專利名稱：用于表達miRNA和/或蛋白的載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于表達miRNA和/或蛋白的表達載體及其應(yīng)用。
技術(shù)背景
miRNA是真核生物中一類長度約為22核苷酸，參與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的非編碼小分子RNA，成熟的miRNA是由較長的可折疊形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的前體轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過Dicer酶或類似于Dicer酶的內(nèi)切核酸酶加工而來。miRNA基因存在于基因組的間隔區(qū)域或者內(nèi)含子當中。這些小分子的RNA通過堿基配對與靶mRNA序列的3’ UTR區(qū)結(jié)合來調(diào)控基因的表達。 目前人們對miRNA的生物合成過程已經(jīng)了解比較清楚，細胞內(nèi)編碼的miRNA的基因首先在 RNA聚合酶II的作用下發(fā)生轉(zhuǎn)錄，形成長度約為幾百個核苷酸的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物pri-miRNA， 初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在RNaseIII家族酶-Drosha的參與下被加工成只含60-70nt具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的單個miRNA前體pre-miRNA ；在另一個RNaseIII家族酶-Dicer的參與下，miRNA前體被加工為雙鏈的miRNA，隨后接連形成單鏈成熟的miRNA。miRNA的轉(zhuǎn)錄所需的轉(zhuǎn)錄酶與蛋白表達所需的轉(zhuǎn)錄酶都屬于RNA聚合酶II，因此可以使用同一個II型轉(zhuǎn)錄啟動子。
目前較為常用的miRNA表達載體一般是在利用某一特定的miRNA基因的 5' -flanking region和3’ -flanking region作為克隆位點來連接體外合成發(fā)卡形狀的 miRNA的前體。由于miRNA在基因組中的位置的特殊性，決定了在體外情況下，普通的miRNA 表達載體中無法插入外源蛋白進行表達。這就限制了載體的用途。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于表達miRNA和/或蛋白的表達載體。
本發(fā)明所提供的表達載體是由線性載體pcDNA6. 2-GW/EmGFP_miR和兩端各有一個粘性末端的雙鏈DNA片段連接而成的環(huán)狀表達載體；所述線性載體pcDNA6. 2-GW/ EmGFP-miR的兩個末端和所述雙鏈DNA片段的兩個粘性末端相連，并且兩個連接處均形成限制性內(nèi)切酶BsmB I的識別位點。限制性內(nèi)切酶BsmB I的識別位點及酶切位點為 5'-......CGTCTC(N)1 τ......-3'
3，-......GCAGAG(N)5a......_5，
上述序列中帶下劃線部分為限制性內(nèi)切酶BsmB I的識別位點，三角形代表酶切位點。BsmB I切出的位點有四個堿基的粘性末端，這幾個堿基是隨機的堿基，沒有序列特異性，因此可用BsmB I切出pcDNA6. 2-Gff/EmGFP-miR粘性末端的四個堿基，這樣就不會破壞pcDNA6. 2-Gff/EmGFP-miR載體自身攜帶的flanking region的核苷酸序列也就不會影響miRNA的表達，因此發(fā)明人設(shè)計使所述兩個連接處均形成限制性內(nèi)切酶BsmB I的識別位點ο
實際操作中，可在所述雙鏈DNA片段的內(nèi)部添加限制性內(nèi)切酶Dra I的識別位點。關(guān)于Dra I的設(shè)計，在圖1中可以看出在5’側(cè)翼序列(5’ -flanking region)的前端有EmGFP的序列，此序列前后都有Dra I酶切位點，在此序列的后面有終止密碼子(后一個Dra I后，5’ -flanking region前面，miRNA的表達不受影響)，因此，此線性的末端不能直接連接蛋白表達。在試驗中，本發(fā)明人在插入的多克隆位點中間加入一個Dra I酶。加上插入的Dra I，該質(zhì)粒中共有三個Dra I位點，用Dra I酶切正好切除EmGFP和5，-flanking region的區(qū)域，而不破壞EmGFP前面的啟動子，因此蛋白可以正常表達。
所述DNA片段的一條鏈為如下a) -c)中
a)其核苷酸序列為序列表中序列2 ；
b)其核苷酸序列為在序列表中序列2的第11位和第12位核苷酸之間再插入1-50 個脫氧核糖核苷酸后所組成的序列；所述1-50個脫氧核糖核苷酸不含有如下序列或其反向互補序列5' -CGTCTC-3'；
c)其核苷酸序列為序列表中序列4 ；
所述DNA片段的另一條鏈為如下d)_f)中的任一種
d)其核苷酸序列為序列表中序列3 ；
e)其核苷酸序列為在序列表中序列3的第11位和第12位核苷酸之間再插入1_50 個脫氧核糖核苷酸后所組成的序列；所述1-50個脫氧核糖核苷酸不含有如下序列或其反向互補序列5' -CGTCTC-3'；
f)其核苷酸序列為序列表中序列5 ；
所述雙鏈DNA片段的兩條鏈除兩端的粘性末端外，其余的核苷酸序列均反向互補。
在本發(fā)明的實施例中，所述雙鏈DNA片段的一條鏈的核苷酸序列為序列表中序列 6 ；所述雙鏈DNA片段的另一條鏈的核苷酸序列為序列表中序列7 ；且所述序列6中的第一個脫氧核糖核苷酸(N)(自5’端到3’端的方向)具體為G，第二個脫氧核糖核苷酸(N)(自 5’端到3’端的方向)具體為A ；所述序列7中的第一個脫氧核糖核苷酸(N)(自5’端到 3’端的方向)具體為T，第二個脫氧核糖核苷酸(N)(自5’端到3’端的方向)具體為C。 連接有上述DNA片段的表達載體的核苷酸序列具體為序列表中的序列1。該載體命名為 pcDNA6. 2-EmGFP-BsmB I。
制備本發(fā)明所提供的表達載體的方法也屬于本發(fā)明的保護范圍。
該方法包括將所述線性載體pcDNA6. 2-Gff/EmGFP-miR的兩個末端和所述雙鏈DNA 片段的兩個粘性末端相連，并且使連接處形成限制性內(nèi)切酶BsmB I的識別位點的步驟。
本發(fā)明所提供的表達載體在表達miRNA中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
利用本發(fā)明所提供的表達載體表達miRNA的方法也屬于本發(fā)明的保護范圍。
該方法具體包括如下步驟
1)將所述表達載體用限制性內(nèi)切酶BsmB I進行單酶切，回收大片段，獲得用于表達miRNA的線性骨架載體；
2)將編碼目的miRNA的雙鏈DNA與步驟1)獲得的所述線性骨架載體相連，獲得用于表達所述目的miRNA的重組載體；
所述編碼目的miRNA的雙鏈DNA滿足如下A) -C)的條件
A)所述編碼目的miRNA的雙鏈DNA中的正義鏈的序列組成為如下al)或a2)
al)自5’端到3’端的方向依次為寡核苷酸序列I、所述目的miRNA的反向靶序列、 所述目的miRNA的環(huán)序列、所述目的miRNA的正向靶序列；
a2)自5’端到3’端的方向依次為寡核苷酸序列I、所述目的miRNA的反向靶序列、 所述目的miRNA的環(huán)序列、所述目的miRNA的正向靶序列、脫氧核糖核苷酸C ；
所述寡核苷酸序列I的序列為從序列1的第1519位開始、按照序列1的核苷酸序列向序列1的5'端延長，得到長度為4至6個核苷酸的任一個序列，即為如下Al)-A3)中的任一種Al) 5' -GCTC-3 ‘ ；A2)5' -TGCTC-3 ‘ ；A3) 5' -ATGCTC-3 ‘；
B)所述編碼目的miRNA的雙鏈DNA中的反義鏈的序列組成為如下bl)或b2)
bl)自5’端到3’端的方向依次為寡核苷酸序列II、所述目的miRNA的正向靶序列的反向互補序列缺失第9位和第10位核苷酸后所形成的序列、所述目的miRNA的環(huán)序列的反向互補序列、所述目的miRNA的反向靶序列的反向互補序列；
b2)自5’端到3’端的方向依次為寡核苷酸序列II、所述目的miRNA的正向靶序列的反向互補序列缺失第9位和第10位核苷酸后所形成的序列、所述目的miRNA的環(huán)序列的反向互補序列、所述目的miRNA的反向靶序列的反向互補序列、寡核苷酸序列III ；
所述寡核苷酸序列II的序列為從5' -TCCTG-3'的自5'端第5位開始，向5' 端延長，得到長度為4至5個核苷酸的任一序列，即為如下Bi)或B2) :B1)5' -CCTG-3'； B2)5' -TCCTG-3'；所述寡核苷酸序列III的序列為從5‘ -CA-3'自5'端第1位開始，向 3'端延長，得到長度為1或2個核苷酸的任一序列，即為如下Cl)或C2) :C1)5' -CA-3'； C2) 5 ‘ -C-3‘
C)所述編碼目的miRNA的雙鏈DNA中的正義鏈與所述編碼目的miRNA的雙鏈DNA 中的反義鏈反向互補后形成與所述線性骨架載體相匹配的粘性末端。
所述編碼目的miRNA的雙鏈DNA中的正義鏈的序列組成自5’端到3’端的方向依次為5 ‘ -TGCTG-3 ‘、所述目的miRNA的反向靶序列、所述目的miRNA的環(huán)序列、所述目的miRNA的正向靶序列；所述編碼目的miRNA的雙鏈DNA中的反義鏈的序列組成自5’端到 3’端的方向依次為5' -CCTG-3'、所述目的miRNA的正向靶序列的反向互補序列缺失第9 位和第10位核苷酸后所形成的序列、所述目的miRNA的環(huán)序列的反向互補序列、所述目的 miRNA的反向靶序列的反向互補序列、脫氧核糖核苷酸C。
在本發(fā)明的實施例中，所述目的miRNA具體為Hsa-miR-130b。用于表達所述Hsa-miR-130b的雙鏈DNA的中的正義鏈的序列為序列表中序列8 ；用于表達所述 Hsa-miR-130b的雙鏈DNA的中的反義鏈的序列為序列表中序列9。
本發(fā)明所提供的表達載體在表達蛋白中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。
在上述應(yīng)用中，利用本發(fā)明所提供的表達載體表達蛋白的方法包括如下1)和2) 的步驟
1)將所述表達載體用限制性內(nèi)切酶Dra I進行單酶切(去除線性載體 pcDNA6. 2-Gff/EmGFP-miR自身位于cmv啟動子下游的EmGFP表達框)，回收大片段，獲得用于表達蛋白的線性骨架載體；
2)將含有目的蛋白編碼基因的雙鏈DNA與步驟1)獲得的所述線性骨架載體相連， 獲得用于表達所述目的蛋白的重組載體。
在本發(fā)明的一個實施例中，與線性載體pcDNA6. 2-Gff/EmGFP-miR相連的所述雙鏈 DNA片段內(nèi)部含有限制性內(nèi)切酶Dra I的識別位點；所述目的蛋白編碼基因為編碼紅色熒光蛋白(dsRed)的基因deRed，所述deRed來源于pDsRed-Monomer-Hyg-m載體。
本發(fā)明通過在miRNA 表達載體 pcDNA6. 2-Gff/EmGFP-miR 的 5，-flanking region 和3’ -flanking region克隆位點處連接了兩段具有特殊限制性內(nèi)切酶BsmB I識別位點的多克隆位點序列，利用該內(nèi)切酶的特殊切法可輕松的切出原來的5’ -flanking region 和3’-flanking region(不破壞載體本身的核酸序列)，用于表達miRNA。同時利用 pcDNA6. 2-GW/EmGFP-miR載體自身的限制性內(nèi)切酶Dra I識別位點(或和設(shè)計優(yōu)化的多克隆位點序列中的Dra I)可以切除位于pcDNA6. 2-Gff/EmGFP-miR載體cmv啟動子下游的 EmGFP開放閱讀框，進而可以連接所需要表達的蛋白序列，表達目的蛋白。實驗證明，在表達 miRNA方面，本發(fā)明所提供的表達載體為環(huán)形載體，可在大腸桿菌中大量擴增，克服了原始線性載體pcDNA6. 2-Gff/EmGFP-miR 一次性使用的缺陷，大大節(jié)約了實驗成本；同時，本發(fā)明所提供的表達載體還可用于表達蛋白，克服了普通載體只能單一表達蛋白或表達miRNA的不足。


圖1為線性載體pcDNA6. 2-Gff/EmGFP-miR的粘性末端。
圖2為2. 5%瓊脂糖膠電泳檢測雙鏈多克隆位點序列(PolyLinker)的結(jié)果。其中，泳道M為DL1000 DNA Marker (TakaRa)；泳道1為雙鏈多克隆位點序列(PolyLinker)。
圖3為BsmB I單酶切pcDNA6. 2-EmGFP_BsmB I質(zhì)粒的1 %瓊脂糖膠電泳圖。其中， 泳道 M 為 DL15000 DNA Marker (TakaRa)；泳道 1 為 pcDNA6. 2-EmGFP-BsmB I 質(zhì)粒經(jīng) BsmB I單酶切后酶切產(chǎn)物的電泳結(jié)果。
圖 4 為 pcDNA6. 2-EmGFP-BsmB I 的質(zhì)粒圖譜。
圖5為Msc I單酶切pcDNA6. 2-EmGFP-mir_130b質(zhì)粒的1 %瓊脂糖膠電泳圖。其中，泳道 M 為 Wide Range DNA Marker(100-6000) (TakaRa)；泳道 1 為 pcDNA6. 2-EmGFP-mir-130b質(zhì)粒經(jīng)Msc I單酶切后酶切產(chǎn)物的電泳結(jié)果。
圖6為RT-PCR檢測Hsa-mir-130b在HeLa細胞內(nèi)的表達情況。其中，C為轉(zhuǎn)染 pcDNA6. 2-EmGFP-mir-130b 質(zhì)粒的 HeLa 細胞(實驗組)；B 為轉(zhuǎn)染 pcDNA6. 2-EmGFP-BsmB I 質(zhì)粒的HeLa細胞(陰性對照組)；A為未轉(zhuǎn)染的HeLa細胞(空白對照組)。每組縱坐標的倍數(shù)是以空白對照組中Hsa-mir-130b表達量為1計算所得。
圖7為瓊脂糖凝膠電泳檢測dsRed基因的PCR產(chǎn)物。其中，泳道M為Wide Range DNA Marker (100-6000)；泳道1為dsRed基因PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果。
圖8為Dra I單酶切pcDNA6. 2-DsRed質(zhì)粒的瓊脂糖膠電泳圖。其中，泳道M 為 DL15000 DNA Marker (TakaRa)；泳道 1 為 pcDNA6. 2-DsRed 質(zhì)粒經(jīng) Dra I 單酶切后酶切產(chǎn)物的電泳結(jié)果。
圖9為轉(zhuǎn)染pcDNA6. 2-DsRed質(zhì)粒的HeLa細胞中紅色熒光蛋白的表達情況。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例進一步闡明本發(fā)明，應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所涉及的分子生物學相關(guān)技術(shù)如核酸分子克隆技術(shù)等在科學文獻中都已有充分描述(如參見J ·薩姆布魯克E · F ·弗里奇T ·曼尼要蒂斯，分子克隆實驗指南(第三版))。涉及到各種試劑(或試劑盒)的具體操作，按照各試劑(或試劑盒)的使用說明書進行。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。 pcDNA6. 2-Gff/EmGFP-miR 載體購自美國 hvitrogen 公司；pDsRed-Monomer-Hyg-Nl 載體購自Clontech Laboratories ；HeLa細胞購自ATCC ；質(zhì)粒中量提取試劑盒為QIAGEN Plasmid Midi kit購于德國QIAGEN公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購于北京TIANGEN公司；所用的 BsmB I和Dra I及其他常用的DNA內(nèi)切酶和！"4 DNA Ligase均購于英國NEB公司。細胞培養(yǎng)試劑DMEM，無血清培養(yǎng)基Opti-MEM，胎牛血清，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine及miRNA 反轉(zhuǎn)錄和miRNA定量檢測試劑盒均購于美國hvitrogen公司。Realtime PCR反應(yīng)儀為美 H stratagene Mx3000Po
實施例1、表達載體pcDNA6. 2-EmGFP-BsmB I的構(gòu)建
一、插入片段(雙鏈多克隆位點序列)的獲得
根據(jù)線性載體pcDNA6. 2-Gff/EmGFP-miR(Invitrogen)(序列 11)的粘性末端(圖 1)，設(shè)計兩條單鏈DNA序列，使所述兩條單鏈DNA序列經(jīng)退火形成雙鏈DNA片段(內(nèi)部具有限制性內(nèi)切酶Dra I識別位點)后，再與所述線性載體pcDNA6. 2-Gff/EmGFP-miR相連，能夠形成兩個連接處各帶有一個限制性內(nèi)切酶BsmB I識別位點的環(huán)狀表達載體。其中一條鏈的核苷酸序列為序列表中序列6 (自5’端到3’端的方向，第一個脫氧核糖核苷酸(N)為G， 第二個脫氧核糖核苷酸(N)為A)所示，反義鏈的核苷酸序列為序列表中序列7 (自5’端到 3’端的方向，第一個脫氧核糖核苷酸(N)為T，第二個脫氧核糖核苷酸(N)為C)所示。
人工合成上述兩條單鏈DNA后，退火使所述兩條單鏈DNA形成雙鏈。退火反應(yīng)體系為正義鏈和反義鏈(溶于TE緩沖液，濃度均為200 μ M)各5μ 1，IOx退火反應(yīng)液(配方 終濃度為IOOmM的iTris-HCl,終濃度為IOmM的EDTA，終濃度為IM的NaCl，ρΗ 8. 0) 2 μ 1， 用無核酸酶的水補充至20 μ 1。退火反應(yīng)條件為將反應(yīng)體系加入到95°C的水浴鍋中緩慢降溫至室溫。
用2. 5%瓊脂糖膠電泳對結(jié)果進行檢測，結(jié)果如圖2所示，擴增出大小約為40bp的目的條帶。。將得到的作為插入片段的雙鏈DNA命名為雙鏈多克隆位點序列(PolyLinker)， 將其置于_20°C備用。
二、表達載體 pcDNA6. 2-EmGFP-BsmB I 的獲得
將步驟一獲得的雙鏈多克隆位點序列(插入片段)與線性載體pcDNA6.2-GW/ EmGFP-miR(Invitrogen)相連，具體的連接體系為雙鏈多克隆位點序列(溶于無核酸酶的水，濃度為 IOnM) 4 μ 1，線性載體 pcDNA6. 2-Gff/EmGFP-miR(濃度為 IOng/ μ 1) 2 μ 1，IOx Τ4 連接酶緩沖液2 μ 1，Τ4連接酶1 μ 1，用無核酸酶的水補充至20 μ 1。連接條件為16°C過夜連接。
取10 μ 1上述連接產(chǎn)物加入到100 μ 1的Τ0Ρ10感受態(tài)細菌中，將反應(yīng)體系冰上孵育30min后，迅速放入42°C水浴中孵育90s熱激活，熱激活后再次冰浴3min。冰浴結(jié)束后向反應(yīng)體系加入500 μ 1新鮮LB培養(yǎng)基，370C，150rpm,復蘇培養(yǎng)45min。取200 μ 1復蘇好的菌液均勻涂到LB壯觀霉素選擇性固體培養(yǎng)基上，37°C過夜培養(yǎng)。第二天，挑取單菌落接種到:3ml LB培養(yǎng)基中，370C，200rpm過夜搖菌(12_16h)，次日取2ml菌液堿裂解法小提質(zhì)粒。 所提質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BsmB I進行單酶切，酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳，結(jié)果如圖3所示，在約5700bp的位置出現(xiàn)載體骨架片段，由于插入片段(多克隆位點序列)只有42bp所以瓊脂糖電泳結(jié)果沒有顯示出來。酶切初步鑒定正確的質(zhì)粒，送公司測序，進一步鑒定正確(成功插入步驟一所得的雙鏈多克隆位點序列)后，命名為pcDNA6. 2-EmGFP-BsmB I， 該載體的核苷酸序列為序列表中序列1，該載體的質(zhì)粒圖譜如圖4所示。利用德國QIAGEN 公司的質(zhì)粒中量提取試劑盒QIAGEN Plasmid Midi kit制備中量pcDNA6. 2-EmGFP-BsmB I， 置于-20°C備用。
其中，T0P10感受態(tài)細胞的制備方法如下從37°C培養(yǎng)16_20h的新鮮LB平板上挑取T0P10單菌落，接種于3ml不含抗生素的LB培養(yǎng)基中，37°C中速搖床培養(yǎng)過夜O50rpm， 12-16h)。取Iml上述培養(yǎng)物接種到IOOml的液體LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，待菌液的0D600值達到0. 3-0. 6時，將菌液移植到兩支預冷的無菌的50ml離心管中，冰浴30min。4°C，3000g 離心IOmins棄上清，加入IOml冰冷的CaCl2重懸，冰上放置30min，4°C，3000g離心5min， 再次加入含10% DMSO的2ml冰冷的CaCl2重懸細菌，按每管100 μ 1的量分裝到預冷無菌的EP管中，置于-80°C備用。
實施例2、miRNA表達載體的構(gòu)建及其在細胞中的表達
本實施例所要表達的miRNA為Hsa-miR_130b，用于表達Hsa-miR_130b的宿主細胞為 HeLa0
一、設(shè)計合成表達Hsa-miR-130b的雙鏈DNA
根據(jù)Hsa-miR_130b 序列(MI0000748-----http //www. mirbase. org)，以及實施例1所制備的pcDNA6. 2-EmGFP-BsmB I載體的序列(序列1)，設(shè)計表達Hsa-miR-130b前體的雙鏈DNA，其中，所述雙鏈DNA中的正義鏈的序列為序列表中序列8 ；所述雙鏈DNA中的反義鏈的序列為序列表中序列9。
人工合成上述雙鏈DNA的正義鏈和反義鏈后，退火使正義鏈和反義鏈互補形成雙鏈DNA。退火反應(yīng)體系為正義鏈和反義鏈(溶于TE緩沖液，濃度均為200 μ M)各5μ1， IOx退火反應(yīng)液(配方終濃度為IOOmM的Tris-HCl，終濃度為IOmM的EDTA，終濃度為IM 的NaCl，pH 8. 0)2 μ 1，用無核酸酶的水補充至20 μ 1。退火反應(yīng)條件為將反應(yīng)體系加入到 95 0C的水浴鍋中緩慢降溫至室溫。
用2. 5%瓊脂糖膠電泳對結(jié)果進行檢測，得到大小約為65bp的目的條帶。將得到的作為插入片段的雙鏈DNA置于_20°C備用。
二、pcDNA6. 2-EmGFP-mir_130b 重組表達載體的獲得
用限制性內(nèi)切酶BsmB I單酶切實施例1制備的pcDNA6. 2-EmGFP-BsmB I質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠回收試劑盒(北京TIANGEN公司)回收大片段。按照實施例1步驟二所述方法連接上述步驟一制備的雙鏈DNA (表達Hsa-miR-130b前體的雙鏈DNA)和上述回收的大片段 (BsmB I單酶切pcDNA6. 2-EmGFP-BsmB I質(zhì)粒后的大片段)。
參照實施例1步驟二的方法，用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細菌，挑取單菌落，堿裂解法小提質(zhì)粒。將所提質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶Msc I進行單酶切(37°C，8h)，之后用瓊脂糖電泳膠鑒定(圖5)，結(jié)果顯示所提質(zhì)粒經(jīng)Msc I單酶切后獲得大小為 1430bp和4307bp的兩條帶，與預期結(jié)果相一致。經(jīng)測序后證實所提質(zhì)粒已成功插入了上述步驟一制備的雙鏈DNA (表達Hsa-miR-130b前體的雙鏈DNA)，將該重組質(zhì)粒命名為 pcDNA6. 2-EmGFP-mir-130bo利用德國QIAGEN公司的質(zhì)粒中量提取試劑盒QIAGEN Plasmid Midi kit 制備中量 pcDNA6. 2-EmGFP-mir_130b，置于 _20°C備用。
三、pcDNA6. 2-EmGFP-mir_130b質(zhì)粒在HeLa細胞的表達及鑒定
1、轉(zhuǎn)染
用pcDNA6. 2-EmGFP-mir_130b 質(zhì)粒(實驗組)和 pcDNA6. 2-EmGFP-BsmBI 質(zhì)粒(陰性對照組)分別轉(zhuǎn)染HeLa細胞。具體操作如下
(1)細胞的準備HeLa細胞(ATCC)按3xl05個/孔的量鋪六孔板，用含有10 % (體積百分含量)胎牛血清的無抗生素DMEM培養(yǎng)基(美國^witrogen公司，產(chǎn)品目錄號 11965)過夜培養(yǎng)，待細胞達到90%-95%匯合度的時候進行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前Ih去掉六孔板中細胞培養(yǎng)基，加入Iml無血清無抗生素的Opti-MEM培養(yǎng)基(Invitrogen，產(chǎn)品目錄號 31985)。
(2)轉(zhuǎn)染復合物的制備將 4μ g 質(zhì)粒(pcDNA6. 2-EmGFP-mir_130b 或 pcDNA6. 2-EmGFP-BsmB I)溶解在250 μ 1無血清無抗生素Opti-MEM培養(yǎng)基中，得到溶液A ； 將10 μ 1脂質(zhì)體(Iipofectamine)(美國hvitrogen公司)溶解在2δ0 μ 1無血清無抗生素OPti-MEM培養(yǎng)基中，室溫孵育5min，得到溶液B ；將溶液A加入溶液B中，混勻，室溫孵育 30min，即得到轉(zhuǎn)染復合物。
(3)轉(zhuǎn)染將上述含有脂質(zhì)體和質(zhì)粒(pcDNA6. 2-EmGFP-mir-130b或 pcDNA6. 2-EmGFP-BsmB I)的轉(zhuǎn)染復合物均勻的滴加到上述步驟(1)準備好的HeLa細胞中， 37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中過夜孵育后，去掉舊培養(yǎng)基換上含有10% (體積百分含量)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。
2、Hsa-miR_130b在細胞中的表達及鑒定
將經(jīng)上述步驟1轉(zhuǎn)染后的細胞(同時設(shè)置空白對照組，即未轉(zhuǎn)染的HeLa細胞)繼續(xù)培養(yǎng)18-36小時，收集細胞，Trizol法提取總RNA，經(jīng)DNase I消化后，利用Promega公司的 ImProm-II Reverse Transcription System(A3800)試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄。具體操作按照說明書進行，得到cDNA。
接著，用RealtimePCR儀檢測Hsa-mir-130b的表達情況。以所得到的cDNA為模板，以自行設(shè)計的如下一條引物5’-AGTGCAATGATGAAAGGGCAT-3’以及上述試劑盒自身帶有的通用引物作為PCR引物，反應(yīng)的條件是:50°C 2mins，95°C，2mins ；95°C, 15s,60°C, lmin, (共 40 個循環(huán))；95°C，lmin，55°C，30s，95°C，30s。
結(jié)果顯示，與陰性對照組(轉(zhuǎn)染pcDNA6. 2-EmGFP-BsmB I質(zhì)粒的HeLa細胞)和空白對照組(未轉(zhuǎn)染的HeLa細胞)相比，實驗組(轉(zhuǎn)染pcDNA6. 2-EmGFP-mir-130b質(zhì)粒的 HeLa細胞)中Hsa-mir-130b的表達量是空白對照組的5. 44倍(如圖6所示)。這一結(jié)果表明pcDNA6. 2-EmGFP-BsmBI載體可以用于表達miRNA.
實施例3、蛋白表達載體的構(gòu)建及其在細胞中的表達
本實施例所要表達的蛋白為紅色熒光蛋白(dsRed)，用于表達dsRed的宿主細胞為 HeLa0
一、dsRed蛋白DNA序列的克隆
紅色熒光蛋白dsRed(編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列10)在波長為557nm的激發(fā)光照射下可以顯示紅色熒光。該蛋白是通過PCR的方式從質(zhì)粒 pDsRed-Monomer-Hyg-Nl (Clontech Laboratories, Inc.)中克隆得到?？寺?deRed 的上下游引物分別為
上游引物5，-AGCTTTGTTTAAAATGGACAAGACCGAGGACGTC-3，(下劃線部分為Dra I 酶切位點)；
下游引物5，-AGCTTTGTTTAAACTACTGGGAGCCGGAGTGGCG-3，(下劃線部分為Dra I 酶切位點)。
PCR反應(yīng)體系為Taq DNA聚合酶(2. 5M) 1 μ 1、IOx反應(yīng)緩沖液5 μ 1、dNTP G種 dNTP的濃度均為10mM)l μ 1、上游引物和下游引物(濃度均為10 μ Μ)各2μ1，模板質(zhì)粒 (pDsRed-Monomer-Hyg-Nl, 0. 1 μ g/μ 1) 1 μ 1，ddH20 38 μ L· PCR 反應(yīng)程序為95 °C 預變性 5min ；95°C變性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 Imin(共 30 個循環(huán))；72°C延伸 5min ；4°C保溫終止反應(yīng)。
將上述PCR反應(yīng)的產(chǎn)物用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖7)，結(jié)果顯示PCR擴增得到大小為700bp左右的目的條帶。
二、pcDNA6. 2-DsRed重組表達載體的獲得
用限制性內(nèi)切酶Dra I單酶切實施例1制備的pcDNA6. 2-EmGFP-BsmB I質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(北京TIANGEN公司)回收酶切后的大片段(PCDNA6. 2-EmGFP-BsmB I質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶Dra I單酶切后，位于cmv 啟動子下游的EmGFP開放閱讀框被切除)。同樣，用限制性內(nèi)切酶Dra I單酶切上述步驟一獲得的大小為700bp左右的目的條帶，并膠回收。然后，按照實施例1步驟二所述方法連接上述回收所得的pcDNA6. 2-EmGFP-BsmB I質(zhì)粒大片段和700bp左右的目的條帶。
參照實施例1步驟二的方法，用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化T0P10感受態(tài)細菌，挑取單菌落，堿裂解法小提質(zhì)粒。將所提質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶Dra I進行單酶切，之后用瓊脂糖電泳膠鑒定，結(jié)果顯示所提質(zhì)粒經(jīng)Dra I單酶切后獲得大小為4996bp和684bp的兩條帶(圖8)， 與預期結(jié)果相一致。經(jīng)測序后證實所提質(zhì)粒已成功插入了上述步驟一所得700bp左右的目的條帶(dsRed)，將該重組質(zhì)粒命名為pcDNA6. 2-DsRed。利用德國QIAGEN公司的質(zhì)粒中量提取試劑盒 QIAGEN Plasmid Midi kit 制備中量 pcDNA6. 2-DsRed，置于 _20°C備用。
三、pcDNA6. 2-DsRed質(zhì)粒在HeLa細胞的表達及鑒定
1、轉(zhuǎn)染
用pcDNA6. 2-DsRed 質(zhì)粒(實驗組)和 pcDNA6. 2-EmGFP-BsmB I 質(zhì)粒(陰性對照組)分別轉(zhuǎn)染HeLa細胞。具體操作如下
(1)準備細胞HeLa細胞(ATCC)按3xl05個/孔的量鋪六孔板，用含有10% (體積百分含量)胎牛血清(Gibco，16000-044)的無抗生素DMEM培養(yǎng)基(美國^witrogen 公司，產(chǎn)品目錄號1196 過夜培養(yǎng)，待細胞達到90% -95%匯合度的時候進行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前Ih去掉六孔板中細胞培養(yǎng)基，加入Iml無血清無抗生素的Opti-MEM培養(yǎng)基 (Invitrogen，產(chǎn)品目錄號 31985)。
(2)制備轉(zhuǎn)染復合物將 4 μ g 質(zhì)粒(pcDNA6. 2-DsRed 或 pcDNA6. 2-EmGFP-BsmB I)溶解在250μ 1無血清無抗生素Opti-MEM培養(yǎng)基中，得到溶液A ；將10 μ 1脂質(zhì)體 (Iipofectamine)(美國hvitrogen公司)溶解在250 μ 1無血清無抗生素OPti-MEM培養(yǎng)基中，室溫孵育5min，得到溶液B ；將溶液A加入溶液B中，混勻，室溫孵育30min，即得到轉(zhuǎn)染復合物。
(3)轉(zhuǎn)染將上述步驟⑵制備的含有脂質(zhì)體和質(zhì)粒(pcDNA6. 2-DsRed或pcDNA6. 2-EmGFP-BsmB I)的轉(zhuǎn)染復合物均勻的滴加到上述步驟(1)準備好的HeLa細胞中， 37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中過夜孵育后，去掉舊培養(yǎng)基換上含有10% (體積百分含量)胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。
2、dsRed在細胞中的表達及鑒定
將經(jīng)上述步驟1轉(zhuǎn)染后的細胞繼續(xù)培養(yǎng)18-36小時以后，用熒光顯微鏡在557nm 波長激發(fā)光條件下觀察紅色熒光(同時設(shè)置未轉(zhuǎn)染的HeLa細胞作為空白對照組)，從而確定dsRed蛋白在HeLa細胞中的表達情況。
結(jié)果顯示，實驗組(轉(zhuǎn)染pcDNA6.2-DSRed質(zhì)粒的HeLa細胞)的細胞出現(xiàn)明顯的紅色熒光的表達(圖9)；而陰性對照組(轉(zhuǎn)染pcDNA6. 2-EmGFP-BsmB I質(zhì)粒的 HeLa細胞)和空白對照組(未轉(zhuǎn)染的HeLa細胞)均無紅色熒光的表達。這一結(jié)果表明 pcDNA6. 2-EmGFP-BsmB I質(zhì)?？梢宰鳛橐环N表達蛋白的載體使用。
權(quán)利要求
1.一種表達載體，是由線性載體pcDNA6. 2-GW/EmGFP-miR和兩端各有一個粘性末端的雙鏈DNA片段連接而成的環(huán)狀表達載體；所述線性載體pcDNA6. 2-Gff/EmGFP-miR的兩個末端和所述雙鏈DNA片段的兩個粘性末端相連，并且兩個連接處均形成限制性內(nèi)切酶BsmB I 的識別位點。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述表達載體，其特征在于所述雙鏈DNA片段的內(nèi)部具有限制性內(nèi)切酶Dra I的識別位點。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述表達載體，其特征在于所述DNA片段的一條鏈為如下a)-c)中a)其核苷酸序列為序列表中序列2；b)其核苷酸序列為在序列表中序列2的第11位和第12位核苷酸之間再插入1-50個脫氧核糖核苷酸后所組成的序列；所述1-50個脫氧核糖核苷酸不含有如下序列或其反向互補序列5' -CGTCTC-3‘；c)其核苷酸序列為序列表中序列4；所述DNA片段的另一條鏈為如下d)-f)中的任一種d)其核苷酸序列為序列表中序列3；e)其核苷酸序列為在序列表中序列3的第11位和第12位核苷酸之間再插入1-50個脫氧核糖核苷酸后所組成的序列；所述1-50個脫氧核糖核苷酸不含有如下序列或其反向互補序列5' -CGTCTC-3 ‘；f)其核苷酸序列為序列表中序列5；所述雙鏈DNA片段的兩條鏈除兩端的粘性末端外，其余的核苷酸序列均反向互補。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的表達載體，其特征在于所述雙鏈DNA片段的一條鏈的核苷酸序列為序列表中序列6 ；所述雙鏈DNA片段的另一條鏈的核苷酸序列為序列表中序列7。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述表達載體，其特征在于所述表達載體的核苷酸序列為序列表中的序列1。
6.制備權(quán)利要求1-5中任一所述表達載體的方法，包括將所述線性載體pcDNA6.2-GW/ EmGFP-miR的兩個末端和所述雙鏈DNA片段的兩個粘性末端相連，并且使連接處形成限制性內(nèi)切酶BsmB I的識別位點的步驟。
7.權(quán)利要求1-5中任一所述的表達載體在表達miRNA中的應(yīng)用。
8.利用權(quán)利要求1-5中任一所述的表達載體表達miRNA的方法，包括如下步驟1)將所述表達載體用限制性內(nèi)切酶BsmBI進行單酶切，回收大片段，獲得用于表達 miRNA的線性骨架載體；2)將編碼目的miRNA的雙鏈DNA與步驟1)獲得的所述線性骨架載體相連，獲得用于表達所述目的miRNA的重組載體；所述編碼目的miRNA的雙鏈DNA滿足如下A) -C)的條件A)所述編碼目的miRNA的雙鏈DNA中的正義鏈的序列組成為如下al)或a2)al)自5’端到3’端的方向依次為寡核苷酸序列I、所述目的miRNA的反向靶序列、所述目的miRNA的環(huán)序列、所述目的miRNA的正向靶序列；a2)自5’端到3’端的方向依次為寡核苷酸序列I、所述目的miRNA的反向靶序列、所述目的miRNA的環(huán)序列、所述目的miRNA的正向靶序列、脫氧核糖核苷酸C ；所述寡核苷酸序列I的序列為如下Al)-A3)中的任一種Al)5 ‘ -GCTC-3 ‘； A2)5' -TGCTC-3‘ ；A3)5' -ATGCTC-3‘；B)所述編碼目的miRNA的雙鏈DNA中的反義鏈的序列組成為如下bl)或1^2)bl)自5’端到3’端的方向依次為寡核苷酸序列II、所述目的miRNA的正向靶序列的反向互補序列缺失第9位和第10位核苷酸后所形成的序列、所述目的miRNA的環(huán)序列的反向互補序列、所述目的miRNA的反向靶序列的反向互補序列；b2)自5’端到3’端的方向依次為寡核苷酸序列II、所述目的miRNA的正向靶序列的反向互補序列缺失第9位和第10位核苷酸后所形成的序列、所述目的miRNA的環(huán)序列的反向互補序列、所述目的miRNA的反向靶序列的反向互補序列、寡核苷酸序列III ；所述寡核苷酸序列II的序列為如下Bi)或B2) :B1)5' -CCTG-3' ；B2)5' -TCCTG-3'； 所述寡核苷酸序列III的序列為如下Cl)或C2) :C1)5' -CA-3' ；C2)5' _C_3'；C)所述編碼目的miRNA的雙鏈DNA中的正義鏈與所述編碼目的miRNA的雙鏈DNA中的反義鏈反向互補后形成與所述線性骨架載體相匹配的粘性末端。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述編碼目的miRNA的雙鏈DNA中的正義鏈的序列組成自5’端到3’端的方向依次為5' -TGCTG-3'、所述目的miRNA的反向靶序列、所述目的miRNA的環(huán)序列、所述目的miRNA的正向靶序列；所述編碼目的miRNA的雙鏈 DNA中的反義鏈的序列組成自5’端到3’端的方向依次為5' -CCTG-3'、所述目的miRNA的正向靶序列的反向互補序列缺失第9位和第10位核苷酸后所形成的序列、所述目的miRNA 的環(huán)序列的反向互補序列、所述目的miRNA的反向靶序列的反向互補序列、脫氧核糖核苷酸C。
10.權(quán)利要求1-5中任一所述的表達載體在表達蛋白中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于表達miRNA和/或蛋白的表達載體及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的表達載體是由線性載體pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR和兩端各有一個粘性末端的雙鏈DNA片段連接而成的環(huán)狀表達載體；所述線性載體pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR的兩個末端和所述雙鏈DNA片段的兩個粘性末端相連，并且兩個連接處均形成限制性內(nèi)切酶BsmB I的識別位點；所述DNA片段的內(nèi)部還包括限制性內(nèi)切酶Dra I的識別位點。實驗證明，在表達miRNA方面，本發(fā)明所提供的表達載體為環(huán)形載體，可在大腸桿菌中大量擴增，克服了原始線性載體pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR一次性使用的缺陷，大大節(jié)約了實驗成本；同時，本發(fā)明所提供的表達載體還可用于表達蛋白，克服了普通載體只能單一表達蛋白或表達miRNA的不足。
文檔編號C12N15/63GK102517313SQ20111041664
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月14日
發(fā)明者曾毅, 李澤琳, 楊志平, 盛望, 陳學斌 申請人:北京工業(yè)大學