專利名稱：一種添加還原型谷胱甘肽提升酮古龍酸菌產(chǎn)2-酮基-l-古龍酸生產(chǎn)強度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種添加還原型谷胱甘肽提升酮古龍酸菌產(chǎn)2-酮基-L-古龍酸生產(chǎn)強度的方法， 屬于發(fā)酵制備維生素C技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
維生素C(即L-抗壞血酸)是人體必需的一種水溶性維生素，動物體內(nèi)不能自身合成，一般通過食用水果蔬菜獲得。維生素C在食品、醫(yī)藥、化工、化妝品、飼料等行業(yè)應用廣泛。其應用范圍在不斷拓展，隨著人們對營養(yǎng)保健的關(guān)注，維生素C的需求將會不斷擴大。目前，我國生產(chǎn)維生素C的方法基本沿用了 60年代尹光琳等人發(fā)明的“二步發(fā)酵法”，第一步發(fā)酵使用黑醋桿菌將山梨醇轉(zhuǎn)化為L-山梨糖，第二步發(fā)酵為大小菌混菌發(fā)酵，即使用俗稱大菌的巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)和俗稱小菌的酮古龍酸菌 (Ketogulonigenium vulgare)混合菌系發(fā)酵，將山梨糖轉(zhuǎn)化為維生素C的前體物2-酮基-L-古龍酸，第一步反應技術(shù)相對成熟，轉(zhuǎn)化率高，而第二步由于涉及混菌混合發(fā)酵，一直是維生素C生產(chǎn)領(lǐng)域的難題。隨著維生素C發(fā)酵行業(yè)競爭越來越激烈，發(fā)酵工藝的優(yōu)化、資源的合理利用的要求不斷提高。減少發(fā)酵過程環(huán)境的污染、提高原料的利用率，提高生產(chǎn)強度等等技術(shù)要求是今后生產(chǎn)發(fā)展的趨勢。維生素C發(fā)酵第二步中糖酸轉(zhuǎn)化率已經(jīng)很高，一般都有90%以上，所以優(yōu)化的重點就是縮短發(fā)酵周期，提高發(fā)酵生產(chǎn)強度。本專利就是基于這點，通過向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加還原型谷胱甘肽提升酮古龍酸菌產(chǎn)2-酮基-L-古龍酸的生產(chǎn)強度。谷胱甘肽(glutathione)是一種自然界廣泛存在、同時具有Y -谷氨酰基和巰基的活性三肽，在生物體內(nèi)有多種重要的生理功能，特別是具有抵抗?jié)B透壓和維持體內(nèi)正常的氧化還原環(huán)境的能力。目前，添加谷胱甘肽旨在促進混菌體系更好的適應發(fā)酵環(huán)境，提高菌體特別是酮古龍酸菌生物量，從而縮短發(fā)酵周期，提高發(fā)酵生產(chǎn)強度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是添加還原型谷胱甘肽促進菌體生長，縮短發(fā)酵周期和產(chǎn)量，從而提高產(chǎn)2-酮基-L-古龍酸生產(chǎn)強度的方法。1.菌株酮古龍酸菌(Ketogulonigenium vulgare)DSM 4025 及巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)ATCC 21916，由江山制藥有限公司(靖江)提供。2.培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法種子培養(yǎng)基(g/L) =L-山梨糖20，玉米漿1. 5，牛肉膏3，酵母浸出物3，大豆蛋白胨 10，磷酸二氫鉀1，無水硫酸鎂0. 2，尿素1，碳酸鈣1。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L) :L-山梨糖80，玉米漿5，尿素12，磷酸二氫鉀1，無水硫酸鎂
30. 1，碳酸鈣5，其中碳酸鈣、L-山梨糖和氮源分別單獨滅菌，接種時添加，還原型谷胱甘肽用超純水配制，0. 22 μ m過濾除菌，接種時添加。培養(yǎng)基都由自來水配制，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH到6. 7-7. 0，滅菌121°C，15min。3.大菌和小菌混合培養(yǎng)方法用接種環(huán)挑取平板上的小菌兩環(huán)，再挑取大菌一環(huán)制成混菌懸液，取混菌懸液涂斜面，30°C培養(yǎng)48h ；取斜面混合菌活化后菌液0. 4mL接種種子培養(yǎng)基75mL/750mL搖瓶中。 30°C，200rpm下培養(yǎng)18h，即制成大小菌混菌混合菌系，接入甘油管中進行保藏。4.培養(yǎng)方法從冷凍甘油管中取混菌保藏培養(yǎng)物種液IOmL接入發(fā)酵培養(yǎng)基(75mL/750mL搖瓶)，30°C，200rpm培養(yǎng)，定期取樣測定參數(shù)。5.分析方法菌體濃度測定取適量的菌懸液置于IOmL容量瓶中，加入適量的4mol/L鹽酸溶解菌懸液中的碳酸鈣，再加入去離子水定容至10mL，搖勻，用UV7500型可見光分光光度計，于 660nm處比色測OD值。2-KLG與L-山梨糖含量測定采用高效液相色譜(HPLC)測定。色譜柱=Aminex HPX-87H(Bio-Rad)，流動相0. 005mol/L H2S04,流速0. 5mL/min,柱溫；35 °C，進樣量 5 μ L，檢測器示差折光檢測器。本發(fā)明的有益效果在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加lg/L的還原型谷胱甘肽，與對照組相比較，發(fā)酵周期縮短了 11.8% (60h)，2-KLG產(chǎn)量提高了 5.07% (66. 3g)，生產(chǎn)強度提高了 27. 6% (1. llg(L · h)-1)。


圖1，為添加lg/L GSH對混合菌系生長的影響，圖例■未添加GSH ;〇添加Ig/ L 的 GSH。圖2，為添加lg/L GSH對混合菌系發(fā)酵產(chǎn)2_酮基-L-古龍酸的影響，圖例■未添加 GSH5O 添加 lg/L GSH。
具體實施例方式對照實施例本發(fā)明所用的菌種為酮古龍酸菌(Ketogulonigenium vulgare)與巨大芽孢桿菌(Bacillus meegaterium)混合菌系。從冷凍甘油管中取混菌保藏培養(yǎng)物 0. 3mL接入種子培養(yǎng)基(75mL/750mL搖瓶)，30°C，200rpm培養(yǎng)。正常發(fā)酵2-KLG終產(chǎn)量為 63. lg/L，發(fā)酵周期為68h，生產(chǎn)強度為0. 87g(L · h)-1。實施例1 在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加lg/L的還原型谷胱甘肽(GSH)，接種時添加，其余條件同對照實施例。添加實驗組發(fā)酵周期60h，相比對照組縮短他；2-KLG產(chǎn)量為66. 3g/L， 提高了 5. 07% ；生產(chǎn)強度為1. IKgO^hr1),提高了 27.6%。
權(quán)利要求
1. 一種添加還原型谷胱甘肽提升酮古龍酸菌產(chǎn)2-酮基-L-古龍酸生產(chǎn)強度的方法， 其特征為利用酮古龍酸菌(Ketogulonigenium vulgare)與巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)的混合菌系為生產(chǎn)菌株，發(fā)酵生產(chǎn)維生素C前體物質(zhì)2-酮基-L-古龍酸，通過向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加lg/L的谷胱甘肽，促進混菌菌體生長，主要促進小菌生物量提高和 2-酮基-L-古龍酸生產(chǎn)，提升生產(chǎn)強度，實現(xiàn)2-酮基-L-古龍酸高效生產(chǎn)。
全文摘要
本發(fā)明闡述了一種添加還原型谷胱甘肽(GSH)提升酮古龍酸菌產(chǎn)2-酮基-L-古龍酸生產(chǎn)強度的方法，屬于維生素C發(fā)酵生產(chǎn)領(lǐng)域。本發(fā)明利用酮古龍酸菌(Ketogulonigenium vulgare)與巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)混合菌系為生產(chǎn)菌株，通過向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加1g/L的還原型谷胱甘肽，促進混菌體的生產(chǎn)，提高生物量，縮短發(fā)酵周期，提高生產(chǎn)強度，實現(xiàn)2-酮基-L-古龍酸(2-KLG)的高效生產(chǎn)。添加1g/L GSH條件下，發(fā)酵周期為60h，2-KLG產(chǎn)量為66.3g/L，生產(chǎn)強度為1.11(g(L·h)-1)，與對照組相比發(fā)酵周期縮短了11.8％，2-KLG產(chǎn)量和生產(chǎn)強度分別提高了5.07％和27.6％。
文檔編號C12R1/11GK102424830SQ20111041927
公開日2012年4月25日 申請日期2011年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月15日
發(fā)明者劉立明, 陳堅, 黃政 申請人:江南大學