專利名稱：一種重組E.coli Klenow酶的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物酶的純化方法，特別涉及一種重組E.coli Klenow片段的純化。
背景技術(shù)：
Klenow 片段(克列諾片段，Klenow fragment,或稱克列諾酶,Klenow enzyme),分子量66 68KD，是E.coli DNA聚合酶I經(jīng)胰蛋白酶或枯草桿菌蛋白酶部分水解生成的C末端605個(gè)氨基酸殘基片段。Klenow作為分子生物學(xué)的工具酶，應(yīng)用十分廣泛，主要為:1)補(bǔ)平由限制性內(nèi)切核酸酶消化產(chǎn)生的3'凹端；2)通過(guò)放射性dNTP的摻入標(biāo)記DNA片段的3'端；3)用隨機(jī)引物法標(biāo)記單鏈DNA ；4)用引物延伸法合成單鍵探針。因此Klenow片段具有較高的市場(chǎng)價(jià)值,但國(guó)內(nèi)生產(chǎn)的Klenow片段品質(zhì)普遍不高，表現(xiàn)為蛋白純度較低，一般小于90%，含有干擾酶活的雜質(zhì)，使用此類酶可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的失敗。國(guó)外公司生產(chǎn)的Klenow片段品質(zhì)較高，但其生產(chǎn)工藝繁瑣，成本較高，售價(jià)昂貴。1991年美國(guó)學(xué)者Ca therrine M.Joyce報(bào)導(dǎo)的Klenow純化方法包括:破菌、50%鹽析、85%鹽析、Mono Q離子交換層析、Phenyl-Superose疏水層析、Superose 12凝膠層析，其中的Phenyl純化步驟主要用來(lái)去除微量的核酸酶。1993年美國(guó)學(xué)者VictoriaDerbyshire報(bào)道Klenow純化方法包括了類似的步驟:破菌、40%鹽析、85%鹽析、Mono Q離子交換層析、Phenyl-Superose疏水層析、Superose 12凝膠層析，僅第一級(jí)鹽析的飽和度略有調(diào)整。1997年Yang Xu也采用了類似的純化工藝。目前國(guó)外大公司生產(chǎn)Klenow的純化一直沿用此類純化方法，即破菌、兩步鹽析、離子層析、疏水層析、凝膠層析。為達(dá)到酶的商品濃度，常常還需要增加濃縮步驟，并且需要透析或超濾等方法將酶更換至相應(yīng)的儲(chǔ)液buffer，這進(jìn)一步增加了工藝的復(fù)雜性和高成本性。因此建立簡(jiǎn)便、快速、高質(zhì)量、低成本的工業(yè)化可行的Klenow純化方法是十分必要的。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明提供了一種重組E.coli Klenow片段的純化方法。此方法具有工藝簡(jiǎn)便、快速，獲得的Klenow片段質(zhì)量高、成本低的特點(diǎn)，十分適合工業(yè)放大生產(chǎn)。本發(fā)明采用以下的技術(shù)方案:一種重組E.coli Klenow片段的純化方法，由以下步驟組成:I)破菌表達(dá)重組E.coli Klenow片段的菌體，以1: 5 20的比例加入破菌buffer,攪拌10 20min使之混合均勻，在4 10°C下破碎菌體10 20min，再將得到的破菌液在10000 20000g下離心10 20min，溫度控制在O 10°C，取其上清液；其中破菌緩沖液為20 50mM Tris-HCl,pH7.5 8.5、0.I 5mMEDTA、0.5 IMNaCl、溶菌酶(λ 5 2mg/ml、加入 PMSF 至(λ 02 ImM ;所述破菌步驟中，是用超聲或高壓均質(zhì)的方法進(jìn)行破菌，對(duì)于破菌規(guī)模大于200ml優(yōu)選高壓均質(zhì)法，具體是:將菌體和破菌buffer的混合液放入高壓均質(zhì)機(jī)中，在O 10°C、工作壓力為500 800bar時(shí)均質(zhì)2 3遍。小體積可以選擇超聲法，具體是將菌體和破菌buffer的混合液放入超聲設(shè)備中，超聲5 10s，停10 20s，共超聲10 20min，此超聲方法建議體積小于0.2L時(shí)使用。2)兩步鹽析第一步鹽析的飽和度為40 50%，具體操作為:先將硫酸銨鹽用研缽研碎，向破菌上清液中緩慢加入，及時(shí)攪拌，確保不會(huì)出現(xiàn)局部濃度過(guò)高，加入的比例為IOOml破菌上清液加入22.6 29.1g硫酸銨，沉淀溫度控制在O 10°C，時(shí)間大于2h，然后在10000 20000g下離心10 20min，離心溫度控制在O 10°C，留取上清；第二步鹽析的飽和度為80 85%,具體操作為:先將硫酸銨鹽用研缽研碎，向一級(jí)鹽析上清中一次性加入，攪拌至完全溶解，加入比例為IOOml破菌上清液加入51.6 55.9g硫酸銨，沉淀溫度為O 10°C，時(shí)間大于2h，最好過(guò)夜，這樣可以充分沉淀目的蛋白，提高收率且便于離心澄清，然后在10000 20000g下離心10 20min，溫度為O 10°C，也可以將離心沉淀按金屬螯合層析每批處理量分裝并冷凍保存。4)金屬螯合親和層析 金屬螯合層析柱高為2.5 15cm，用緩沖液I平衡色譜柱3 5CV，上樣量為每ml填料上樣菌體蛋白100 300mg，上樣線性流速為30 120cm/h，洗脫線性流速為100 300cm/h，上樣后沖洗5 10CV，UV280洗至基線，緩沖液II洗脫雜蛋白5 10CV，UV280洗至基線，緩沖液III洗脫目的蛋白，收集UV280大于IOOmAu組分；其中緩沖液I 為 20 50mM Tris-HCl,pH7.5 8.5、0.5 IM NaCl、5 IOmM 咪唑；緩沖液 II 為 20 50mM Tris-HCl, pH7.5 8.5,0.5 IM NaCl、40 60mM 咪唑；緩沖液 III 為 20 50mM Tris-HCl, pH7.5 8.5,0.5 IM NaCl、250 350mM 咪唑。所述金屬螯合親和層析步驟中介質(zhì)配基為亞氨基二乙酸(IDA)或次氮基三乙酸(NTA)，優(yōu)選為亞氨基二乙酸(IDA)。由于NTA的載量相對(duì)較低，所以使用IDA更經(jīng)濟(jì)，GE公司生產(chǎn)的Ni Sepharose HP、Ni Sepharose FF比較適合,其可重復(fù)使用,Ni離子脫落較少，選擇性高，廣泛用于組氨酸標(biāo)簽蛋白的純化。Ni Sepharose HP填料顆粒平均34 μ m,分辨率略高于Ni Sepharose FF，流速反壓與Ni Sepharose FF無(wú)明顯差異，但需要樣品較澄清，否則色譜柱堵塞明顯，柱壓上升加快；放大生產(chǎn)選擇Ni Sepharose FF較理想，可以降低成本,對(duì)上樣樣品澄清度要求也相對(duì)低。所述金屬螯合親和層析步驟中柱高為2.5 15cm，柱床過(guò)高，柱壓明顯，影響上樣、洗脫流速，過(guò)低影響分離效果；上樣線性流速為30 120cm/h,優(yōu)選為60 100cm/h,這樣可以確保蛋白與填料的充分吸附；洗脫線性流速為100 300cm/h,優(yōu)選為100 150cm/h，上樣、洗脫時(shí)色譜柱壓力控制在0.4MPa以下，防止色譜柱床壓塌；上樣量為每ml填料上樣菌體蛋白100 300mg (Bradford法檢測(cè))，優(yōu)選為100 200mg,上樣量過(guò)高會(huì)降低分辨率，目的蛋白穿透，收率降低，產(chǎn)品純度下降。4)凝膠過(guò)濾層析凝膠柱高度為50 70cm，上樣量為I % 5%，色譜過(guò)程中溫度維持在4 10°C，上樣流速10 30cm/h，洗脫流速20 60cm/h，收集UV280大于150mAu樣品；所述凝膠過(guò)濾層析步驟中，在上樣前色譜柱先用無(wú)菌水沖洗I 3CV，buffer平衡2 3CV，至UV280洗脫至基線，使電導(dǎo)、PH穩(wěn)定；其中凝膠過(guò)濾buffer為2倍濃度的NEB酶儲(chǔ)液buffer，成分為50mM Tris-HCl (pH7.4) ,0.2mM EDTA, 2mM DTT。凝膠過(guò)濾層析介質(zhì)可選擇的范圍十分廣泛，GE公司生產(chǎn)的此類介質(zhì)理化性質(zhì)穩(wěn)定，分離度高，優(yōu)選GE公司生產(chǎn)的介質(zhì)，介質(zhì)種類可以選擇Superdex 200、Sepharcyl200HR、Superose 12pg、Sepharose6FF,綜合考慮分離度、成本，優(yōu)選 Sephacryl 200HR,既可以實(shí)現(xiàn)目的蛋白與微量核酸酶雜質(zhì)的有效分離，又可以實(shí)現(xiàn)成本最低，利于放大。本發(fā)明的方法中為避免外源核酸酶的污染，所有緩沖液、接觸樣品的容器、吸頭等物品需要高壓滅菌，色譜系統(tǒng)的管路、分子篩凝膠柱需要0.1 0.5M NaOH處理Ih以上，金屬螯合層析柱需要4 6M鹽酸胍處理Ih以上。如果本發(fā)明的方法用于生產(chǎn)制備重組E.coli Klenow片段，則制備工藝中還應(yīng)包括質(zhì)檢、制劑及分裝步驟，具體為:將凝膠過(guò)濾層析收集的樣品加入等體積甘油在_20°C保存，Bradford法檢測(cè)蛋白濃度，Klenow片段活測(cè)定方法可參考NEB商品酶，根據(jù)濃度、活性計(jì)算比活，按照NEBKlenow商品酶的DNA內(nèi)、外切酶檢測(cè)方法對(duì)我們的終產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)。SDS-PAGE檢測(cè)蛋白純度。在百級(jí)層流下,根據(jù)需要的酶活性加入稀釋buffer,稀釋buffer為I倍的酶儲(chǔ)buffer，成分為 25mM Tris-HCl (pH 7.4)，0.1mM EDTA, ImM DTT，50%甘油，稀釋過(guò)程中溫度維持在O 10°C。稀釋樣品0.22 um無(wú)菌濾膜過(guò)濾，無(wú)菌連續(xù)分液器在百級(jí)層流下進(jìn)行分裝。分裝用離心管需經(jīng)滅菌處理，分裝過(guò)程中溫度維持在O 10°C，分裝樣品-20°c凍存。本發(fā)明與文獻(xiàn)中提到的方法相比，具有以下優(yōu)點(diǎn):(I)金屬螯合層析屬于親和層析,選擇性、蛋白載量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Q、Phenyl層析，IOmlNi柱即可處理5L發(fā)酵菌體蛋白，洗脫蛋白純度明顯高于文獻(xiàn)方法。(2)因金屬螯合層析洗脫蛋白濃度較高，可到達(dá)10mg/ml以上，滿足凝膠層析上樣蛋白濃度要求，凝膠層析洗脫蛋白濃度大于商品所需濃度，不需增加濃縮步驟，凝膠柱洗脫樣品buffer即為2倍濃度的儲(chǔ)液Buffer,加入等體積甘油相應(yīng)稀釋即可,無(wú)需進(jìn)行透析步驟，大大簡(jiǎn)化了工藝，降低了成本，提高了收率。。(3)建立了穩(wěn)定可靠核酸酶去除工藝，使得終產(chǎn)品DNA內(nèi)切酶、外切酶等檢測(cè)指標(biāo)達(dá)到了商品酶的水平；(4)凝膠過(guò)濾層析后蛋白純度大于95%,好于NEB、Fermentas等進(jìn)口酶的純度(大于90% ),比活類似于NEB酶；(5)工藝銜接便捷，兩步鹽析后沉淀進(jìn)行分裝凍存，長(zhǎng)時(shí)間保持活性，每次生產(chǎn)只需取出所需量的鹽析沉淀即可；(6)工藝用時(shí)短，從Ni柱親和層析到制劑分裝，可在一天內(nèi)完成。(8)工藝收率高，Ni柱收率在90%以上，凝膠層析收率在85%以上，全工藝收率在70%以上。


附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說(shuō)明書(shū)的一部分，與本發(fā)明的實(shí)施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中:圖1是本發(fā)明實(shí)施例1的Klenow Ni柱親和層析色譜圖；圖2是本發(fā)明實(shí)施例1的Klenow鹽析、金屬螯合層析SDS-PAGE電泳圖；圖3是本發(fā)明實(shí)施例1的Klenow S200柱親和層析色譜圖；圖4是本發(fā)明實(shí)施例1的Klenow S200層析SDS-PAGE電泳；圖5是本發(fā)明實(shí)施例1的Klenow內(nèi)切酶檢測(cè)結(jié)果
具體實(shí)施例方式本發(fā)明Klenow Fragment gene 基因序列:
ATGGTGATTTCTTATGACAACTACGTCACCATCCTTGATGAAGAAACACTGAAAGCGTGGATTGCGAAGCTGGAAAMGCGCCGGTATTTGCATTTGATACCGAAACCGACAGCCTTGATAACATCTCTGCTAACCTGGTCGGGCTTTCTTTTGCTATCGAGCCAGGCGTAGCGGCATATATTCCGGTTGCTCATGATTATCTTGATGCGCCCGATCAAATCTCTCGCGAGCGTGCACTCGAGTTGCTAAAACCGCTGCTGGAAGATGAAAAGGCGCTGAAGGTCGGGCAAAACCTGAAATACGATCGCGGTATTCTGGCGAACTACGGCATTGAACTGCGTGGGATTGCGTTTGATACCATGCTGGAGTCCTACATTCTCAATAGCGTTGCCGGGCGTCACGATATGGACAGCCTCGCGGAACGTTGGTTGAAGCACA AAACCATCACTTTTGAAGAGATTGCTGGTAAAGGCAAAAATCAACTGACCTTTAACCAGATTGCCCTCGAAGAAGCCGGACGTTACGCCGCCGAAGATGCAGATGTCACCTTGCAGTTGCATCTGAAAATGTGGCCGGATCTGCAAAAACACAAAGGGCCGTTGAACGTCTTCGAGAATATCGAAATGCCGCTGGTGCCGGTGCTTTCACGCATTGAACGTAACGGTGTGAAGATCGATCCGAAAGTGCTGCACAATCATTCTGAAGAGCTCACCCTTCGTCTGGCTGAGCTGGAAAAGAAAGCGCATGAAATTGCAGGTGAGGAATTTAACCTTTCTTCCACCAAGCAGTTACAAACCATTCTCTTTGAAAAACAGGGCATTAAACCGCTGAAGAAAACGCCGGGTGGCGCGCCGTCAACGTCGGAAGAGGTACTGGAAGAACTGGCGCTGGACTATCCGTTGCCAAAAGTGATTCTGGAGTATCGTGGTCTGGCGAAGCTGAAATCGACCTACACCGACAAGCTGCCGCTGATGATCAACCCGAAAACCGGGCGTGTGCATACCTCTTATCACCAGGCAGTAACTGCAACGGGACGTTTATCGTCAACCGATCCTAACCTGCAAAACATTCCGGTGCGTAACGAAGAAGGTCGTCGTATCCGCCAGGCGTTTATTGCGCCAGAGGATTATGTGATTGTCTCAGCGGACTACTCGCAGATTGAACTGCGCATTATGGCGCATCTTTCGCGTGACAAAGGCTTGCTGACCGCATTCGCGGAAGGAAAAGATATCCACCGGGCAACGGCGGCAGAAGTGTTTGGTTTGCCACTGGAAACCGTCACCAGCGAGCAACGCCGTAGCGCGAAAGCGATCAACTTTGGTCTGATTTATGGCATGAGTGCTTTCGGTCTGGCGCGGCAATTGAACATTCCACGTAAAGAAGCGCAGAAGT ACATGGACCTTTACTTCGAACGCTACCCTGGCGTGCTGGAGTATATGGAACGCACCCGTGCTCAGGCGAAAGAGCAGGGCTACGTTGAAACGCTGGACGGACGCCGTCTGTATCTGCCGGATATCAAATCCAGCAATGGTGCTCGTCGTGCAGCGGCTGAACGTGCAGCCATTAACGCGCCAATGCAGGGAACCGCCGCCGACATTATCAAACGGGCGATGATTGCCGTTGATGCGTGGTTACAGGCTGAGCAACCGCGTGTACGTATGATCATGCAGGTACACGATGAACTGGTATTTGAAGTTCATAAAGATGATGTTGATGCCGTCGCGAAGCAGATTCATCAACTGATGGAAAACTGTACCCGTCTGGATGTGCCGTTGCTGGTGGAAGTGGGGAGTGGCGAAAACTGGGATCAGGCGCACTAA蛋白序列:MVISYDNYVTILDEETLKAWIAKLEKAPVFAFDTETDSLDNISANLVGLSFAIEPGVAAYIPVAHDYLDAPDQISRERALELLKPLLEDEKALKVGQNLKYDRGILANYGIELRGIAFDTMLESYILNSVAGRHDMDSLAERWLKHKTITFEEIAGKGKNQLTFNQIALEEAGRYAAEDADVTLQLHLKMWPDLQKHKGPLNVFENIEMPLVPVLSRIERNGVKIDPKVLHNHSEELTLRLAELEKKAHEIAGEEFNLSSTKQLQTILFEKQGIKPLKKTPGGAPSTSEEVLEELALDYPLPKVILEYRGLAKLKSTYTDKLPLMINPKTGRVHTSYHQAVTATGRLSSTDPNLQNIPVRNEEGRRIRQAFIAPEDYVIVSADYSQIELRIMAHLSRDKGLLTAFAEGKDIHRATAAEVFGLPLETVTSEQRRSAKAINFGLIYGMSAFGLARQLNIPRKEAQKYMDLYFERYPGVLEYMERTRAQAKEQGYVETLDGRRLY LPDIKSSNGARRAAAERAAINAPMQGTAADIIKRAMIAVDAWLQAEQPRVRMIMQVHDELVFEVHKDDVDAVAKQIHQLMENCTRLDVPLLVEVGSGENWDQAH上游引物:5'-GGCAAATTCATATGGTGATTTCTTATGAC-3'下游引物: 5'-CCAGGATCCTTAGTGCGCCTGATC-3'構(gòu)建方法:1.使用上下游引物PCR獲得目的片段；2.NdeI及BamHI雙酶切目的基因及pet 15b質(zhì)粒載體；3.連接載體及目的基因、轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α菌株；4.測(cè)序正確后提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)載體大腸桿菌BL21 (DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)成功后進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵。發(fā)酵過(guò)程大腸桿菌BL21 (DE3)pET15b菌種發(fā)酵采用三級(jí)發(fā)酵一級(jí)種子培養(yǎng)基(LB):
蛋白胨 1% 酵母粉 0.5% 氯化鈉 0.5%
氨芐0.1 mg/ml原始菌種接種過(guò)夜培養(yǎng)培養(yǎng)條件:溫度為37°C，220rpm二級(jí)種子培養(yǎng)基(LB)
蛋白胨 1% 酵母粉 0.5% 氯化鈉 0.5%
氨芐0.1 mg/ml1% -10%接種培養(yǎng)至 0D600 為 0.5-1.0培養(yǎng)條件:溫度為37°C，220rpm發(fā)酵培養(yǎng)基:胰蛋白胨1.6% 酵母粉1.0% 氯化鈉0.5% 三水嶙酸氫二鉀1.4% 嶙酸二氫鉀0.52%補(bǔ)料成分:
酵母粉3% 胰蛋白胨6% 葡萄糖40% NaCl0.5%按5% 10%接種，溫度為37°C，pH控制在7.0，通過(guò)攪拌，通氣和灌壓控制溶氧保持在30% 60%，后期通過(guò)補(bǔ)料控制溶氧保持在30% 60%，當(dāng)0D600為10 20開(kāi)始誘導(dǎo)，加入IPTG至終濃度為0.2 0.5mM，誘導(dǎo)時(shí)間3 5h，誘導(dǎo)溫度為37°C，可獲得發(fā)酵液，在5000rpm離心20分鐘，收獲菌體180 250g。結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明。實(shí)施例1 3L發(fā)酵液離心獲得190g菌體，加入破菌緩沖液950ml (菌體和破菌緩沖液的比例為 I: 5)，其中破菌緩沖液為 20mM Tris-HCl, pH7.5,0.1mM EDTA、0.5M NaCl、溶菌酶
0.5mg/ml、0.02mM PMSF，攪拌IOmin使之混合均勻，溫控操作溫度為4°C，通過(guò)高壓均質(zhì)的方法裂解菌體，即將混合液體600bar，4°C下勻質(zhì)2遍，IOOOOg 4°C離心10分鐘，獲得951ml
破菌上清液。事先將214g硫酸銨用研缽研碎，向破菌上清液中邊攪拌邊緩慢加入(40%飽和度)，確保不會(huì)出現(xiàn)局部濃度過(guò)高，沉淀溫度控制在4°C，沉淀時(shí)間為2h，IOOOOg離心15min，離心溫度為4°C。將520g硫酸銨鹽用研缽研碎，向一級(jí)鹽析上清中一次性加入(80%飽和度)，攪拌至完全溶解，沉淀淀溫度為4°C，沉淀時(shí)間為2h，IOOOOg離心15min，離心溫度為4°C。離心獲得的鹽析沉淀銨等分8份，每份相當(dāng)約20g菌體來(lái)源的蛋白量，_20°C長(zhǎng)期凍存，鹽析收率為 95%。金屬螯合層析的介質(zhì)配基是Ni2+-1DA,為GE公司生產(chǎn)的Ni Sepharose HP5ml (2*2.5cm)，金屬螯合層析用緩沖液I平衡色譜柱3CV，上樣后沖洗5CV，UV280吸收洗至基線，其中緩沖液I為20mMTris-HCl，pH7.5、0.5M NaCl、5mM咪唑；用緩沖液II洗脫雜蛋白，用量8CV，UV280吸收洗至基線，其中緩沖液II為20mM Tris-HCl，pH7.5、0.5MNaCl、40mM咪唑；用緩沖液III洗脫目的蛋白，收集UV280吸收大于IOOmAu組分，其中緩沖液 III 為 20mM Tris-HCl, ρΗ7.5、0.5M NaCl、250mM 咪唑；上樣流速 2ml/min(線性流速為60cm/h),洗脫流速3.4ml/min (線性流速為100cm/h),上樣量為每ml填料上樣菌體蛋白IOOmg (Bradford法檢測(cè))，此步收率為94%。色譜過(guò)程中溫度維持在4°C。Sephacryl S-200HR 色譜柱(26*60cm)0.5M NaOH 處理 2CV，填料、系統(tǒng)、管路接觸堿2h，以確保所有接觸蛋白的表面內(nèi)切酶完全滅活。上樣前色譜柱用無(wú)菌水沖洗I 3CV, buffer平衡2 3CV，至UV280洗脫至基線，電導(dǎo)、pH穩(wěn)定，取金屬螯合柱洗脫蛋白5ml (1.7%凝膠柱體積)上樣,上樣流速lml/min (線性流速12cm/h),洗脫流速2ml/min (線性流速24cm/h)，收集UV280大于150mAu樣品，此步收率87%。收集容器及期間取樣容器均需滅菌處理，色譜過(guò)程中溫度維持在4°C。凝膠過(guò)濾buffer為2倍濃度的NEB酶儲(chǔ)液buffer,成分為50mMTris_HCl (pH7.4) ,0.2mM EDTA, 2mM DTT。凝膠過(guò)濾層析收集樣品，加入等體積甘油_20°C暫時(shí)保存，Bradford法檢測(cè)蛋白濃度，根據(jù)NEB Klenow產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)方法測(cè)定酶活，計(jì)算比活，比活為3700U/mg，NEB比活為3685U/mg, DNA內(nèi)、外切酶活性按照其說(shuō)明書(shū)方法檢測(cè)，內(nèi)切酶含量< 10%，外切酶未檢測(cè)至IJ，符合商品酶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。SDS-PAGE電泳純度為96%。根據(jù)商品酶活5000U/ml進(jìn)行稀釋,稀釋buffer為I倍的NEB酶儲(chǔ)液buffer,成分為25mM Tris-HCl (pH 7.4),0.1mM EDTA, ImM DTT, 50%甘油。稀釋過(guò)程中溫度維持在
4。。。稀釋樣品0.22 μ m無(wú)菌濾膜過(guò)濾，無(wú)菌連續(xù)分液器在百級(jí)層流下進(jìn)行分裝。分裝用離心管經(jīng)滅菌處理 ，分裝過(guò)程中溫度維持在4°C，分裝后樣品-20度凍存。按照Victoria Derbyshire文獻(xiàn)所述方法-破菌、50%鹽析、85%鹽析、Mono Q
離子交換層析、Phenyl-Superose疏水層析、Superose 12凝膠層析-同時(shí)進(jìn)行層析，與本
專利方法比較純度收率。本實(shí)施例中涉及的圖表有:(I)金屬螯合親和層析色譜圖及電泳圖:Klenow Ni柱親和層析色譜圖，見(jiàn)圖1 ;Klenow鹽析、金屬螯合層析SDS-PAGE電泳，見(jiàn)圖2，其中圖2中的標(biāo)號(hào)含義為:1.40%鹽析上清 2.裂解液上清 3.80%鹽析上清4.40%鹽析沉淀復(fù)溶5.Marker6.80%鹽析沉淀復(fù)溶，同為Ni柱上樣前7.Ni洗脫穿透8.Ni洗脫雜峰3號(hào)收集9.Ni目的蛋白洗脫4號(hào)收集10.Ni目的蛋白洗脫6號(hào)收集(注:箭頭所示為洗脫目的峰)(2) Sephacryl S-200HR色譜柱(26*60cm)凝膠層析色譜圖及電泳圖:Klenow S200柱親和層析色譜圖，見(jiàn)圖3 ；Klenow S200層析SDS-PAGE電泳，見(jiàn)圖4，其圖4中的標(biāo)號(hào)含義為:1、S200上樣前2、S200洗脫峰6號(hào)
3、KlenowS200 洗脫峰 15 號(hào) 4、KlenowS200 洗脫峰 20 號(hào)(3)內(nèi)切酶檢測(cè)結(jié)果(方法參見(jiàn)NEB Klenow產(chǎn)品說(shuō)明書(shū))Klenow內(nèi)切酶檢測(cè)結(jié)果，見(jiàn)圖5，其中圖5中的標(biāo)號(hào)為:陽(yáng)性對(duì)照:1.Ni柱收集樣品Oh 2.Ni柱收集樣品37°C反應(yīng)4h陰性對(duì)照:3.無(wú)菌水Oh4.無(wú)菌水37°C反應(yīng)4hNEB 商品酶:5.反應(yīng) Oh6.37°C反應(yīng) 4h自制酶:7.反應(yīng)Oh8.37°C反應(yīng)4h(4)本專利方法與Victoria Derbyshire文獻(xiàn)方法收率、純度比較重復(fù)VictoriaDerbyshire文獻(xiàn)方法，與此實(shí)施例采用的純化方法生產(chǎn)蛋白的純度、比活、活性回收率、用時(shí)進(jìn)行比較，具有如下特點(diǎn):
權(quán)利要求
1.一種重組E.coli Klenow片段的純化方法,其特征在于:由以下步驟組成: 1)破菌 表達(dá)重組E.coli Klenow片段的菌體，以1: 5 20的比例加入破菌緩沖液，攪拌10 20min使之混合均勻，在4 10°C下破碎菌體10 20min，再將得到的破菌液在10000 20000g下離心10 20min，溫度控制在O 10°C，取其上清液； 破菌緩沖液為 20 50mM Tris-HCl，ΡΗ7.5 8.5、0.1 5mMEDTA、0.5 IM NaCl、溶菌酶 0.5 2mg/ml、加入 PMSF 至 0.02 ImM ； 2)兩步鹽析 第一步鹽析的飽和度為40 50%:先將硫酸銨鹽用研缽研碎，向破菌上清液中緩慢加入，及時(shí)攪拌，加入比例為IOOml破菌上清液加入22.6 29.1g硫酸銨，沉淀溫度控制在O 10°C，時(shí)間大于2h，然后在10000 20000g下離心10 20min，離心溫度控制在O 10°C，留取上清； 第二步鹽析的飽和度為80 85%:先將硫酸銨鹽用研缽研碎，向一級(jí)鹽析上清中一次性加入，攪拌至完全溶解，加入比例為IOOml破菌上清液加入51.6 55.9g硫酸銨，沉淀溫度為O 10°C，時(shí)間大于2h，然后在10000 20000 Xg下離心10 20min，溫度為O IO0C ； 3)金屬螯合親和層析 金屬螯合層析柱高為2.5 15cm，用緩沖液I平衡色譜柱3 5CV，上樣量為每ml填料上樣菌體蛋白100 300mg，上樣線性流速為30 120cm/h，洗脫線性流速為100 300cm/h，上樣后沖洗5 10CV，UV280洗至基線，緩沖液II洗脫雜蛋白5 10CV，UV280洗至基線，緩沖液III洗脫目的蛋白，收集UV280大于IOOmAu組分； 緩沖液 I 為 20 50mM Tris-HCl, pH7.5 8.5、0.5 1M NaCl、5 1OmM 咪唑；緩沖液 II 為 20 50mM Tris-HCl,PH7.5 8.5,0.5 lMNaCl、40 60mM 咪唑；緩沖液 III 為20 50mM Tris-HCl, PH7.5 8.5,0.5 IM NaCl,250 350mM 咪唑。色譜過(guò)程中溫度維持在4 10°C ; 4)凝膠過(guò)濾層析 凝膠柱高度為50 70cm，上樣量為I % 5 %，色譜過(guò)程中溫度維持在4 10°C，上樣流速10 30cm/h，洗脫流速20 60cm/h，收集UV280大于150mAu樣品；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組E.coli Klenow片段的純化方法，其特征在于:所述破菌步驟中，是用超聲或高壓均質(zhì)的方法進(jìn)行破菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組E.coli Klenow片段的純化方法，其特征在于:所述金屬螯合親和層析中選用的介質(zhì)配基為亞氨基二乙酸(IDA)或次氮基三乙酸(NTA)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組E.coli Klenow片段的純化方法，其特征在于:所述金屬螯合親和層析步驟中上樣量?jī)?yōu)選為每ml填料上樣菌體蛋白100 200mg，上樣線性流速優(yōu)選為60 100cm/h,洗脫線性流速優(yōu)選為100 150cm/h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組E.coli Klenow片段的純化方法，其特征在于:為避免外源核酸酶的污染，所有緩沖液、接觸樣品的容器、吸頭等物品需要高壓滅菌，色譜系統(tǒng)的管路、分子篩凝膠柱需要0.1 0.5M NaOH處理Ih以上，金屬螯合層析柱需要4 6M鹽酸胍處理Ih以上。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組E.coli Klenow片段的純化方法，其特征在于:凝膠過(guò)濾層析介質(zhì)為 GE 公司生產(chǎn)的 Superdex 200、Sepharcy1200HR> Superose 12pg 或 Sepharose6FF。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組E.coli Klenow片段的純化方法，其特征在于:凝膠過(guò)濾層析介質(zhì)優(yōu)選為GE公司生產(chǎn)的Sepharcyl 200HR。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組E.coli Klenow片段的純化方法，其特征在于:其中凝膠過(guò)濾 buffer 為 50mM Tris-HCl (pH 7.4)，0.2mM EDTA, 2mM DTT。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種重組E.coli Klenow酶的純化方法，由以下步驟組成1)破菌、2)兩步鹽析、3)金屬螯合親和層析和4)凝膠過(guò)濾層析。此方法具有工藝簡(jiǎn)便、快速，獲得的Klenow酶質(zhì)量高、成本低的特點(diǎn)，十分適合工業(yè)放大生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12R1/19GK103160480SQ20111041343
公開(kāi)日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2011年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月13日
發(fā)明者聶立影, 王磊, 徐彬, 鄭春陽(yáng) 申請(qǐng)人:天津強(qiáng)微特生物科技有限公司