專利名稱：高效激發(fā)小麥抗黃花葉病毒病的復(fù)制酶基因片段及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，主要是ー種高效激發(fā)小麥抗黃花葉病毒病的復(fù)制酶基因片段及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
小麥?zhǔn)鞘澜绲谝淮蠹Z食作物。同其它作一祥，小麥也經(jīng)常受到病蟲的侵染，導(dǎo)致減產(chǎn)和品質(zhì)下降。其中由禾谷多黏菌傳播的土傳花葉類病毒病分布最廣、種類最多、危害最嚴(yán)重。在我國(guó)，土傳花葉類病毒病自20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)以來(lái)，一直是我國(guó)河南、江蘇、安徽、山東等冬小麥種植區(qū)常發(fā)的重要病害之一，已成為影響我國(guó)小麥高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的重要制約因素之一。估計(jì)，毎年土傳病毒病發(fā)病面積超過(guò)3000萬(wàn)畝，減產(chǎn)150萬(wàn)噸以上。病害為害嚴(yán)重，防治困難的原因，其ー是因?yàn)橥羵鞑《臼怯赏翂粗械暮坦榷囵ぞ鷤鞑?，而禾谷多黏菌產(chǎn)生的休眠孢子具有極強(qiáng)的抗逆性，難以用化學(xué)方法防治。輪作、推遲栽培等農(nóng)事操作防治效果并不理想。目前防治該病害的主要措施是種植抗病品種。其ニ是引起小麥黃花葉病害的病原物種類很多。針對(duì)不同地區(qū)的病毒株系，品種的抗病性表現(xiàn)差異很大，缺乏廣譜抗病品種， 并且部分重病區(qū)抗病品種資源嚴(yán)重缺乏。其三是不斷出現(xiàn)新的病毒和致病株系導(dǎo)致抗病品種的抗性喪失。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供ー種高效激發(fā)小麥抗黃花葉病毒病的復(fù)制酶基因片段及應(yīng)用，是一段激發(fā)小麥抗黃花葉病毒病的復(fù)制酶基因片段的核苷酸序列， 從根本上解決生產(chǎn)中的小麥黃花葉病毒病的危害，利用本發(fā)明提供的這段特異的核苷酸序列片段，可以高效的激發(fā)不同小麥品種的抗病能力，即表達(dá)本序列片段的小麥植株可有效的抵抗病毒的侵染。本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案這種高效激發(fā)小麥抗黃花葉病毒病的復(fù)制酶基因片段，具有SEQ ID NO: I所述的核苷酸序列。利用上述的高效激發(fā)小麥抗黃花葉病毒病的復(fù)制酶基因片段，將上述核苷酸序列連接到真核表達(dá)啟動(dòng)子下游后進(jìn)行常規(guī)的外源基因在小麥體內(nèi)表達(dá)，表達(dá)本序列片段的小麥植株在有效抵抗病毒侵染方面的應(yīng)用。本發(fā)明有益的效果是利用一段來(lái)源于小麥黃花葉病毒保守序列的核苷酸片段， 激發(fā)小麥的抗病性。由于此段序列是病毒復(fù)制所必須的復(fù)制酶基因片段，具有高度保守性及進(jìn)化穩(wěn)定性，因而，利用此片段激發(fā)的小麥抗病性具有廣譜抗病性和長(zhǎng)期穩(wěn)定性。


圖I載體pUib_35S示意圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明提供了一段反義小麥黃花葉病毒復(fù)制酶基因片段，此片段在小麥細(xì)胞內(nèi)表達(dá)后可引起持續(xù)、高效的抗小麥黃花葉病毒病的特性。本發(fā)明包括此段反義小麥黃花葉病毒復(fù)制酶基因的核苷酸序列，此段核苷酸鏈的同源性分析以及此段反義RNA序列的DNA克隆和表達(dá)載體構(gòu)建。其中，所采用的病毒來(lái)源是江蘇省揚(yáng)州市里下河研究所感染小麥黃花葉病毒的小麥葉片，提取感病葉片總RNA后，利用此片段相應(yīng)正義RNA鏈上特定序列擴(kuò)增獲得cDNA片段，利用相應(yīng)的酶切位點(diǎn)將正義RNA鏈上部分復(fù)制酶基因反向插入表達(dá)載體中， 使得表達(dá)后可產(chǎn)生反義RNA片段，此片段經(jīng)驗(yàn)證可激發(fā)小麥高抗黃花葉病毒病的特性。此基因片段可推廣應(yīng)用到其它抗小麥黃花葉病毒病的種質(zhì)創(chuàng)建。一、序列的獲得取自感染小麥黃花葉病毒揚(yáng)州分離物的小麥葉片約O. I克，利用Trizol從樣品組織中提取總RNA(參照Invitrogen公司說(shuō)明)，以此總RNA中小麥黃花葉病毒(WYMV)基因組RNA為模板，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。具體方法如下根據(jù)本實(shí)驗(yàn)之前報(bào)道的 WYMV揚(yáng)州分離物RNAl基因組全序列(AJ131981)設(shè)計(jì)引物FcWYV B5，(nts5284_5302) 5’-CGGATCCATGATCAGAATGTTG GAAG-3’和FcWYV B3’(nts 6495-6475) :5’_CGGATCCTTAGAGC TCAATGCTGCTATC-3’，并利用下游引物，F(xiàn)cWYV B3及所獲得的總RNA在42°C恒溫下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄酶為Promega公司的SuperScriptII,反應(yīng)體系如下5XRT Buffer 2 μ L,
2.5mmol/L dNTP 2μ L,0. lmol/L DTT I μ L，RNA酶抑制劑 0. 2 μ L，逆轉(zhuǎn)錄酶 0. 5 μ L，反應(yīng)總體積為10 μ L。以逆轉(zhuǎn)錄所獲得的單鏈DNA片段為模板，F(xiàn)cWYV B5和FcWYV B3偉引物進(jìn)行 PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系如下IOx卩0 反應(yīng)緩沖液5 4 1^，(1見(jiàn)13(2_01/1)5 4 1^ 0^￥ B5 I μ L， FcffYV Β3 I μ L，合成的cDNA 2 μ L, KOD (Τ0Υ0ΒΑ公司)酶I μ L，無(wú)菌水補(bǔ)足至50 μ L。反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5分鐘，94°C變性30秒，55°C退火30秒，68 °C延伸2分鐘，30個(gè)循環(huán)， 68°C延伸10分鐘。目的PCR產(chǎn)物大小約I. 2Kb，PCR產(chǎn)物莖Qiagen凝膠純化試劑盒純化后，利用TOYOBA T-Blunt載體進(jìn)行PCR片段的克隆，反應(yīng)條件如下，IOX ligation Buffer 2 μ L，T-Blunt I μ L, PCR 回收片段 10 μ L, PromegaT4_Ligase I μ L,無(wú)菌水補(bǔ)足至 20 μ L, 混勻后4V反應(yīng)16小時(shí)。反應(yīng)完畢后，取10 μ L反應(yīng)液加入含有100 μ L大腸桿菌感受態(tài)的離心管中，輕輕混勻冰上放置25分鐘,42°C熱激90秒,立即放置冰上2-3分鐘，向離心管中加入LB培養(yǎng)基800 μ L，37°C孵育I小時(shí)后，取300 μ L培養(yǎng)液涂布于含有l(wèi)OOmmol/L氨芐青霉素，lmmol/L IPTGjP 10mg/L的固體LB培養(yǎng)基上，37°C倒置培養(yǎng)16小時(shí)。之后選擇白色菌落送上海Invitrogen公司測(cè)序。含有插入序列的克隆命名為T_Nibl。二、序列的應(yīng)用方法利用分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)將獲得核苷酸片段反向連接到Ubi或35S啟動(dòng)子下游， 進(jìn)行常規(guī)的植物表達(dá)載體構(gòu)建后進(jìn)行外源基因在小麥體內(nèi)的表達(dá)，表達(dá)的反向核苷酸序列即可高效激發(fā)小麥的抗WYMV特性。浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院病毒學(xué)與生物技術(shù)所根據(jù)已報(bào)道的小麥黃花葉病毒中國(guó)揚(yáng)州分離物RNAl基因組全序列(AJ131981)設(shè)計(jì)引物FcffYV B5，(nts5284_5302) 5’ -CGGATCCATGATCAGAATGTTG GAAG-3’ 和 FcffYV B3’ (nts 6495-6475) :5’ -CGGATCCTTA GAGCTCAATGCTGCTATC-3’，該對(duì)引物特異性的擴(kuò)增WYMV復(fù)制酶(NIb)基因3’ -端2/3全長(zhǎng)序列，擴(kuò)增的目的序列長(zhǎng)1212個(gè)核苷酸。載體pUib-35S (圖I載體pUib-35S示意圖(BamH I為唯一的克隆位點(diǎn))及反向插入Nib8基因的核苷酸序列)用BamH I酶切后平端化，連接平端化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得插入有WYMV部分復(fù)制酶基因序列的克隆。根據(jù)載體pUib-35S的BamHI單克隆位點(diǎn)上游的Ubi-I intron序列設(shè)計(jì)測(cè)序引物Ubi-I 5， 5’ -CGCTATTTATTTGCTTGGTACGG-3’，通過(guò)序列測(cè)定確定外源基因的插入方向，最終獲得反向插入WYMV部分復(fù)制酶基因序列的克隆WYMV-Nib8，采用組成型啟動(dòng)子Ubiquitin構(gòu)建了用于小麥轉(zhuǎn)化的高效表達(dá)載體PUbiNib8.之后利用基因槍共轉(zhuǎn)化法將pUbiNib8載體導(dǎo)入受體品種揚(yáng)麥158 (高度感病品種)，轉(zhuǎn)基因植物田間接種實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)入此序列的揚(yáng)麥158可 100%提高抗WYMV的抗性田間抗病性分析也證實(shí)此免疫此序列可有效激發(fā)小麥品種的抗 WYMV特性。SEQ ID NO IATGATCAGAA TGTTGGAAGA CGCCGGCCTA ACTCAAGGCG ACGTGAGGAC ACCCCAACAG GTTGTTTCAG ACATGCAGTGGAACACTTCC GCCGGACCAA GCTACCAGGG CAAGAAAAGA GACGTTTGCG CACATCTCAG CGAGCAGGAA GTTCTACACCTTGCAGAAAC GTCGCGACAG CAGTTTCTAG CCTGCAATTC CATCGGCATT TGGAACGGAT CGCTCAAAGC AGAGCTTAGGACGATTGAGA AAGTGGAAGC TGAGAAAACC AGAGTTTTCA CGGCTTCGCC AATCACGAGT CTATTCGCCA TGAAGTTCTACGTTGACGAT TTCAACAAGA AGTTCTATGC GACAAACCTG AAAGCCCCAC ACACGGTAGG AATTAACAAA TTTAGCAGAGGCTGGGAAAT GCTCCACGAC AAGCTCAACC GCCCAGGTTG GCTTCACGGC AGTGGCGATG GGTCACGATT TGATAGTTCAATTGACCCTT TCTTCTTCGA CATAATCAAG GAGATTCGAA AGCACTTTCT ACCAGTTGAG CACCATCGCG CAATCGACCTAATATACGAC GAGATTCTCA ACACCAACAT TTGTTTGGCA AATGGCATGG TGATTCGAAA GAACGTTGGG AATAACAGCGGGCAGCCAAG CACGGTCGTA GACAACACAC TTGTTCTCAT GGTCTCTTTT CTCTACGCTT ACATTCATAA AACCGGAGACCATATGCTCA AGAAACTCAA CGACAGATTT GTTTTCGTCT GCAATGGTGA CGACAACAAA TTTGCCATTT CCCCAGAATTCGACGCCGAG TTCGGTCACG ACTTTTCACC GGAGCTCACA GAGCTAGGTT TGACGTACGA GTTTGACGAC ATAACAGATGACATGTGTGC AAACCCCTAC ATGTCCCTGA CCATGGTCCG CACTCCCTTT GGAATTGGGT TCTCTTTGCC CGTGGAACGCATTGTAGCAA TAATGCAGTG GGCTAAGAAG GGCGGCGTTC TGCACTCTTA CTTGGCAGGA ATCTCAGCCA TTTACGAAAGCTTCAACACA CCAAAGTTGT TCAAATCAGT CTATGCGTAT TTGTTATGGC TGACAGAGGA ACACGGCTCT GACATCCTAGCTGCAATGAC CGGAACAGAG ACAGCTCTCC CAATTCCTTC CATGCTCGAT GTGTACCGCCTCCACTATGG TGATAGCAGCATTGAGCTCC AA除上述實(shí)施例外，本發(fā)明還可以有其他實(shí)施方式。凡采用等同替換或等效變換形成的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種高效激發(fā)小麥抗黃花葉病毒病的復(fù)制酶基因片段，其特征是具有SEQ ID NO: I 所述的核苷酸序列。
2.一種利用如權(quán)利要求I所述的高效激發(fā)小麥抗黃花葉病毒病的復(fù)制酶基因片段的應(yīng)用，其特征在于將上述核苷酸序列連接到真核表達(dá)啟動(dòng)子下游后進(jìn)行常規(guī)的外源基因在小麥體內(nèi)表達(dá)，表達(dá)本序列片段的小麥植株在有效抵抗病毒侵染方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高效激發(fā)小麥抗黃花葉病毒病的復(fù)制酶基因片段及應(yīng)用，是一段激發(fā)小麥抗黃花葉病毒病的復(fù)制酶基因片段的核苷酸序列，這種高效激發(fā)小麥抗黃花葉病毒病的復(fù)制酶基因片段，具有SEQ ID NO1所述的核苷酸序列。利用上述的高效激發(fā)小麥抗黃花葉病毒病的復(fù)制酶基因片段，將上述核苷酸序列連接到真核表達(dá)啟動(dòng)子下游后進(jìn)行常規(guī)的外源基因在小麥體內(nèi)表達(dá)，表達(dá)本序列片段的小麥植株在有效抵抗病毒侵染方面的應(yīng)用。本發(fā)明有益的效果利用來(lái)源于小麥黃花葉病毒保守序列的核苷酸片段，激發(fā)小麥的抗病性。由于是病毒復(fù)制所必須的復(fù)制酶基因片段，有高度保守性及穩(wěn)定性，利用此片段激發(fā)的小麥抗病性具有廣譜抗病性和長(zhǎng)期穩(wěn)定性。
文檔編號(hào)C12N15/54GK102604972SQ20111042023
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2011年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月15日
發(fā)明者吳宏亞, 孫麗英, 張伯橋, 張曉祥, 徐惠君, 程順和, 陳劍平, 陳明, 陳炯, 馬有志 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所, 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院