專(zhuān)利名稱(chēng)：低分化的甲狀腺癌細(xì)胞系pdtc-1及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種低分化的甲狀腺癌細(xì)胞系roTC-ι及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
甲狀腺未分化癌是致死率較高的腫瘤，雖然占甲狀腺惡性腫瘤的1% _5%，但甲狀腺未分化癌死亡患者卻占甲狀腺癌死亡患者的一半以上，即使采用包括手術(shù)、放療、化療的綜合治療，中位生存期僅2.9-10月，I年生存率在9.7 % -37.8 %，3年生存率在
11.7%-31.2%。低分化的甲狀腺癌是甲狀腺未分化癌的一種特殊類(lèi)型，是分化好的甲狀腺癌向未分化的甲狀腺癌演化的一個(gè)階段，因此對(duì)于研究甲狀腺癌的生物學(xué)特點(diǎn)有重要的價(jià)值。由于甲狀腺未分化 癌發(fā)病率低、死亡率高，進(jìn)行大樣本的隨機(jī)對(duì)照研究較困難，文獻(xiàn)報(bào)道多為回顧性總結(jié)，缺乏可信度較高的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)，因而建立動(dòng)物的移植瘤模型便成為進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究的理想方法。1962年英國(guó)人Grist首先發(fā)現(xiàn)裸小鼠(nude mice)，之后研究表明這是由于小鼠染色體等位基因突變而引起，表現(xiàn)為先天性胸腺發(fā)育不良，皮膚無(wú)毛，T淋巴細(xì)胞免疫缺陷。1969年Rygaard和Povlesev首先將人類(lèi)結(jié)腸腺癌移植裸小鼠成功，為腫瘤的研究開(kāi)創(chuàng)了新局面。目前尚無(wú)有關(guān)甲狀腺低分化癌的細(xì)胞株及腫瘤模型報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種低分化的甲狀腺癌細(xì)胞株及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用。本發(fā)明所提供的低分化的甲狀腺癌細(xì)胞株，其保藏編號(hào)為CGMCC N0.4939。本發(fā)明的培養(yǎng)上述細(xì)胞株的方法，包括如下步驟:將上述細(xì)胞株接種于細(xì)胞培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，得到增殖的權(quán)利要求1所述細(xì)胞株；所述細(xì)胞培養(yǎng)基的含10%胎牛血清的PRM 1640培養(yǎng)基。上述培養(yǎng)方法中，所述培養(yǎng)的溫度為37°C，所述培養(yǎng)的二氧化碳體積濃度為5%。上述細(xì)胞株在構(gòu)建用于開(kāi)發(fā)具有抑制甲狀腺癌功能的藥物的模型中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述細(xì)胞株在開(kāi)發(fā)具有抑制甲狀腺癌功能的藥物中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述細(xì)胞株在構(gòu)建甲狀腺癌移植瘤模型中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述任一所述應(yīng)用中，所述甲狀腺癌為分化好的甲狀腺癌、低分化的甲狀腺癌和/或未分化的甲狀腺癌。上述任一所述應(yīng)用中，所述模型為鼠模型。本發(fā)明建立了甲狀腺低分化癌的細(xì)胞系，并且利用其成功地建立了裸鼠移植瘤模型，為研究甲狀腺癌細(xì)胞學(xué)提供可篩選的細(xì)胞系，可用于構(gòu)建篩選甲狀腺癌敏感化療藥物的重要模型。在本發(fā)明的基礎(chǔ)上，可以從基因水平、從蛋白質(zhì)水平研究甲狀腺分化好、低分化及未分化癌的差異，對(duì)于闡述甲狀腺癌的發(fā)生機(jī)制、發(fā)現(xiàn)治療靶點(diǎn)有重要意義。本發(fā)明為研究甲狀腺癌的演化及低分化癌的生物學(xué)特性提供平臺(tái)，利于對(duì)甲狀腺癌的發(fā)生機(jī)制、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)進(jìn)行深入研究。


圖1為裸鼠甲狀腺癌移植瘤生長(zhǎng)曲線。圖2為裸鼠移植瘤(接種后第20天)。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、低分化的甲狀腺癌細(xì)胞株及其制備與應(yīng)用一、制備及驗(yàn)證本發(fā)明通過(guò)下述方法建立低分化的甲狀腺癌細(xì)胞系roTC-ι:細(xì)胞分離篩選:腫瘤標(biāo)本為低分化甲狀腺癌的離體標(biāo)本，取新鮮的手術(shù)標(biāo)本，選擇非壞死區(qū)域“魚(yú)肉狀”的腫瘤組織，進(jìn)行細(xì)胞分離和篩選，得到目的細(xì)胞株，記作TOTC-1。將細(xì)胞株roTC-ι接種于含10%胎牛血清的PRM 1640培養(yǎng)基，在37°C 5% C02孵箱條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為2周，得到第一代培養(yǎng)細(xì)胞；將第一代培養(yǎng)細(xì)胞再接種于10%胎牛血清的PRM 1640培養(yǎng)基，在37°C 5%的CO2孵箱條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為2周，得到第二代培養(yǎng)細(xì)胞；如此培養(yǎng)10代。觀察每代細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。每代細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線基本一致，說(shuō)明該細(xì)胞株I3DTC-1的增殖能力穩(wěn)定。

將細(xì)胞株roTC-ι于2011年6月15日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCCJia:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為CGMCC N0.4939，分類(lèi)命名為低分化甲狀腺癌細(xì)胞系-1，細(xì)胞株名稱(chēng)為I3DTC-1。二、應(yīng)用一建立甲狀腺癌移植瘤模型裸鼠購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物編號(hào)SCXK(京)2009-0004，均為雌性BALB/c nu小鼠，5周齡，體重(18±2)g。裸鼠飼養(yǎng)在光照充足，常溫，飲食不限的SPF級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)室內(nèi)。模型構(gòu)建方法:取健康裸鼠，選取IO6細(xì)胞注射至裸鼠右腋下，飼養(yǎng)4 6周，得到的裸鼠即為甲狀腺癌移植瘤模型。腫瘤檢測(cè):接種細(xì)胞株roTC-Ι后(接種當(dāng)天記作第O天)，接種2-3周后即可見(jiàn)皮下硬結(jié)，在腫瘤長(zhǎng)徑達(dá)到0.5cm即可開(kāi)始測(cè)量，隔天以游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑、短徑，按V=ab2/2計(jì)算腫瘤體積并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。待裸鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)至直徑達(dá)1.5cm時(shí)處死小鼠，在無(wú)菌條件下剝離腫瘤，生理鹽水清洗數(shù)次，剔除壞死的組織，將剩余的腫瘤組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，檢測(cè)指標(biāo)見(jiàn)表I。表I中的各個(gè)分子均是低分化的甲狀腺癌的標(biāo)志性物質(zhì)。免疫組化檢測(cè)中使用的一抗如下:免疫組化試劑均購(gòu)自福州邁新公司，檢測(cè)E-cadherin:E_鈣粘附蛋白，鼠抗人單克隆抗體，MAB-0589 ；檢測(cè)β -catenin: β -1丐聯(lián)蛋白，鼠抗人單克隆抗體，ΜΑΒ-0259 ；
檢測(cè)TG:甲狀腺球蛋白，鼠抗人單克隆抗體，MAB-0161 ；檢測(cè)P53:P53,鼠抗人單克隆抗體，MAB-0142 ；檢測(cè)K1-67:K1-67,鼠抗人單克隆抗體，MAB-0129 ；檢測(cè)VEGFR-2:KDR/FIK_1，兔抗人多克隆抗體，RAB-0522 ；檢測(cè)PDGFR- β:兔抗人多克隆抗體，Labvision公司，RB-1692 ；檢測(cè)VEGF:血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，兔抗人多克隆抗體，RAB-0157 ；免疫組化檢測(cè)中使用的二抗為福州邁新公司的即用型非生物素免疫組化檢測(cè)試劑盒，產(chǎn)品編號(hào)Kit-9901，試劑盒包括增強(qiáng)劑和酶標(biāo)羊抗鼠/兔聚合物兩種試劑。重復(fù)上述模型構(gòu)建和腫瘤檢測(cè)的操作，重復(fù)20次，第一次操作得到的模型記作第I代模型，第二次操作得到的模型記作第2代模型，依次類(lèi)推，第20次操作得到的模型記作第20代模型。每次觀察的時(shí)間為30-50天。模型中腫瘤的表型如圖2所示。第13代的腫瘤生長(zhǎng)曲線如圖1所示，其它代的腫瘤生長(zhǎng)曲線與其無(wú)顯著差異。由此得出的結(jié)論:該甲狀腺低分化癌細(xì)胞系成瘤穩(wěn)定，生物學(xué)特性完整，可作為以后研究甲狀腺癌藥物篩選的良好模型。每代的免疫組化檢測(cè)結(jié)果如表I所示。表I中免疫組化結(jié)果判斷根據(jù)福州邁新公司提供的參考標(biāo)準(zhǔn)，土表示較難判斷，++++表示強(qiáng)陽(yáng)性，+++表示中陽(yáng)性，++表示陽(yáng)性，+表示弱陽(yáng)性，-表示陰性。

表I裸鼠傳代過(guò)程中免疫組化指標(biāo)變化
權(quán)利要求
1.低分化的甲狀腺癌細(xì)胞株，其保藏編號(hào)為CGMCCN0.4939。
2.一種培養(yǎng)權(quán)利要求1所述細(xì)胞株的方法，包括如下步驟:將權(quán)利要求1所述細(xì)胞株接種于細(xì)胞培養(yǎng)基中，培養(yǎng)，得到增殖的權(quán)利要求1所述細(xì)胞株； 所述細(xì)胞培養(yǎng)基的含10%胎牛血清的PRM 1640培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述培養(yǎng)的溫度為37°C，所述培養(yǎng)的二氧化碳體積濃度為5%。
4.權(quán)利要求1所述細(xì)胞株在構(gòu)建用于開(kāi)發(fā)具有抑制甲狀腺癌功能的藥物的模型中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述細(xì)胞株在開(kāi)發(fā)具有抑制甲狀腺癌功能的藥物中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1所述細(xì)胞株在構(gòu)建甲狀腺癌移植瘤模型中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一所述的應(yīng)用，其特征在于:所述甲狀腺癌為分化好的甲狀腺癌、低分化的甲狀腺癌和/或未分化的甲狀腺癌。
8.根據(jù)權(quán)利要 求4-7中任一所述的應(yīng)用，其特征在于:所述模型為鼠模型。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了低分化的甲狀腺癌細(xì)胞系PDTC-1及其應(yīng)用。該細(xì)胞株為低分化的甲狀腺癌細(xì)胞株，其保藏編號(hào)為CGMCC No.4939。本發(fā)明建立了甲狀腺低分化癌的細(xì)胞系，并且利用其成功地建立了裸鼠移植瘤模型，為研究甲狀腺癌細(xì)胞學(xué)提供可篩選的細(xì)胞系，可用于構(gòu)建篩選甲狀腺癌敏感化療藥物的重要模型。在本發(fā)明的基礎(chǔ)上，可以從基因水平、從蛋白質(zhì)水平研究甲狀腺分化好、低分化及未分化癌的差異，對(duì)于闡述甲狀腺癌的發(fā)生機(jī)制、發(fā)現(xiàn)治療靶點(diǎn)有重要意義。本發(fā)明為研究甲狀腺癌的演化及低分化癌的生物學(xué)特性提供平臺(tái)，利于對(duì)甲狀腺癌的發(fā)生機(jī)制、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)進(jìn)行深入研究。
文檔編號(hào)C12R1/91GK103160467SQ20111041691
公開(kāi)日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2011年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月14日
發(fā)明者馬潔, 安常明, 韓志楷, 王錚, 趙平 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所