(shí)施例僅用于詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中，所有PCR引物的合成和DNA序列的測(cè)定均由上海生エ生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成；所用的培養(yǎng)基如無(wú)特別說(shuō)明均按畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)anvitrogen公司)的配方進(jìn)行配制。實(shí)施例一、人IL-四變異體編碼基因的克隆1.設(shè)計(jì)和合成PCR引物根據(jù)GenBank中的人IL-四基因序列和pPIC9KM載體的α因子信號(hào)肽序列，用 Oligo 7軟件設(shè)計(jì)ー對(duì)特異性引物如下上游引物5，-CTCGAGAAAAGAGGCCCTGTCCCCACTTCC-3，下游引物5，-GCGGCCGCTCAGGTGGACTCAGGGTGG-3’；在上游引物中加入了限制性?xún)?nèi)切酶Bio I識(shí)別位點(diǎn)(CTCGAG)和蛋白酶Kex2的識(shí)別位點(diǎn)(GAGAAAAGA，編碼產(chǎn)物為Glu-Lys-Arg)，下游引物中加入了 Not I位點(diǎn)(GCGGCCGC)， 擴(kuò)增產(chǎn)物的大小約560bp。2.人IL-四變異體編碼基因的克隆用RNA提取試劑Trizol(BBI公司)按說(shuō)明書(shū)操作，從健康中國(guó)人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)提取細(xì)胞總RNA ；取提取的總RNA IyL作為模板，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaKa 公司)按說(shuō)明書(shū)操作，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增得到IL-四前體的cDNA ；反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，取反應(yīng)液 5μ L作為模板，用上述特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增IL-四變異體的編碼基因，反應(yīng)條件如下 940C 2min,94°C 30s — 58°C 30s — 72°C lmin,30 個(gè)循環(huán)，最后 72°C延伸 lOmin。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖2所示；用EZ-10柱式DNA回收試劑(BBI公司)回收純化約560bp的目的基因片段；將純化的目的基因片段于克隆載體pUCm-T(BBI公司)相連，構(gòu)建為重組質(zhì)粒并命名為pUCmj9t ；將重組質(zhì)粒pUCm-29t轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109， 接種于含IPTG和X-gaL的氨芐青霉素LB培養(yǎng)板，37°C培養(yǎng)16h，挑取陽(yáng)性菌落接種液體LB培養(yǎng)基擴(kuò)增，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如SEQ ID No:l所示。測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNAMAN 軟件分析并與GenBank中的人IL-29的cDNA序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示重組質(zhì)粒pUCm_29t 中的目的基因有2個(gè)堿基發(fā)生變異，這2個(gè)發(fā)生變異的堿基分別是第91位堿基由T (胸腺嘧啶)突變?yōu)镃 (胞嘧啶)，由該堿基組成的三聯(lián)體密碼由TTC突變?yōu)镃TC，該三聯(lián)體密碼編碼的第31位氨基酸殘基由苯丙氨酸(Wie)突變?yōu)榱涟彼?Leu)；第272位堿基由T(胸腺嘧啶)突變?yōu)镃 (胞嘧啶)，由該堿基組成的三聯(lián)體密碼由CTG突變?yōu)镃CG，該三聯(lián)體密碼編碼的第91位氨基酸殘基由亮氨酸(Leu)突變?yōu)楦彼?Pro)，如SEQ ID No 2所示。實(shí)施例ニ、構(gòu)建表達(dá)人IL-四變異體的重組真核表達(dá)載體取質(zhì)粒pUCm_29t和載體pPIC9KM(源于hvitrogen公司，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室改造并已申請(qǐng)專(zhuān)利，申請(qǐng)?zhí)枮?201110410391. 0)分別用限制性?xún)?nèi)切酶Xho I和Not I進(jìn)行雙酶切，回收約560bp的目的基因片段和載體pPIC9KM的大片段，用T4DNA連接酶(BBI公司)于16°C 水浴連接16h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109，接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)板， 37°C培養(yǎng)過(guò)夜，挑取陽(yáng)性菌落接種液體LB培養(yǎng)基擴(kuò)增，提取重組真核表達(dá)質(zhì)粒并命名為 pPIC9KM-hIL-29t ；用Xho I和Not I對(duì)重組真核表達(dá)質(zhì)粒pPIC9KM_hIL_29t進(jìn)行雙酶切鑒定，同時(shí)進(jìn)行測(cè)序鑒定，雙酶切鑒定結(jié)果如圖3所示，酶切出的大片段和小片段分別與載體 pPIC9KM和目的基因的大小相符合，測(cè)序結(jié)果證實(shí)pPIC9KM-hIL-29t中的人IL-四變異體的編碼基因序列與pUCmj9t中的完全一致。實(shí)施例三、重組真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母GS115及其高拷貝重組工程菌的篩選提取經(jīng)測(cè)序鑒定的pPIC9KM-hILj9t，用限制性?xún)?nèi)切酶Ml I酶切后，用0. 7%的瓊脂糖凝膠電泳分離并回收線性化的pPIC9KM-hIL-29t ；將線性化的pPIC9KM_hIL_29t與酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞混合后，按照畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)anvitrogen公司)的方法進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于不含His的MD培養(yǎng)板，30°C培養(yǎng)2 3天，挑選MD平板上生長(zhǎng)旺盛的優(yōu)勢(shì)菌落接種于含0. 5mg/mL G418的YPD平板，30°C培養(yǎng)2 3天，挑選生長(zhǎng)旺盛的優(yōu)勢(shì)菌落接種于含lmg/mL G418的YPD平板，30°C培養(yǎng)2 3天，如此重復(fù)培養(yǎng)并依次増加 G418濃度至％ig/mL，從含％ig/mL G418的YPD平板篩選得到高拷貝整合的畢赤酵母重組エ 程菌 GS115/hIL-29t。實(shí)施例四、人IL-四變異體的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及分析將重組工程菌GS115/hIL-29t接種BMGY培養(yǎng)基，于30°C、250rpm/min條件下振蕩培養(yǎng)至菌液0D600為2 3吋，轉(zhuǎn)換為BMMY培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每隔24h加入終濃度為1 % 的甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，連續(xù)培養(yǎng)96h，離心收集培養(yǎng)上清，先用SDS-PAGE檢測(cè)培養(yǎng)上清中hIL-四變異體的表達(dá)情況，然后用羊抗人IL-四多克隆抗體(R&D公司)進(jìn)行Western blotting 鑒定表達(dá)的hIL-四變異體。將培養(yǎng)上清先用截流分子量為IOkDa的超濾膜濃縮，再用 SP-Sepharose Fast Flow離子交換層析和kphadex G-75凝膠過(guò)濾層析純化，純化產(chǎn)物經(jīng) SDS-PAGE檢測(cè)和Wfestern blotting鑒定，SDS-PAGE結(jié)果顯示純化的重組hIL-四變異體為單ー蛋白條帶，其分子量為20kDa，如圖4所示；Western blotting結(jié)果顯示單一反應(yīng)條
市ο
權(quán)利要求
1.一種人白細(xì)胞介素四變異體的重組真核表達(dá)載體，其特征在干，所述的重組真核表達(dá)載體中插入了人白細(xì)胞介素四變異體的編碼基因。
2.如權(quán)利要求1所述的重組真核表達(dá)載體中的人白細(xì)胞介素四變異體的編碼基因，其 DNA的核苷酸序列對(duì)應(yīng)于序列表中的SEQ ID NO :1，該序列中第91位堿基由T (胸腺嘧啶) 突變?yōu)镃(胞嘧啶)，由該堿基組成的三聯(lián)體密碼由TTC突變?yōu)镃TC ；該序列中第272位堿基由T(胸腺嘧啶)突變?yōu)镃(胞嘧啶)，由該堿基組成的三聯(lián)體密碼由CTG突變?yōu)镃CG。
3.如權(quán)利要求1所述的重組真核表達(dá)載體中的人白細(xì)胞介素四變異體的編碼基因， 其編碼產(chǎn)物的氨基酸序列對(duì)應(yīng)于序列表中的SEQ ID NO :2，該序列中第31位氨基酸殘基由苯丙氨酸(Wie)突變?yōu)榱涟彼?Leu)、第91位氨基酸殘基由亮氨酸(Leu)突變?yōu)楦彼?(Pro)。
4.ー種重組畢赤酵母工程菌，其特征在干，所述的重組畢赤酵母的染色體中整合有權(quán)利要求1所述的人白細(xì)胞介素四變異體的編碼基因，并且分泌表達(dá)重組人白細(xì)胞介素四變異體至培養(yǎng)液中。
5.一種制備重組人白細(xì)胞介素四變異體的方法，其特征在干，包括步驟(1)用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液，培養(yǎng)權(quán)利要求4所述的重組畢赤酵母工程菌；(2)在培養(yǎng)液中添加適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)劑，誘導(dǎo)重組畢赤酵母工程菌分泌表達(dá)重組人白細(xì)胞介素四變異體；(3)從培養(yǎng)液中分離純化出重組畢赤酵母分泌表達(dá)的重組人白細(xì)胞介素四變異體。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在干，步驟(1)所用的培養(yǎng)液為BMGY培養(yǎng)液和 BMMY培養(yǎng)液；步驟(2)所用的誘導(dǎo)劑為甲醇，添加甲醇的終濃度為培養(yǎng)液體積的0. 5 1%; 步驟(3)所用的分離純化方法為先用強(qiáng)陽(yáng)離子型離子交換層析分離培養(yǎng)液中的重組人白細(xì)胞介素四變異體，再用凝膠過(guò)濾層析得到純化的重組人白細(xì)胞介素四變異體。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種重組人白細(xì)胞介素29(hIL-29)變異體的制備方法及表達(dá)重組hIL-29變異體的畢赤酵母工程菌。本發(fā)明的具體制備方法包括以下步驟1)人工合成引物；2)從健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)反轉(zhuǎn)錄PCR得到hIL-29變異體的編碼基因；3)構(gòu)建含有hIL-29變異體編碼基因的重組真核表達(dá)載體，融合于畢赤酵母表達(dá)調(diào)控元件獲得重組畢赤酵母工程菌；4)培養(yǎng)重組畢赤酵母工程菌，于培養(yǎng)液添加甲醇誘導(dǎo)畢赤酵母工程菌表達(dá)重組hIL-29變異體；5)采用離子交換層析和分子篩層析從培養(yǎng)液上清純化重組hIL-29變異體。本發(fā)明構(gòu)建的重組畢赤酵母工程菌可進(jìn)行高密度培養(yǎng)并且分泌型表達(dá)重組hIL-29變異體，適用于工業(yè)化制備重組人白細(xì)胞介素29變異體。
文檔編號(hào)C12N1/19GK102559737SQ201110413170
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2011年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月13日
發(fā)明者于明磊, 吳靜, 鄔敏辰, 郁心, 鄭海軍, 陸源, 陳偉 申請(qǐng)人:江南大學(xué)