專利名稱：植物的一個賴氨酸酮戊二酸還原酶/酵母氨酸脫氫酶及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物一個賴氨酸酮戊二酸還原酶/酵母氨酸脫氫酶及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及一個來源于小麥的賴氨酸酮戊二酸還原酶/酵母氨酸脫氫酶及其編碼基因與應(yīng)用，以及其在提高植物種子中賴氨酸含量的應(yīng)用。屬于分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
必需氨基酸，是指人體自身不能合成或合成速度不能滿足人體需要，必需從食物中攝取的氨基酸。賴氨酸是八種必需氨基酸之一，被稱為“第一必需氨基酸”，是蛋白質(zhì)的重要組成部分。賴氨酸在生物機(jī)體的代謝中具有重要作用，賴氨酸缺乏會引起蛋白質(zhì)功能障礙，影響生物的生長發(fā)育。研究顯示，植物蛋白占全世界人口已攝取總蛋白的65%，而谷類作物籽粒提供的蛋白含量占其中的47% ；小麥?zhǔn)鞘澜缟献顬橹匾募Z食作物之一，小麥籽粒制品不僅供給人們熱量，而且也是人們重要的植物蛋白質(zhì)來源。然而，由于小麥等禾谷類作物種子蛋白質(zhì)中幾乎都存在著一些必需氨基酸匱乏的問題，即營養(yǎng)組成不平衡，因而影響了其種子蛋白的完全利用。賴氨酸是谷物中最缺乏的必需氨基酸。小麥籽粒賴氨酸含量較低，平均僅在 0. 44%左右，而一個健康成年人每天需要的賴氨酸量是30mg kg—1，因此遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足人體的需要。據(jù)報道，如果小麥面粉中賴氨酸的含量增加0. 2%，其可利用蛋白質(zhì)就增加60%， 因此提高小麥籽粒中賴氨酸的含量，就可顯著提高單位食物量的營養(yǎng)價值，可以大大改善小麥的營養(yǎng)品質(zhì)，從而帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。雙功能賴氨酸降解酶，賴氨酸酮戊二酸還原酶/酵母氨酸脫氫酶 (Lysketoglutarate reductase/saccharopine dehydrogenase,LKR/SDH)是植物中控制游離賴氨酸含量的主要調(diào)節(jié)子之一，在植物中酵母氨酸途徑被認(rèn)為是賴氨酸分解的主要代謝途徑。由一個基因編碼的雙功能酶賴氨酸-α-酮戊二酸還原酶/酵母氨酸脫氫酶(LKR/ SDH)是位于植物賴氨酸分解代謝途徑起始端的關(guān)鍵酶，催化分解賴氨酸為α-氨基脂肪酸和谷氨酸。LKR和SDH連接成為一個雙功能多肽，LKR首先將賴氨酸和α -酮戊二酸轉(zhuǎn)化為酵母氨酸，SDH又將酵母氨酸轉(zhuǎn)化為α-氨基半醛(α-aminoadipic semi-aldehyde) 和谷氨酸。α-氨基半醛在以后的代謝中又被轉(zhuǎn)化為乙酰CoA和谷氨酸分子。植物中賴氨酸分解代謝途徑的意義還不完全清楚，但一些研究提供的間接證據(jù)表明這條途徑對于種子發(fā)育過程中賴氨酸在體內(nèi)的平衡起調(diào)節(jié)作用，主要是維持種子中賴氨酸濃度的穩(wěn)定水平， 降解種子中過量的賴氨酸。研究表明植物種子中賴氨酸含量提高的同時，也會增加LKR/ SDH的活性，致使賴氨酸在種子中不能得到有效積累(Zhu XH, Tang GL, Fabinne Granier. A T-DNA Insertion Knockout of the Bifunctional Lysine-KetoglutarateReductase/ Saccaropine Dehydrogenase Gene Elevates Lysine Levels in ArabidopsisSeeds. Plant Physiol.，2001. 126 :1539-1545)。敲除LKR基因的擬南芥突變體的生長不受影響，而且賴氨酸也可得到一定程度的積累，表明賴氨酸分解代謝對于植物的正常生長和種子發(fā)育不是必需的，只是一系列調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的一個，而不是一個特定的阻止賴氨酸提高而造成潛在毒性的調(diào)節(jié)方式(Zhu XH, Tang GL, Fabinne Granier. A T-DNA Insertion Knockout of the BifunctionalLysine-Ketoglutarate Reductase/Saccaropine Dehydrogenase Gene Elevates LysineLevels in Arabidopsis Seeds. Plant Physiol. ,2001. 126 :1539-1545)。 通過RNAi抑制植物賴氨酸分解代謝中LKR/SDH基因的表達(dá)，降低植物中賴氨酸的分解代謝，可以提高植物中賴氨酸的含量。ZhiK2004)采用RNAi技術(shù)將雙鏈LKR在種子特異表達(dá)啟動子的驅(qū)動下轉(zhuǎn)入到擬南芥中，獲得了種子中賴氨酸含量從對照的0. 29-0. 39m0l%提高到0. 21-2. Ilmol%的轉(zhuǎn)基因植株(Zhu XH,Galili G. LysineMetabolism Is Concurrently Regulated by Synthesis and Catabolism in BothReproductive and Vegetative Tissues. Plant Physiol.，2004. 135 =129-136)；在玉米上，通過采用玉米胚乳特異性啟動子構(gòu)建RNAI載體，抑制玉米胚乳中LKR/SDH的表達(dá)，使玉米籽粒中的賴氨酸含量由30ppm 提高到500-700ppm ;Zhu (2003，2004)報道通過RNAi技術(shù)抑制LKR/SDH基因的表達(dá)，同時使細(xì)菌的DHDPS基因在擬南芥種子中特異性表達(dá)，可以產(chǎn)生加性效應(yīng)，使擬南芥種子中賴氨酸的含量大幅度提高(Zhu XH, Galili G. Increased Lysine Synthesis Coupled with aKnockout of Its Catabolism Synergistically Boosts Lysine Content and AlsoTransregulates the Metabolism of Other Amino Acids in Arabidopsis Seeds. PlantCell,2003. 15 :845-853 ；Zhu XH, Galili G. Lysine Metabolism Is Concurrently Regulated by Synthesis and Catabolism in Both Reproductive and Vegetative Tissues. Plant Physiol.，2004. 135 :129-136)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一個來源于小麥的賴氨酸酮戊二酸還原酶/酵母氨酸脫氫酶及其編碼基因。本發(fā)明提供的一個賴氨酸酮戊二酸還原酶/酵母氨酸脫氫酶，名稱為 TriticumaestivumLinn. Lys ketoglutarate reductase/saccharopine dehydrogenase (簡稱 TaLKR/SDH)，來源于小麥(Triticum aestivumLinn.)，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)a)序列表中的 SEQ ID No 1 ；b)將序列表中SEQ ID N2 :1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有酶活功能的催化分解賴氨酸為α-氨基脂肪酸和谷氨酸的氨基酸殘基序列。其中，序列表中的SEQ ID N2 :1由1049個氨基酸殘基組成。所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。小麥的一個賴氨酸酮戊二酸還原酶/酵母氨酸脫氫酶所述蛋白質(zhì)具有序列表中 SEQ ID No 1的氨基酸殘基序列。小麥的一種上述賴氨酸酮戊二酸還原酶/酵母氨酸脫氫酶的編碼基因，其特征在于a)序列表中SEQ ID No 2的DNA序列；
b)編碼序列表中SEQ ID No 1蛋白質(zhì)序列的多核苷酸序列；c)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID No 2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0. IXSSPE(或0. 1XSSC)，0. 1% SDS的溶液中，在65°C條件下雜交并洗膜。列表中的SEQ ID No 2由3351個脫氧核苷酸組成，其編碼序列為自5’端第1位至3147位脫氧核苷酸，編碼具有序列表中SEQ ID N2 :1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體、細(xì)胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。擴(kuò)增 TaLKR/SDH任一片段的引物對也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的另一目的是提供一種將本發(fā)明中的賴氨酸酮戊二酸還原酶/酵母氨酸脫氫酶基因TaLKR/SDH在提高植物種子中賴氨酸含量的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的提高植物種子中賴氨酸含量的應(yīng)用，是將所述編碼小麥賴氨酸酮戊二酸還原酶/酵母氨酸脫氫酶基因TaLKR/SDH片段導(dǎo)入植物組織或細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄出的RNA 形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)可以抑制植物組織或細(xì)胞本身賴氨酸酮戊二酸還原酶/酵母氨酸脫氫酶的表達(dá)量，從而使植物種子中賴氨酸含量獲得提高。所述編碼小麥賴氨酸酮戊二酸還原酶/酵母氨酸脫氫酶基因TaLKR/SDH可通過構(gòu)建TaLKR/SDH基因的RNAi植物表達(dá)載體并導(dǎo)入外植體；用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體可為任意一種雙元農(nóng)桿菌載體或可用于植物微彈轟擊的載體等，如PBI121、 pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pAHC25或其他衍生植物表達(dá)載體；使用本發(fā)明的I^aLKR/SDH構(gòu)建植物表達(dá)載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上一種種子特異表達(dá)啟動子；為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所使用的載體進(jìn)行加工，如加入具有抗性的抗生素標(biāo)記(卡那霉素、潮霉素等)或抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除草劑bar基因等)及可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或蛋白等(GUS基因、GFP基因等)。攜帶有TaLKR/SDH基因的RNAi植物表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織， 并將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或組織培育成植株。上述通過轉(zhuǎn)基因提高植物種子中賴氨酸含量的方法對所有植物均適用，既可適用于單子葉植物(小麥、水稻、玉米等)，也可以適用雙子葉植物(煙草、棉花等)。發(fā)明提供的hLKR/SDH基因來自小麥，實時定量PCR檢測結(jié)果表明TaLKR/SDH在小麥植株的根、莖、葉、幼胚和花序中均有表達(dá)，其中在幼胚葉中的表大量最高；轉(zhuǎn)基因煙草實驗證明該基因的超量表達(dá)使煙草葉片中的游離賴氨酸含量較對照明顯降低；構(gòu)建該基因的種子特異性表達(dá)RNAi載體并轉(zhuǎn)入小麥，小麥籽粒中的賴氨酸含量明顯提高。因此， TaLKR/SDH可作為目的基因?qū)胫参?包括單子葉和雙子葉植物)，提高植物的賴氨酸，具有較高的實際應(yīng)用價值。


圖1為TaLKR/SDHmRNA在不同組織器官中表達(dá)豐度的實時定量PCR檢測結(jié)果；圖2為TmpCAMBIA2301載體物理圖譜；圖3為TmpCAMBIA2301 TaLKR/SDH植物表達(dá)載體物理圖譜；
圖4為TmpCAMBIA2301 TaLKR/SDH轉(zhuǎn)基因煙草的PCR驗證照片；圖 5 為 TmpCAMBIA2301 TaLKR/SDHi 轉(zhuǎn)基因煙草的 RT-PCR 驗證照片；圖6轉(zhuǎn)TaLKR/SDH基因煙草葉片游離賴氨酸的含量測定結(jié)果(以CK含量為基數(shù) 1)；圖7為PUC18的示意圖；圖8為pAHC25的示意圖；圖9表達(dá)載體pAHC25 TaLKR/SDHRNAi結(jié)構(gòu)示意圖；圖10表達(dá)載體pAHC25 TaLKR/SDHRNAi構(gòu)建過程示意圖；圖11部分轉(zhuǎn)基因植株表達(dá)hLKR/SDHRNAi的PCR檢測電泳圖；圖12為13個LKR/SDHRNAi轉(zhuǎn)基因小麥株系籽粒游離態(tài)賴氨酸含量測定結(jié)果。具體發(fā)明實施方式以下涉及的引物Pl P^均委托上海生物工程公司合成。在各實施例中涉及的方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。實施例1 小麥I^aLKR/SDH的克隆利用生物信息學(xué)和常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)相結(jié)合的方法克隆小麥賴氨酸酮戊二酸還原酶/酵母氨酸脫氫酶基因TaLKR/SDH的DNA序列，具體方法為(lKaLKR/SDH基因片段的擴(kuò)增選用小麥栽培種揚(yáng)麥158開花后20天的幼胚作為實驗材料，采用SV TotalRNA lysis試劑盒(Promega公司，美國)提取總RNA。按照TaKaRa公司提供的方法 (PrimeScript Reverse Transcriptase)合成 cDNA 第一條鏈，并用其作模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。我們根據(jù)其他植物已知的賴氨酸分解代謝途徑關(guān)鍵酶基因LKR/SDH的核酸序列保守區(qū)域設(shè)計一對引物Pl SEQ ID No 6 :5， -TTCCTTGACTTCTATCGCTAATGCG-3，，P2 SEQ ID No 7 5' -GTCCACCACAGAAAGATGTAAAAGC-3，。采用Takara的LA-Taq酶，以揚(yáng)麥158開花后20天的幼胚cDNA為模板進(jìn)行常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。25μ IPCR反應(yīng)體系2. 5μ 1含MgCl2的10XPCR緩沖液，正、反向ΙΟμΜ的引物各 1. 0 μ 1，1. 0 μ 1 IOmM 的 dNTP (脫氧核苷酸混合物)，1. 0 μ 1 DNA 樣品，0. 25 μ ILA-Taq 酶(寶生物工程(大連)有限公司)，18. 5 μ 1雙蒸水。PCR反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5分鐘， 94°C變性1分鐘，55°C復(fù)性45秒，72°C延伸1分鐘，35個循環(huán)后，72°C延伸10分鐘。將擴(kuò)增得到的約600bp DNA片段用凝膠回收試劑盒(杭州愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司)按試劑盒提供的方案回收該片段，用PGEM-Tvector系統(tǒng)(Promega公司，美國)按試劑盒說明克隆該片段，測序(上海生物工程公司)。序列分析表明該序列編碼的氨基酸序列與野生二粒小麥的 LKR/SDH高度同源，因此確定獲得了 TaLKR/SDH基因片段。(2) TaLKR/SDH 基因 cDNA 全長的克隆取小麥栽培種揚(yáng)麥158開花后20天的幼胚作為實驗材料，采用SV TotalRNA lysis試劑盒(Promega公司，美國)提取總RNA。根據(jù)已經(jīng)獲得的TaLKR/SDH基因片段，我們設(shè)計了兩條特異性引物P3 SEQ ID No 8 5' -GACAGCATGGATAAAGTAGGACCAAAG-3，；
P4 SEQ ID No 9 :5，-CATTGCAAGAGTATGCATAGAGCTC-3，。3’端引物由3’ RACE試劑盒(invitrogen公司(美國))提供。取1 μ g總RNA進(jìn)行3’ RACE, RACE程序按照invitrogen公司提供的3’ RACE試劑盒說明書進(jìn)行。用P3與3’端引物進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，所得PCR產(chǎn)物經(jīng)稀釋100倍后取Iul做為模板，用P4與3’端引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，獲得該基因的cDNA的3’端。第一輪與第二輪 PCR 反應(yīng)條件均為95°C預(yù)變性:3min 后，94°C lmin，57°C 45s, 72°C Imin 30s，共；35 個循環(huán)；然后72°C延伸lOmin。同時根據(jù)已經(jīng)獲得的TaLKR/SDH基因片段，我們設(shè)計了 5’ RACE的兩條3’端特異引物，分別為P5 SEQ ID No 10 :5， -ACTTTATCCATGCTGTCATCAATTC-3，；P6 SEQ ID No 11 5' -TTAGGATCTCCACGGTGCGCATTAG-3，。取1 μ g總RNA進(jìn)行5’ RACE, RACE程序按照invitrogen公司(美國)提供的 5’ RACE試劑盒說明書進(jìn)行。P5 與試劑盒提供的 5，端通用引物 AAP :GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGI IGGGIIGGG IIG進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，所得PCR產(chǎn)物經(jīng)稀釋100倍后取Iul做為模板，用P6與試劑盒提供的 5' sites Adaptor Primer AUAP :GGCCACGCG TCGACTAGTAC 引物進(jìn)行第二輪 PCR 擴(kuò)增，獲得該基因cDNA的5，端。兩輪PCR反應(yīng)條件均為95°C預(yù)變性^iin后，94°C lmin, 60°C 45s, 72°C 2min，共；35 個循環(huán)；然后 72°C延伸 5min。所得5’ -RACE產(chǎn)物經(jīng)克隆測序后，與3’ -RACE產(chǎn)物測序結(jié)果進(jìn)行拼接(采用 DNAMAN生物學(xué)軟件進(jìn)行序列拼接)，獲得TaLKR/SDH全長cDNA序列。用1 μ g小麥栽培種揚(yáng)麥158開花后20天的幼胚總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)按試劑盒的方法反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，根據(jù)TaLKR/SDH cDNA編碼序列設(shè)計一對引物如下P7 SEQ ID No 12 5，-ATGGGGTCCGAGACAACTGAAAGAAATG-3，，P8 SEQ ID No 13 :5， -TCAGGTCTCCACTCTCTCGATCAGCTTG-3，。用P7和P8 —對引物來克隆TaLKR/SD的cDNA編碼序列。25 μ 1 PCR反應(yīng)體系含2. 5μ1含MgCl2W 10 X PCR緩沖液、正、反向10μ M的引物各1.0μ1、1.0μ1 IOmM的dNTP (脫氧核苷酸混合物)、1. 0 μ 1 cDNA模板和18. 5 μ 1雙蒸水，以及0. 25 μ ILA-Taq酶(寶生物工程(大連)有限公司)。PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性 3min后，94°C lmin，58°C 45s，72°C 3min30s，共；35 個循環(huán)；然后 72°C延伸 lOmin。將擴(kuò)增得到的約3300bp DNA片段用凝膠回收試劑盒(杭州愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司)按試劑盒提供的方案回收該片段，用PGEM-T vector系統(tǒng)(Promega公司，美國)按試劑盒說明克隆該片段， 測序(上海生物工程公司)。測序結(jié)果表明該序列就是目的序列，將該基因命名為Triticum aestivumLinn. Lys ketoglutarate reductase/saccharopine dehydrogenase ( M 禾爾 TaLKR/SDH)，其編碼蛋白SEQ ID No 1命名為TaLKR/SDH，.。將測序獲得的核苷酸序列SEQ ID N2 :2在國際基因庫(GenBank)中進(jìn)行搜索，發(fā)現(xiàn)從揚(yáng)麥158克隆得到的hLKR/SDH基因核苷酸序列與野生二粒小麥的LKR/SDH基因(GenBank number ⑶182251)的核苷酸有 99. 9%的相似性，而編碼的氨基酸序列完全相同。實施例2 TaLKR/SDH轉(zhuǎn)錄本的時空分布
用實時定量PCR的方法檢測TaLKR/SDH在揚(yáng)麥158植株中的組織分布情況，并采取以下措施保證檢測結(jié)果的可靠性a、用擴(kuò)增級別DNase I消化提取的總RNA中可能存在的少量的基因組DNA的污染，為檢測基因組DNA是否消除干凈，可取出一部分用DNase I消化消化的總RNA樣品進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng)，當(dāng)發(fā)現(xiàn)沒用擴(kuò)增條帶產(chǎn)生時，再進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄步驟； b、由于TaLKR/SDH基因有內(nèi)含子，且在揚(yáng)麥158中可能有其同家族成員，所以擴(kuò)增產(chǎn)物盡量放在其跨內(nèi)含子的編碼區(qū)；C、為了進(jìn)一步驗證實時定量PCR擴(kuò)增的條帶是否就是TaLKR/ SDH，將PCR產(chǎn)物切膠回收進(jìn)行測序。具體方法為取揚(yáng)麥158成株期取揚(yáng)麥158成株期根、 莖、葉、花序和開花后20天幼胚為材料提取總RNA為模板，依據(jù)所獲得的cDNA編碼序列設(shè)計hLKR/SDH基因?qū)崟r定量PCR的引物P9 SEQ ID No 14 5' -CTTTGGTTGGCATTTCTGATATAAC-3，；PlO SEQ ID No 15 :5， -CTGGAAAACTCTGTAGGCAGAATG-3，。以小麥的actin (激動蛋白)cDNA為內(nèi)參，實時定量PCR引物為Pll SEQ ID No 16 :5，-TGTTGTTCTCAGTGGAGGTTCT-3，；P12 SEQ ID No 17 :5， -CATTATTTCATACAGCAGGCAAG-3，。實驗步驟如下先取IygS RNA加入擴(kuò)增級別DNase I (Sigma, USA)室溫放置 30分鐘來去除基因組DNA的污染，然后加入停止緩沖液(50mM EDTA)，70°C加熱10分鐘變性DNase I和RNA ；然后采用寶生物工程(大連)有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒按照試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，每個樣品取21 μ g總RNA，在42°C下反應(yīng)1小時，在70°C加熱10分鐘后取出，置于冰上，以使反轉(zhuǎn)錄酶使活；最后取Iy 1翻轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行實時定量PCR擴(kuò)增。使用TaKaRa公司的STOR Premix ExTaq 試劑盒，按照操作說明，在熒光定量PCR儀Light Cycler 2. 0 (Roche 公司)上進(jìn)行熒光定量 PCR。采用 Light Cycler 2.0 中的 2_ Δ Acp 方法進(jìn)行基因相對表達(dá)量分析，檢測不同組織中TaLKR/SDH基因的表達(dá)，以根中基因的表達(dá)作為標(biāo)準(zhǔn)，數(shù)值設(shè)為1，其余樣本為相對于標(biāo)準(zhǔn)1的相對表達(dá)值，每個樣品設(shè)置3次重復(fù)。 20yL反應(yīng)體系包括1μ 1 cDNA，2XPCR mix緩沖液10 μ 1，上下游引物(5 μ M/μ 1)分別 1μ 1，7μ 1 H2O 補(bǔ)足。PCR 反應(yīng)程序為:95°C 預(yù)變性 30s ； 95 °C 5s, 57 °C 10s,72 "C 20s，40 個循環(huán)后，做溶解曲線分析。檢測結(jié)果表明TaLKR/SDH在所檢測的組織中呈現(xiàn)一種組成型表達(dá)的模式，在小麥幼胚中表達(dá)量最高，花序組織次之，在根、莖和葉中的表達(dá)量較低，幼胚中的表達(dá)水平約是表達(dá)量最少的根組織的15倍(圖1)。實施例3 :TaLKR/SDH植物過表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)基因煙草葉片賴氨酸濃度的調(diào)控(1)表達(dá)載體的構(gòu)建設(shè)計含有酶切位點(diǎn)的引物P13 SEQ IDNo 18 5，-GCCTCTAGAATGGGGTCCGAGACAACTGAAAGAA-3，(帶下劃線堿基為限制內(nèi)切酶 Xba I識別位點(diǎn))；P14 SEQ ID No 19 5，-GCCCCCGGGTCAGGTCTCCACTCTCTCGATCAGC-3，(帶下劃線堿基為限制內(nèi)切酶 Sma I識別位點(diǎn))。
以TaLKR/SDH cDNA編碼序列為模板，在含有酶切位點(diǎn)的引物P13和ρ 14的引導(dǎo)下， PCR擴(kuò)增5，端添加Xba I識別位點(diǎn)、3，端添加Sma I識別位點(diǎn)的TaLKR/SDHcDNA編碼序列。反應(yīng)結(jié)束后，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收并純化約3100bp的目的片段，將其用)(ba I和Sma I酶切后，與經(jīng)相同酶雙酶切的載體TmpCAMBIA2301 (圖2) 用T4DNA連接酶16°C連接過夜(20ul反應(yīng)體系含1 XT4DNA連接酶緩沖液，mpCAMBIA2301片段0. 03pmol, TaLKR/SDH片段0. 3pmol, 350u T4DNA連接酶)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α 感受態(tài)細(xì)胞(轉(zhuǎn)化方法參照《分子克隆實驗指南》第二版，Ρ55-56頁，科學(xué)出版社，1992)， 轉(zhuǎn)化后得大腸桿菌DH5 α細(xì)胞懸液涂布含80mg/L卡那霉素的平板，對抗卡那霉素的陽性克隆進(jìn)行擴(kuò)增并提取質(zhì)粒，采取酶切和測序的方法驗證連接的正確性得到植物表達(dá)載體 TmpCAMBIA2301: JaLKR/SDHJmpCAMBIAZSOl: JaLKR/SDH 質(zhì)粒圖如圖 3 所示。用凍融轉(zhuǎn)化法將此載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EH105，得到含有TmpCAMBIA2301: TaLKR/SDH的農(nóng)桿菌菌株， 命名為TmpCAMBIA2301 TaLKR/SDH ；將質(zhì)粒TmpCAMBIA2301轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EH105，得到含有TmpCAMBIA2301空載體的農(nóng)桿菌菌株TmpCAMBIA2301。(2)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草轉(zhuǎn)化與篩選鑒定從培養(yǎng)平板中挑取單個農(nóng)桿菌菌落，在含有50mg/L卡那霉素、30mg/L鏈霉素的 2ml Υ^培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜；以的量接種于IOOml Y^培養(yǎng)基中(50mg/L卡那霉素， 30mg/L鏈霉素)培養(yǎng)過夜，6000rpm離心收集菌體，用侵染培養(yǎng)基重新懸浮，菌液濃度調(diào)整至0D600約0. 5做為侵染菌液。采用葉圓盤轉(zhuǎn)化法，用無菌刀片將無菌煙草試管苗葉片切成4 6mm的葉盤，葉盤外植體分別在0D600約0. 5的TmpCAMBIA2301 TaLKR/SDH禾口 TmpCAMBIA2301 (轉(zhuǎn)空載體對照)農(nóng)桿菌侵染溶液中感染lOmin，取出后用無菌濾紙吸干表面液體，放入含有共培養(yǎng)液(MS基本培養(yǎng)基加6-芐氨基嘌呤1.0mg/L、萘乙酸0. lmg/L、蔗糖30g/L，pH 5.8)的濾紙上黑暗條件下，25°C共培養(yǎng)2天。經(jīng)共培養(yǎng)2天的葉盤用含有 500mg/L的頭孢霉素水溶液洗滌3次，用無菌濾紙吸干表面液體轉(zhuǎn)入篩選分化培養(yǎng)基中， 25°C光照培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化體的篩選在篩選分化培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基加6-芐氨基嘌呤1. Omg/ L、萘乙酸0. lmg/L、卡那霉素80mg/L、頭孢霉素400mg/L、蔗糖30g/L, pH 5. 8)中進(jìn)行。待葉片邊緣長出叢生再生芽至2-3cm時，用解剖刀將再生芽切下，并轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(MS基本培養(yǎng)基加卡那霉素50mg/L、蔗糖20g/L，pH 5.8)中培養(yǎng)25天。轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生的植株具有卡那霉素抗性，為正常綠色植株。設(shè)計鑒定用PCR為引物P15 SEQ ID No 20 :5， -GCATTCTCGCCGAGACCGTCAATATG-3，；P16 SEQ ID No 21 :5，-TTTCCGGATCCGGTGAATGCAAATAC-3，。用基因組提取試劑盒(Takara)提取TmpCAMBIA2301 I^aLKR/SDH 禾口 TmpCAMBIA2301煙草基因組DNA，以IOOng提取的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。 25 μ 1 PCR反應(yīng)體系含2. 5μ 1含MgCl2的IOXPCR緩沖液、正、反向ΙΟμΜ的引物Ρ15 和Ρ16各1. O μ 1、1. O μ 1 IOmM的dNTP (脫氧核苷酸混合物)、1. O μ 1基因組DNA模板和 18·5μ1雙蒸水，以及0·25μ1 rTaq酶(寶生物工程(大連)有限公司)。擴(kuò)增反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性4分鐘；95°C 30秒，55°C 50秒，72°C 1分鐘，35次循環(huán)，72°C延伸10分鐘。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，結(jié)果如圖4所示，在鑒定的46株煙草中，有28株陽性轉(zhuǎn) TmpCAMBIA2301: :TaLKR/SDH煙草擴(kuò)增產(chǎn)物在預(yù)計的620bp處有清晰的條帶，而有18株假陽性轉(zhuǎn)TmpCAMBIA2301: :TaLKR/SDH煙草和轉(zhuǎn)TmpCAMBIA2301煙草(空載體對照)無 PCR產(chǎn)物條帶。為了進(jìn)一步鑒定轉(zhuǎn)基因植株，采用SV Total RNA lysis試劑盒(Promega 公司，美國)提取通過基因組檢測為陽性的23株轉(zhuǎn)TmpCAMBIA2301 TaLKR/SDH及轉(zhuǎn) TmpCAMBIA2301煙草(空載體對照)葉片總RNA，用1 μ g葉片總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶生物工程(大連)有限公司)按試劑盒的方法反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，PCR引物為Pll 和Ρ12，25μ 1 PCR反應(yīng)體系含2. 5μ 1含MgCl2W 10 X PCR緩沖液、正、反向10 μ M的引物各 1. 0 μ 1、1. 0 μ 1 IOmM的dNTP (脫氧核苷酸混合物)、1. 0 μ 1 cDNA模板和18. 5 μ 1雙蒸水， 以及0. 25 μ 1 rTaq酶(寶生物工程(大連)有限公司)。擴(kuò)增反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性4 分鐘；95°C 30秒，55°C 50秒，72°C 1分鐘，35次循環(huán)，72°C延伸10分鐘。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，鑒定結(jié)果如圖5所示，在鑒定的23株轉(zhuǎn)mpCAMBIA2301 TaLKR/SDH煙草陽性植株中，有20株的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在620bp處有清晰的條帶，說明該基因在煙草中已進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄表達(dá),而有3株轉(zhuǎn)TmpCAMBIA2301: TaLKR/SDH煙草及轉(zhuǎn)TmpCAMBIA2301煙草(空載體對照)的RT-PCR無PCR產(chǎn)物條帶，說明該基因在煙草中沒有進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá)。(3)基因功能分析將大小生長一致的轉(zhuǎn)TaLKR/SDH基因陽性煙草苗與轉(zhuǎn)入TmpCAMBIA2301空質(zhì)粒的對照煙草苗帶根取出，移栽盆缽成活后繼續(xù)培養(yǎng)，30天后取煙草的葉片進(jìn)行賴氨酸測定。每個植株取2份樣品進(jìn)行檢測，其中游離賴氨酸的提取方法包括以下步驟a)取200mg煙草葉片液氮研磨成粉后，加入600 μ 1提取液(水、氯仿、甲醇混合液，體積比為3 5 12)， 混勻后靜置5min，4°C 14000 Xg離心lmin，取上清夜置干凈管子，下面沉淀用600 μ 1同樣的提取液重懸，4°C 14000 Xg離心lmin，取上清夜；b)合并兩次提取上清夜，加300 μ 1氯仿和450μ1水，混勻，4°C 14000Xg離心lmin，取上層水相，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥儀蒸干；c)蒸干產(chǎn)物用100 μ 1水溶解，加入150 μ 1乙腈，4°C 14000 Xg離心15min，取上清夜，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥儀蒸干，蒸干產(chǎn)物用200 μ 1水溶解，取20 μ 1在惠普公司的高壓液體色譜分析儀上測定賴氨酸含量。采取OPA柱前衍生的HPLC方法(牟德海.OPA柱前衍生反向高效液相色譜法測定賴氨酸含量.色譜，1997. 15(4) :319-321)，參數(shù)如下流動相(A) IOmmoINa2HPO4-Na !^04卩!17.2(卩8)，含0.3%11冊(四氫呋喃)；(B) PB-甲醇-乙腈(50 35 15)。梯度:在 40min內(nèi)，B液的含量逐漸從0上升到100%。流速lmL/min ；柱溫40°C;檢測波長340nm。 結(jié)果表明，轉(zhuǎn)小麥LKR/SDH基因的煙草葉片中的游離賴氨酸含量較對照明顯降低(圖6)，證明該基因所編碼的蛋白確實是賴氨酸分解代謝途徑的關(guān)鍵酶之一。實施例4 TaLKR/SDH植物RNAi表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)基因高賴氨酸小麥的獲得(1)表達(dá)載體的構(gòu)建A、構(gòu)建質(zhì)粒 PUC18-TaLKR/SDH_RNAi設(shè)計五組引物對P17 SEQ ID No 22 5，-GCCCTGCAGCGTTCAAACATTTGGCAATAAAG-3 ‘(含 PstI 酶切位點(diǎn))；P18 SEQ ID No 23 5，-GCCAAGCTTCCCGATCTAGTAACATAGATGAC-3‘(含 HindIII 酶切位點(diǎn))。P19 SEQ ID No 24 5，-GCCGAATTCAAGCTTAAGCTTTTTTTGAGGAATTTTAGAAGTTGAACAG-3’ (含 EcoRI 酶切位點(diǎn)和HindIII酶切位點(diǎn))；P20 SEQ ID No 25 5，-GCCGGTACCCTTAAGCTAATTGATGTGAGTTCAAAG-3’ (含 KpnI 酶切位點(diǎn))。P21 SEQ ID No 26 5，-GCCGGTACCTATGCATACTCTTGCAATGGCAGC-3’ (含 KpnI 酶切位點(diǎn))；P22 SEQ ID No 27 5，-GCCGGATCCTTCCTTGACTTCTATCGCTAATGC-3’ (含 BamHI 酶切位點(diǎn))。P23 SEQ ID No 28 5，-GCCGGATCCTTCCTTGACTTCTATCGCTAATGC-3’ (含 BamHI 酶切位點(diǎn))；P24 SEQ ID No 29 5，-GCCCTGCAGTATGCATACTCTTGCAATGGCAGC-3’ (含 PstI 酶切位點(diǎn))。P25 SEQ ID No 30 5，-GCCGGATCCGTCCGTCGCTTCTCTTCCATTTCTTC-3’ (含 BamHI 酶切位點(diǎn))；P26 SEQ ID No 31 5，-GCCGGATCCCCAAAAGCAAAAGAATCAACAAGCTG-3'(含 BamHI 酶切位點(diǎn))。以含有 Nos3，序列的 PBI2301 (http //www, ncbi. nlm. nih. gov/ GenBank AF234316)為模板，用引物P17和P18擴(kuò)增Nos3，序列，其中所述的Nos3，序列為已知核酸序列(http //www, ncbi. nlm. nih. rov/ ；GenBank :AF485783)見 SEQ IDNo. 3,1% 的瓊脂糖電泳，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，以PUC18為基礎(chǔ)質(zhì)粒(http://www, ncbi. nlm. nih. rov/ ； GenBank :A02710)(圖7)，采用限制性內(nèi)切酶HindIII和PstI對Nos3，片段和PUC18分別進(jìn)行完全雙酶切，的瓊脂糖電泳，對酶切片段進(jìn)行回收，用T4DNA連接酶16°C連接過夜(20ul反應(yīng)體系含IX T4DNA連接酶緩沖液，PUC18片段0. 03pmol, Nos3，片段0. 3pmol， 350uT4DNA連接酶)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞(轉(zhuǎn)化方法參照《分子克隆實驗指南》第二版，P55-56頁，科學(xué)出版社，199 ，轉(zhuǎn)化后得大腸桿菌DH5ci細(xì)胞懸液涂布含100mg/L氨芐青霉素的平板，對抗氨芐青霉素的陽性克隆進(jìn)行擴(kuò)增并提取質(zhì)粒，采取酶切和測序的方法驗證連接的正確性，獲得質(zhì)粒命名為PUC18-N ；以含有pGluB基因啟動子的水稻(Oryza sativa)葉片基因組為模板，以引物P19和P20擴(kuò)增得pGluB全長序列，其中所述的PGluB基因啟動子為已知核酸序列(http //www, ncbi. nlm. nih. rov/ ；GenBank AY427569)見SEQ ID No. 4，1 %的瓊脂糖電泳，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，以PUC18-N為載體，采用限制性內(nèi)切酶EcoRI和KpnI對pGluB和PUC18-N分別進(jìn)行完全雙酶切，1 %的瓊脂糖電泳，對酶切片段進(jìn)行回收，用T4DNA連接酶16°C連接過夜(20ul反應(yīng)體系含IXT4DNA 連接酶緩沖液，PUC18-N片段0. 03pmol,pGluB片段0. 3pmol, 350uT4DNA連接酶)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，選取陽性克隆提取質(zhì)粒并采取酶切和測序的方法驗證連接的正確性，獲得質(zhì)粒命名為PUC18-PN ；以TaLKR/SDH基因編碼序列為模板，以引物P21和P22PCR擴(kuò)增TaLKR/SDH 基因中385bp編碼序列(編碼區(qū)第1620個核苷酸至2004個核苷酸)，的瓊脂糖電泳， 對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，以PUC18-PN為載體，采用限制性內(nèi)切酶KpnI和BamHI對TaLKR/ SDH基因片段和PUC18-PN載體分別進(jìn)行完全雙酶切，1 %的瓊脂糖電泳，對酶切片段進(jìn)行回收，用T4DNA連接酶16°C連接過夜(20ul反應(yīng)體系含1 X T4DNA連接酶緩沖液，PUC18-PN 片段0. 03pmol, TaLKR/SDH片段0. 3pmol, 350uT4DNA連接酶)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，選取陽性克隆提取質(zhì)粒并采取酶切和測序的方法驗證連接的正確性，獲得質(zhì)粒命名為PUC18-PNLF ；以 TaLKR/SDH基因編碼序列為模板，以引物P23和P24PCR擴(kuò)增TaLKR/SDH基因中385bp編碼序列(編碼區(qū)第1620個核苷酸至2004個核苷酸)的反向干擾序列，的瓊脂糖電泳，對 PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，以PUC18-PNLF為載體，采用限制性內(nèi)切酶BamHI和I^stI對TaLKR/ SDH基因反向片段和PUC18-PNLF載體分別進(jìn)行完全雙酶切，1 %的瓊脂糖電泳，對酶切片段進(jìn)行回收，用T4DNA連接酶16°C連接過夜(20ul反應(yīng)體系含1 XT4DNA連接酶緩沖液， PUC18-PNLF 片段 0. 03pmol，I^aLKR/SDH 基因反向片段 0. 3pmol，350uT4DNA 連接酶)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，選取陽性克隆提取質(zhì)粒并采取酶切和測序的方法驗證連接的正確性，獲得質(zhì)粒命名為PUC18-PNLFR;。選用擬南芥FAD基因的內(nèi)含子作為載體的內(nèi)含子，以含有FAD基因的擬南芥(Arabidopsis thaliana)葉片基因組為模板，以引物P25和P^擴(kuò)增得FAD基因內(nèi)含子全長序列，其中所述的FAD基因內(nèi)含子為已知核酸序列(http://www. ncbi.nlm. nih. gov/ GenBank :A.T271841)見SEQ ID No. 5，1 %的瓊脂糖電泳，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，以PUC18-LSFRG為載體，采用限制性內(nèi)切酶BamHI對FAD基因內(nèi)含子和PUC18-PNLFR分別進(jìn)行完全雙酶切，的瓊脂糖電泳，對酶切片段進(jìn)行回收，用T4DNA連接酶16°C連接過夜 (20ul反應(yīng)體系含1\1^嫩連接酶緩沖液沖肌18- ^^1 片段0. 03pmol，F(xiàn)AD基因內(nèi)含子片段0. 3pmol,350uT4DNA連接酶)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，選取陽性克隆提取質(zhì)粒并采取酶切和測序的方法驗證連接的正確性，獲得質(zhì)粒命名為PUC18-PNLFRi。B、制備pAHC25_TaLKR/SDHRNAi 表達(dá)載體采用限制性內(nèi)切酶Hindi 11對PUC18_PNLFRi質(zhì)粒DNA進(jìn)行完全酶切，切下 pGluB+LKR/SDH正向+FAD2內(nèi)含子+LKR/SDH反向+Nos3’嵌合基因片段，采用0. 8的瓊脂糖電泳，對3. 47kb左右的酶切片段進(jìn)行回收；采用限制性內(nèi)切酶HindIII對pAHC25質(zhì)粒 DNA(圖8)進(jìn)行完全酶切，切除原有表達(dá)盒，采用0. 8的瓊脂糖電泳，對5. 5kb左右的酶切片段進(jìn)行回收；用T4DNA連接酶對兩個回收片段16°C連接過夜(20ul反應(yīng)體系含IXT4DNA 連接酶緩沖液，PAHC25片段0. 03pmol, pGluB+LKR/SDH正向+FAD2內(nèi)含子+LKR/SDH反向 +Nos3'嵌合基因片段0. 3pmol，350uT4DNA連接酶)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后得大腸桿菌DH5 α細(xì)胞懸液涂布含100mg/L氨芐青霉素的平板，對抗氨芐青霉素的陽性克隆進(jìn)行擴(kuò)增并提取質(zhì)粒，采取酶切和測序的方法驗證連接的正確性，獲得質(zhì)粒命名為 pAHC25-TaLKR/SDHRNAi，即為小麥 TaLKR/SDH 基因 RNAi 表達(dá)載體 pAHC25_TaLKR/ SDHRNAi (圖9)，整個載體構(gòu)建過程見圖10。(2)基因槍法轉(zhuǎn)化小麥與篩選鑒定采用基因槍轉(zhuǎn)基因方法將構(gòu)建的表達(dá)載體導(dǎo)入受體小麥幼胚細(xì)胞，通過愈傷誘導(dǎo)、植株再生獲得轉(zhuǎn)基因待選植株(參照周淼平等，小麥基因槍法轉(zhuǎn)化技術(shù)的改進(jìn)，江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，1999，15 (1) 62-64)。質(zhì)粒DNA的提取采用QIAGEN公司的質(zhì)粒大量提取純化試劑盒進(jìn)行提取。提取的質(zhì)粒包裹在直徑1. 0微米的金粉上，金粉用量125 μ g/槍，轟擊壓力 1 IOOpsi，轟擊距離8. 5cm。小麥開花后12-14天剝?nèi)∮着?，在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 天的幼胚和培養(yǎng)8天的愈傷組織，轉(zhuǎn)入高滲培養(yǎng)基中處理4小時，然后進(jìn)行轟擊，轟擊后繼續(xù)在高滲培養(yǎng)基中處理16小時，移入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中恢復(fù)培養(yǎng)3-6天，然后轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，篩選培養(yǎng)四周，然后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，分化培養(yǎng)四周，當(dāng)幼苗長到3cm左右，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)。各種培養(yǎng)基配方見表1。待根長到5 8cm長時，移入盆缽中生長。
表1小麥轉(zhuǎn)化所用的培養(yǎng)基配方
~ZZZMSMS2MS0.4SMDMM
n^ 基本培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)基高滲培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)基分化培養(yǎng)基生根培養(yǎng)基
基本培養(yǎng)基 MSMSMSMSMS1/2MS
瓊脂8 g/L8 g/L8 g/L8 g/L8 g/L7 g/L
草丁膦3 mg/L 1 mg/L 1 mg/L
2，4-D2 mg/L2 mg/L2 mg/L
甘露醇0.4mol
KT0. 5 mg/L
NAA0.5 mg/L
多效唑5 mg/L根據(jù)擬南芥FAD基因內(nèi)含子序列設(shè)計引物對P27 SEQ ID No 32 :5，-TGGCTATTTGTTCTGGGTAA-3，，P28 SEQ ID No 33 :5， -AACGATTCAAGAGAGTCTTC-3，。篩選培養(yǎng)基和分化培養(yǎng)基中分別含有:3mg/L的草丁膦和lmg/L的草丁膦，可以阻止未轉(zhuǎn)化受體的生長，而篩選獲得抗性的轉(zhuǎn)化植株，同時在移栽后可用除草劑對轉(zhuǎn)基因進(jìn)一步進(jìn)行篩選。TO代共獲得114株除草劑抗性植株。對待選植株進(jìn)行分子檢測，所述的分子檢測為PCR分析方法。PCR分析是指提取待選轉(zhuǎn)基因小麥及其后代的基因組DNA(脫氧核糖核酸)，以此為模板對LKR/SDHRNAi中南芥FAD基因內(nèi)含子序列片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能擴(kuò)增出相應(yīng)基因片段的植株為陽性轉(zhuǎn)基因植株。以引物P27和P^對114株抗性苗進(jìn)行檢測，擴(kuò)增條件95°C 3分鐘，94°C 1分鐘，570C 1分鐘，72°C 1分鐘，進(jìn)行35個循環(huán)，最后72°C 延伸lOmin。擴(kuò)增片段大小為610bp，檢測電泳圖見附圖11。共檢測出14株P(guān)CR陽性植株， 對轉(zhuǎn)基因植株Tl代繼續(xù)進(jìn)行檢測，獲得13個轉(zhuǎn)基因陽性株系。(3)基因功能分析陽性轉(zhuǎn)基因植株通過自交和PCR篩選，獲得T3代轉(zhuǎn)基因純合株系。檢測T3代轉(zhuǎn)基因純合株系后代種子中游離賴氨酸的含量，篩選并獲得游離賴氨酸含量顯著提高的小麥轉(zhuǎn)基因株系。從13個LKR/SDHRNAi轉(zhuǎn)基因株系和2個野生型植株中分別隨機(jī)選取50粒種子， 用與實例3中相同的液相色譜法測定游離賴氨酸含量，取3次重復(fù)的均值為所測樣品的值， 2個野生型植株籽粒中游離賴氨酸的含量取平均值作為對照。測定表明，在測定的13個轉(zhuǎn)基因株系中，有8個轉(zhuǎn)基因株系籽粒中游離賴氨酸含量明顯提高，其中一個株系(L-9)種子中的轉(zhuǎn)基因株系游離賴氨酸含量為對照的3倍左右(圖12)。以上各實施例不是對本發(fā)明的具體限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員結(jié)合本領(lǐng)域的慣用技術(shù)手段，借助本發(fā)明公開的氨基酸殘基序列蛋白質(zhì)及其編碼基因?qū)巫尤~植物或雙子葉植物進(jìn)行植物抗逆性調(diào)控，均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.植物的一個賴氨酸酮戊二酸還原酶/酵母氨酸脫氫酶(Lys ketoglutaratereductase/saccharopine dehydrogenase, LKR/SDH)，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)a)序列表中的SEQ ID No 1 ；b)將序列表中SEQ ID N2 :1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且具有催化分解賴氨酸為α-氨基脂肪酸和谷氨酸的氨基酸殘基序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物的一個賴氨酸酮戊二酸還原酶/酵母氨酸脫氫酶，其特征在于所述蛋白質(zhì)具有序列表中SEQ ID No 1的氨基酸殘基序列。
3.—種如權(quán)利要求1或2所述植物的一個賴氨酸酮戊二酸還原酶/酵母氨酸脫氫酶的編碼基因，其特征在于a)序列表中SEQID No 2的DNA序列；b)編碼序列表中SEQID No 1蛋白質(zhì)序列的多核苷酸序列；c)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQID No 2限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
4.含有權(quán)利要求3所述編碼基因的表達(dá)載體。
5.含有權(quán)利要求3所述編碼基因的細(xì)胞系。
6.含有權(quán)利要求3所述編碼基因的宿主菌。
7.—種如權(quán)利要求1或2所述的小麥的一個賴氨酸酮戊二酸還原酶/酵母氨酸脫氫酶基因的應(yīng)用，其特征在于將賴氨酸酮戊二酸還原酶/酵母氨酸脫氫酶基因?qū)胫参锝M織或細(xì)胞，提高植物種子的賴氨酸含量。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的小麥的一個賴氨酸酮戊二酸還原酶/酵母氨酸脫氫酶基因的應(yīng)用，其特征在于所述的植物為單子葉植物或雙子葉植物；所述的應(yīng)用為提高植物種子的賴氨酸含量。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物的一個賴氨酸酮戊二酸還原酶/酵母氨酸脫氫酶，是具有下述氨基酸殘基序列之一的蛋白質(zhì)a)序列表中的SEQIDNO1；b)將序列表中SEQIDNO1的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有具有酶活功能的催化分解賴氨酸為α-氨基脂肪酸和谷氨酸的氨基酸殘基序列。將本發(fā)明的賴氨酸酮戊二酸還原酶/酵母氨酸脫氫酶基因片段導(dǎo)入植物組織或細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄出的RNA形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)可以抑制植物組織或細(xì)胞本身賴氨酸酮戊二酸還原酶/酵母氨酸脫氫酶的表達(dá)量，從而提高植物種子的賴氨酸含量。
文檔編號C12N9/02GK102517261SQ201110420098
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月15日
發(fā)明者余桂紅, 孫曉波, 張旭, 馬鴻翔 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院