專利名稱：一種檢測日本乙型腦炎病毒的rt-lamp可視化試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP可視化試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
日本乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)屬于黃病毒科黃病毒屬，其所導(dǎo)致的日本乙型腦炎是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)性人畜共患的急性傳染病。據(jù)估計，每年全球大約有50000人感染JEV，大約有15000例死亡，死亡率30%左右；同時JEV是嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的重要病毒之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，極大的限制肉產(chǎn)品的出口創(chuàng)匯。 2008年我國農(nóng)業(yè)部將豬日本乙型腦炎病歸于二類動物疫病。該病于19世紀(jì)70年代在日本首次報道，并于1擬4年首次分離到日本乙型腦炎病毒。中國是在1938 1940年間采用血清學(xué)和病毒分離的方法確診了日本乙型腦炎病例， 于1949年在北京首次分離到該病毒。自20世紀(jì)90年代以來，該病的流行區(qū)域有所擴(kuò)大， 目前該病的分布區(qū)北起俄羅斯西伯利亞、日本北海道，南到澳大利亞，東到美國關(guān)島，西到印度西海岸。亞洲是JEV發(fā)病人數(shù)最多的地區(qū)，我國又占了其中的大多數(shù)。目前常用于檢測乙腦病毒的方法包括病原的分離鑒定、血清學(xué)方法和RT-PCR。病原的分離鑒定是最傳統(tǒng)的檢測方法，其結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但其影響因素多，實際操作起來相當(dāng)費時費力，因此在臨床應(yīng)用中有一定的局限性；血凝抑制試驗、補(bǔ)體結(jié)合試驗、中和試驗和酶聯(lián)免疫吸附試驗等血清學(xué)試驗的敏感性及特異性較低，操作也比較麻煩；而RT-PCR技術(shù)需要特殊的儀器設(shè)備(如PCR儀和凝膠成像系統(tǒng)等)和專業(yè)人員進(jìn)行相關(guān)的操作，顯然無法滿足基層和現(xiàn)場檢測的需求。環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)是由日本學(xué)者Notomi于2000年開發(fā)的一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，該技術(shù)利用4種不同的特異性引物識別靶基因的6個特定區(qū)域， 通過一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等溫條件下進(jìn)行靶序列高效快速擴(kuò)增。近年來，國內(nèi)外已將該技術(shù)廣泛應(yīng)用于病原體檢測。Hong TC等人(Development and evaluation of a novel loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus.Clin Microbiol, 2004May ；42 (5) :1956-61)于2004年根據(jù)LAMP原理設(shè)計了實時定量RT-LAMP方法，以快速檢測SARS-Cov，結(jié)果RT-LAMP的靈敏度是RT-PCR的100倍；Masaki Imai等人(Rapid diagnosis of H5N1 avian influenza virus infection by newly developed influenza H5 hemagglutinin gene-specific loop-mediated isothermal amplification method. Virol Methods. 2007May ； 141 (2) :173-80.)于 2007 年建立了快速診斷 H5m 禽流感病毒的 RT-LAMP檢測體系。由于LAMP的擴(kuò)增產(chǎn)物是白色焦磷酸鎂沉淀，用肉眼難以觀察，日本已研制出專門對LAMP產(chǎn)物進(jìn)行實時監(jiān)控的濁度儀。但是濁度儀的使用不但增加了費用，而且不方便攜帶；有學(xué)者利用往反應(yīng)后的體系中加入STOR Green I染料的方法來檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，但是這樣觀察又必需開蓋處理，LAMP擴(kuò)增的高效性及高敏感性使得產(chǎn)物中含有大量目的片段，開蓋添加染料極其容易污染環(huán)境。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首要目的是提供一具有高靈敏度、高特異性、可視化的、操作方法簡單的檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP可視化試劑盒。本發(fā)明的另一目的在于提供實現(xiàn)上述檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP可視化試劑盒的使用方法。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)一種檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP可視化試劑盒，包含引物組和顯色物質(zhì)；所述的引物組如下所示F3 :5， -GGGCAACGGATGTGGATTT-3，；B3 5 ’ -GTTTGAGGGCTACCGAAGGA-3’ ；FIP :5’ -TGTTTTCTGGCTGGATTGTTCTCCTTTGGGAAGGGAAGCATTGACAC-3，；BIP :5’ -TTTTGTGCATGGAACCACCACTTCTTTGTAAACTTTGCCGCCTGGG-3，；所述的顯色物質(zhì)為鈣黃綠素(Calcein)和氯化錳(MnCl2)；所述的試劑盒還優(yōu)選包含dNTP混合物、MgSO4UO倍反應(yīng)緩沖液(lOXHiermoPol Reaction Buffer)、鏈置換 DNA 聚合酶(Bst DNApolymerase)、甜菜堿(Betaine)和 AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶；所述的試劑盒更優(yōu)選為包含5U/ μ L的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、10倍反應(yīng)緩沖液 (IOXThermoPol Reaction Buffer)、8U/L 的鏈置換 DNA聚合酶、2. 5mmol/L 的 dNTP、IOmol/ L 的甜菜堿(Betaine)、250 μ mol/L 的 Calcein、25mmol/L 的 MnCl2、4mmol/L 的 MgS04、 10 μ mol/L 弓丨物 FIPUO μ mol/L 弓丨物 BIPUO μ mol/L 弓丨物 F3 禾口 10 μ mol/L 弓丨物 B3 ；所述的檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP可視化試劑盒的應(yīng)用，包含以下步驟(1)配制RT-LAMP反應(yīng)體系，按終濃度計算，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶為105U/L、10倍反應(yīng)緩沖液(IOXThermoPol Reaction Buffer)為 1 X/L、鏈置換 DNA 聚合酶 0. 32U/L、dNTP 混合物為 0. 4mmol/L、甜菜堿(Betaine)為 1 2mol/L、Calcein 為 25 μ mol/L、MnCl2 為 0. 5mmol/ L、MgSO4 為 4 6mmol/L、FIP 引物為 0. 8 μ mol/L、BIP 引物組為 0. 8 μ mol/L、F3 引物為 0. 2 μ mol/L以及B3引物為0. 2 μ mol/L ；待測樣品RNA為3 5g/L ；(2)反應(yīng)將步驟(1)配制好的反應(yīng)體系反應(yīng)，條件為61 65°C恒溫反應(yīng)，滅活；(3)結(jié)果判讀通過自然光照下或紫外光下判讀結(jié)果或是二者結(jié)合判讀①在自然光下反應(yīng)產(chǎn)物為綠色，說明待測樣品含有日本乙型腦炎病毒；在自然光下反應(yīng)產(chǎn)物為橙色，說明待測樣品不含有日本乙型腦炎病毒；②在紫外光下反應(yīng)產(chǎn)物呈現(xiàn)明顯的綠色熒光，說明待測樣品含有日本乙型腦炎病毒，無熒光或綠色熒光不明顯，說明待測樣品含有日本乙型腦炎病毒。步驟(1)中所述的甜菜堿的終濃度優(yōu)選為lmol/L ；步驟(1)中所述的MgSO4的終濃度優(yōu)選為4mmol/L ；步驟⑵中所述的恒溫反應(yīng)的時間優(yōu)選為50 120min ；步驟O)中所述的恒溫反應(yīng)的條件優(yōu)選為64°C反應(yīng)SOmin ；
步驟O)中所述的滅活的條件優(yōu)選為75 86°C處理2 IOmin ；更優(yōu)選為80°C 處理4min。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點和有益效果(1) RT-LAMP成本低廉，利用Bst DNA polymerase在64°C實現(xiàn)等溫擴(kuò)增，不需要復(fù)雜且昂貴的PCR儀，因此，本發(fā)明提供的試劑盒使用成本低。(2)本發(fā)明所提供的試劑盒反應(yīng)迅速，利用AMV反轉(zhuǎn)錄酶實現(xiàn)一步法RT-LAMP，無需增加42°C Ih的反轉(zhuǎn)錄過程，可以在90min內(nèi)完成反應(yīng)，最快可以在17min內(nèi)完成。(3)本發(fā)明提供的試劑盒得到的反應(yīng)結(jié)果易于觀察，LAMP在DNA擴(kuò)增過程中產(chǎn)生大量焦磷酸鎂沉淀使反應(yīng)液呈現(xiàn)渾濁，在反應(yīng)結(jié)束后無需瓊脂糖凝膠電泳即可直接肉眼觀察反應(yīng)管中渾濁來判斷陽性與否，如果在反應(yīng)前加入鈣黃綠素和氯化錳，陽性反應(yīng)管在自然光下就會呈現(xiàn)出綠色，置于紫外光下則呈現(xiàn)強(qiáng)烈的綠色熒光。(4)本發(fā)明提供的試劑盒特異性好，對黃病毒屬內(nèi)的豬瘟病毒等都呈陰性反應(yīng)； 靈敏度高，最低可以檢測到IOpg的RNA模板，即使是幾個病毒粒子，也能被快速準(zhǔn)確的檢測出來。(5)本發(fā)明所述的可視化RT-LAMP試劑盒可快速、靈敏地檢測日本乙型腦炎病毒， 其操作簡單、成本低廉，反應(yīng)結(jié)果易于觀察，特異性好，非常適用于出口檢疫、食品衛(wèi)生以及畜牧養(yǎng)殖場的現(xiàn)場檢測，易于大范圍推廣應(yīng)用。


圖1為LAMP反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果圖，其中A為不同MgSO4濃度與電泳亮度關(guān)系圖，泳道M為DNAMarker DL2000,泳道1為 MgSO4濃度為2mM反應(yīng)的產(chǎn)物，泳道2為MgSO4濃度為4mM反應(yīng)的產(chǎn)物，泳道3為MgSO4濃度為6mM反應(yīng)的產(chǎn)物，泳道4為MgSO4濃度為8mM反應(yīng)的產(chǎn)物，泳道5為陰性對照組；B為不同Betaine濃度與電泳亮度關(guān)系圖，泳道M為DNA Marker DL2000,泳道1 為陰性對照組，泳道2為Betaine濃度為0. 5M反應(yīng)的產(chǎn)物，泳道3為Betaine濃度為1. OM 反應(yīng)的產(chǎn)物，泳道4為Betaine濃度為1. 5M反應(yīng)的產(chǎn)物，泳道5為Betaine濃度為2. OM反應(yīng)的產(chǎn)物；泳道6為Betaine濃度為2. 5M反應(yīng)的產(chǎn)物；C為不同內(nèi)外引物濃度比例與電泳亮度關(guān)系圖，泳道M為DNA Marker DL2000，泳道1內(nèi)外引物濃度比為2 1，泳道2內(nèi)外引物濃度比為4 1，泳道3內(nèi)外引物濃度比為 6 1，泳道4內(nèi)外引物濃度比為8 1，泳道5為陰性對照組。圖2為LAMP反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果圖，其中A為不同溫度下反應(yīng)的電泳亮度關(guān)系圖，泳道M為DNA Marker DL2000,泳道1為反應(yīng)溫度為65°C的產(chǎn)物，泳道2為反應(yīng)溫度為64°C的產(chǎn)物，泳道3為反應(yīng)溫度為63°C的產(chǎn)物，泳道4為反應(yīng)溫度為62 °C的產(chǎn)物，泳道5為反應(yīng)溫度為6rC的產(chǎn)物，泳道6為陰性對照組；B為不同反應(yīng)時間下的電泳亮度關(guān)系圖，泳道M為DNA Marker DL2000,泳道1為陰性對照組，泳道2為反應(yīng)時間為50min的產(chǎn)物，泳道3為反應(yīng)時間為70min的產(chǎn)物，泳道 4為反應(yīng)時間為80min的產(chǎn)物，泳道5為反應(yīng)時間為IOOmin的產(chǎn)物，泳道6為反應(yīng)時間為 120min的產(chǎn)物。
圖3為本發(fā)明提供的可視化RT-LAMP試劑盒的特異性結(jié)果圖，其中泳道M 為 DNA Marker DL2000 ；泳道1是以JEV基因組為模板的RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物；泳道2是以CSFV基因組為模板的RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物；泳道3是以PRRSV基因組為模板的RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物；泳道4是以PPV基因組為模板的LAMP反應(yīng)產(chǎn)物；泳道5是以PRV基因組為模板的LAMP反應(yīng)產(chǎn)物；泳道6為陰性對照。圖4為RT-LAMP和RT-PCR的靈敏度檢測結(jié)果圖，其中A為利用本發(fā)明提供的可視化RT-LAMP試劑盒得到的產(chǎn)物在紫外線照射下得到的圖；B為利用本發(fā)明提供的可視化RT-LAMP試劑盒得到的產(chǎn)物在日光照射下得到的圖；C為利用RT-PCR方法得到的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳得到的圖；圖中均為1的模板為JEV RNA進(jìn)行10倍稀釋；2的模板為JEV RNA進(jìn)行IO2倍稀釋；3的模板為JEV RNA進(jìn)行IO3倍稀釋；4的模板為JEV RNA進(jìn)行IO4倍稀釋；5的模板為JEV RNA進(jìn)行IO5倍稀釋；6為陰性對照。圖5為RT-LAMP是可視化結(jié)果圖，其中A為在紫外燈下觀察反應(yīng)體系，B為在自然光下觀察反應(yīng)體系；圖A和圖B中，“ + ”表示反應(yīng)呈現(xiàn)陽性結(jié)果，“_”表示反應(yīng)呈現(xiàn)陰性對照。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。以下實施例中所用的引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；Bst DNA 聚合酶大片段購自New England公司；甜菜堿(Betaine)、鈣黃綠素(Calcein)、MnCl2和 MgSO4購自Sigma公司。實施例1一、引物設(shè)計根據(jù)LAMP引物設(shè)計原則，針對JEV基因的保守區(qū)域序列，用primer 5. 0設(shè)計一套引物(如表1所示)，包括1對外部引物(F3和B3)和1對內(nèi)部引物(FIP和BIP)。FIP由 Flc (Fl的互補(bǔ)序列)、TTT連接和F2序列組成；BIP由Blc (Bi的互補(bǔ)序列)、ΤΤΤ連接和Β2 序列組成。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。合成后的引物用滅菌三蒸水稀釋成lOpmol/μ L溶液，-20°C保存。AAGTTACTGCTATCATGCTTCAGTCACTGACATCTCGACGGTGGCTCGGTGCCCCACGAC
TGGAGAAGCCCACAACGAGAAGCGAGCTGATAGTAGCTATGTGTGCAAACAAGGCTTCACTGACCGTGGGTGGGGCAACGGATGTGGATTTTTCGGGAAGGGAAGCATTGACACATF3F2GTGCAAAATTCTCCTGCACCAGTAAAGCGATTGGGAGAACAATCCAGCCAGAAAACATFlCAAATACAAAGTTGGCATTTTTGTGCATGGAACCACCACTTCGGAAAA |CCATGG| GAATTBlcNcolATTCAGCGCAAGTTGGGGCGTCCCAGGCGGCAAAGTTTACAGTAACACCCAATGCTCCTB2cTCGGTAGCCCTCAAACTTGGTGACTACGGAGAAGTCACACTGGACTGTGAGCCAAGGAB3GTGGACTGAACACTGAAGCG ；下劃線標(biāo)示的為引物在基因中的位置，框中的是酶切位點。表1 JEV可視化RT-LAMP的引物
引物序列(5’-3’)長度F3GGGCAACGGATGTGGATTT19B3GTTTGAGGGCTACCGAAGGA20FIPTGTTTTCTGGCTGGATTGTTCTCCTTTGGG47(Flc+F2)AAGGGAAGCATTGACACBIPTTTTGTGCATGGAACCACCACTTCTTTGTA46(Blc+B2)AACTTTGCCGCCTGGG二、RT-LAMP 反應(yīng)1、病毒RNA的抽提取日本乙型腦炎病毒疫苗株SA14-14-2 (豬乙型腦炎活疫苗，武漢科前動物生物制品有限責(zé)任公司)。使用Trizol Reagent抽提RNA，按照以下步驟進(jìn)行抽提(1)將250 μ L液體樣品加入1. 5mL離心管中，再加入750 μ L冰預(yù)冷的RNAiso Reagent (TaKaRa)；(2)將樣品劇烈混勻后，在室溫靜置5min ；(3)加入250μ L氯仿，劇烈振蕩10s，使液體充分混勻呈乳白狀(無分相現(xiàn)象)后， 再室溫靜置5min ；(4)在 4°C條件下，以 12000r/min 離心 15min ；(5)將上層水相轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中，加入等體積的異丙醇，上下顛倒混勻， 然后在4°C條件下靜置10 15min ；(6)在4°C條件下，以12000r/min離心15min，小心并盡可能去掉上清；(7)用ImL體積百分比75%的乙醇溶液洗滌RNA沉淀和管壁，在4°C條件下，以 12000r/min離心8min，然后小心棄去乙醇；
CCATGG
Ncol
8
(8)將RNA沉淀進(jìn)行干燥(不能完全干燥)處理后，用10 μ L RNase-free水將RNA 溶解，加入0. 5 μ LRNA酶抑制劑(TaKaRa公司)(40U)，_80°C冰箱中儲存?zhèn)溆谩?、RT-LAMP檢測體系的建立Notomi 等(Notomi, T. ，Okayama, H. ，Masubuchi, H. ，et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J]. Nucleic Acids Res，2000，28 :E63)提供的方法構(gòu)建25 μ L RT-LAMP反應(yīng)體系，依次對MgSO4、Betaine、內(nèi)外引物濃度比例進(jìn)行優(yōu)化，得到的結(jié)果進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。通過設(shè)置不同終濃度的MgSO4 :2mM、4mM、6mM、8Mm ；其他成分的用量如表2所示(結(jié)果如圖IA所示)；不同終濃度的Betaine :0· 5Μ、1· 0Μ、1· 5Μ、2· 0Μ、2· 5M)；其他成分的用量如表2所示(結(jié)果如圖IB所示)；不同終濃度的內(nèi)外引物濃度比例2 1,4 1,6 1， 8 1(內(nèi)引物為BIP+FIP，外引物為B3+F3)，此時具體的引物濃度比為0. 2μΜ 0. 1 μ Μ, 0. 4 μ M 0. 1 μ Μ，0. 6 μ M 0. 1 μ Μ，0. 8 μ M 0. 1 μ Μ，其他成分的用量如表2所示(結(jié)果如圖IC所示)。檢測條件為64°C恒溫80min，8(TC滅活％iin，然后終止反應(yīng)。根據(jù)所得的實驗結(jié)果，最終確定優(yōu)化的檢測體系(25 μ L)如表2所示。表2優(yōu)化的檢測體系成分用量終濃度3、RT-LAMP檢測條件的優(yōu)化為了得到最優(yōu)化的反應(yīng)溫度，將LAMP反應(yīng)分別置于61°C、62°C、63°C、64°C及 65°C，反應(yīng)時間是90min，反應(yīng)體系如表2所示。從多次重復(fù)試驗中確定最佳反應(yīng)溫度(結(jié)果如圖2A所示)，圖2A的結(jié)果說明最佳反應(yīng)溫度為64°C。以最佳反應(yīng)溫度(64°0，將反應(yīng)時間按5011^11、701^11、801^11、1001^11及1201^11遞
增，反應(yīng)體系如表2所示，從多次重復(fù)試驗中確定最佳反應(yīng)時間。每次擴(kuò)增反應(yīng)同時設(shè)DEPC
權(quán)利要求
1.一種檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP可視化試劑盒，其特征在于包含引物組和顯色物質(zhì)；所述的引物組如下所示F3 :5’ -GGGCAACGGATGTGGATTT-3，；B3 :5’ -GTTTGAGGGCTACCGAAGGA-3’ ；FIP :5’ -TGTTTTCTGGCTGGATTGTTCTCCTTTGGGAAGGGAAGCATTGACAC-3’ ；BIP :5’ -TTTTGTGCATGGAACCACCACTTCTTTGTAAACTTTGCCGCCTGGG-3，；所述的顯色物質(zhì)為鈣黃綠素和氯化錳。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP可視化試劑盒，其特征在于所述的試劑盒還包含dNTP混合物、MgS04、10倍反應(yīng)緩沖液、鏈置換DNA聚合酶、甜菜堿和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP可視化試劑盒，其特征在于所述的試劑盒包含5U/ μ L的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、10倍反應(yīng)緩沖液、8U/L的鏈置換DNA聚合酶、2. 5mmol/L的dNTP、10mol/L的甜菜堿、250 μ mol/L的鈣黃綠素、25mmol/L的氯化錳、 4mmol/L 的 MgSO4,10 μ mol/L 弓丨物 FIP、10 μ mol/L 弓丨物 BIP、10 μ mol/L 弓丨物 F3 禾口 10 μ mol/ L引物B3。
4.權(quán)利要求1 3任一項所述的檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP可視化試劑盒的應(yīng)用，其特征在于包含以下步驟(1)配制RT-LAMP反應(yīng)體系，按終濃度計算，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶為105U/L、10倍反應(yīng)緩沖液為1倍/L、鏈置換DNA聚合酶0. 32U/L、dNTP混合物為0. 4mmol/L、甜菜堿為1 2mol/L、 鈣黃綠素為 25 μ mol/L、氯化錳為 0. 5mmol/L、MgS04 為 4 6mmol/L、FIP 引物為 0. 8 μ mol/ L、BIP引物組為0. 8 μ mol/L、F3引物為0. 2 μ mol/L、B3引物為0. 2 μ mol/L以及待測樣品 RNA 為 3 5g/L ；(2)反應(yīng)將步驟(1)配制好的反應(yīng)體系反應(yīng)，條件為61 65°C恒溫反應(yīng)，滅活；(3)結(jié)果判讀通過自然光照下或紫外光下判讀結(jié)果或是二者結(jié)合判讀①在自然光下反應(yīng)產(chǎn)物為綠色，說明待測樣品含有日本乙型腦炎病毒；在自然光下反應(yīng)產(chǎn)物為橙色，說明待測樣品不含有日本乙型腦炎病毒；②在紫外光下反應(yīng)產(chǎn)物呈現(xiàn)明顯的綠色熒光，說明待測樣品含有日本乙型腦炎病毒， 無熒光或綠色熒光不明顯，說明待測樣品含有日本乙型腦炎病毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP可視化試劑盒的應(yīng)用，其特征在于步驟(1)中所述的甜菜堿的終濃度為lmol/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP可視化試劑盒的應(yīng)用，其特征在于步驟(1)中所述的MgSO4的終濃度為4mmol/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP可視化試劑盒的應(yīng)用，其特征在于步驟O)中所述的恒溫反應(yīng)的時間為50 120min。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP可視化試劑盒的應(yīng)用，其特征在于步驟O)中所述的恒溫反應(yīng)的條件為64°C反應(yīng)80min。
9.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP可視化試劑盒的應(yīng)用，其特征在于步驟O)中所述的滅活的條件為75 86°C處理2 lOmin。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP可視化試劑盒的應(yīng)用，其特征在于步驟O)中所述的滅活的條件為80°C處理％iin。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測日本乙型腦炎病毒的RT-LAMP可視化試劑盒及其應(yīng)用。該可視化試劑盒包含引物組和顯色物質(zhì)；引物為如SEQ ID NO1～4所示的序列，顯色物質(zhì)為鈣黃綠素和氯化錳。該試劑盒的使用方法如下首先配制RT-LAMP反應(yīng)體系，包含AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、1倍反應(yīng)緩沖液、鏈置換DNA聚合酶、dNTP混合物、甜菜堿、鈣黃綠素、氯化錳、MgSO4、FIP引物、BIP引物組、F3引物、B3引物以及待測樣品RNA；接著將反應(yīng)體系于61～65℃恒溫反應(yīng)，滅活；通過自然光照下或紫外光下判讀結(jié)果或是二者結(jié)合判讀在自然光下反應(yīng)產(chǎn)物為綠色，說明待測樣品含有日本乙型腦炎病毒；在紫外光下反應(yīng)產(chǎn)物呈現(xiàn)明顯的綠色熒光，說明待測樣品含有日本乙型腦炎病毒。
文檔編號C12Q1/70GK102399909SQ20111041685
公開日2012年4月4日 申請日期2011年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月13日
發(fā)明者喬進(jìn)平, 劉薇, 勾紅潮, 張學(xué)濤, 王波, 趙明秋, 陳金頂 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)