專利名稱：人stim1基因的用途及其相關(guān)藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地涉及人STIMl基因的用途及其相關(guān)藥物。
背景技術(shù)：
RNA干擾(RNA interference, RNAi)利用雙鏈RNA介導(dǎo)序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默，已成為研究基因功能的一種新興的有效手段，并有望成為腫瘤等疾病基因治療的工具(Izquierdo M. Short interfering RNAs as a tool for cancer gene therapy. Cancer Gene Ther. 2005 ； 12 (3) :217-27.)。慢病毒(Ientivirus)載體是高效的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)工具，較逆轉(zhuǎn)錄病毒載體有更廣的宿主范圍，可將外源的發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA(short hairpin RNA, shRNA) 序列穩(wěn)定導(dǎo)入非周期性和有絲分裂后的細(xì)胞。shRNA在細(xì)胞內(nèi)會自動被加工成為小干擾 RNA (small interferingRNA, si RNA)，引起具有相同序列的mRNA發(fā)生降解。由于慢病毒載體具有具有攜帶基因片段容量大、轉(zhuǎn)染效率高、不易誘發(fā)宿主免疫反應(yīng)等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于基因治療、疫苗生產(chǎn)以及科學(xué)研究等領(lǐng)域(Sinn PL, Sauter SL,McCray PB. Gene therapy progress and prospects :development of improved lentiviral and retroviral vectors-design, biosafety, and production. Gene Ther 2005 ； 12 1089-98.)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣離子信號參與很多重要生理活動，如基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞凋亡等，并在腫瘤發(fā)展和進(jìn)程中發(fā)揮重要作用(Feng M，Grice DM，F(xiàn)addy HM, Nguyen N，Leitch S， Wang Y，Muend S，Kenny PA, Sukumar S，Roberts-Thomson SJ, Monteith GR, Rao R. Store-independent activation of Orai 1 by SPCA2 in mammary tumors. Cell. 2010 ； 143(1) :84-98.)。因此調(diào)節(jié)鈣離子進(jìn)入細(xì)胞的精確反饋機(jī)制至關(guān)重要。基質(zhì)相互作用分子 l(stromal interaction molecule 1, STIM1)編碼分子量約為77KDa的I型膜蛋白，主要定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上Oiang SL, Yu Y，Roos J，Kozak JA, Deerinck TJ, Ellisman MH, Stauderman KA, Cahalan MD. STIMl is a Ca2+sensor that activates CRAC channels and migrates from the Ca2+store to the plasma membrane. Nature. 2005 ；437 (7060) :902-5.)，少量分布于細(xì)胞膜上(Manji SS, Parker NJ, Williams RT, van Stekelenburg L, Pearson RB, Dziadek M, Smith PJ. STIMl :a novel phosphoprotein located at the cell surface. Biochim Biophys Acta. 2000 ； 1481(1) :147-55. )。STIMl被認(rèn)為是哺乳動物細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜鈣離子感受器(Liou J， Kim ML, Heo WD, Jones JT, Myers Jff, Ferrell JE Jr, Meyer Τ. STIM is a Ca2+sensor essential for Ca2+-store-depletion-triggered Ca2+influx.Curr Biol.2005 ； 15(13) :1235-41. Roos J, DiGregorio PJ, Yeromin AV, Ohlsen K, Lioudyno M, Zhang S, Safrina 0, Kozak JA, Wagner SL, Cahalan MD, Velicelebi G, Stauderman KA. STIMl, an essential and conserved component of store-operated Ca2+channel function. J Cell Biol. 2005 ；169 (3) :435-45.)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鈣內(nèi)存被損耗時，STIMl能感受到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子的損耗并向細(xì)胞膜方向移動，激活Orail從而形成鈣池操縱的鈣通道(store-operated calciumchannel, S0C)，介導(dǎo)細(xì)胞夕卜 丐離子的進(jìn)入(Hewavitharana T, Deng X，SoboloffJ,Gill DL. Role of STIM and Orai proteins in the store-operated calcium signaling pathway. Cell Calcium. 2007 ；42 (2) :173-82.)。 人染色體11ρ15區(qū)域聚集著大量的抑癌基因，該區(qū)域的缺失與腎母細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤、腎上腺癌、肝母細(xì)胞瘤、膀胱癌、肺癌、卵巢癌及睪丸癌的發(fā)生密切相關(guān)(Zhao B， Bepler G. Transcript map and complete genomic sequence for the 310 kb region of minimal allele loss on chromosome segment 1 lpl5.5 in non—small_cel1 lung cancer. Oncogene.2001 ；20(56) :8154-64. Parker NJ, Begley CG, Smith PJ, Fox RM. Molecular cloning of a novel human gene(D11S4896E)at chromosomal region llpl5. 5. Genomics. 1996 ；37 (2) :253-6. Williams RT，Manji SS，Parker NJ，Hancock MS， Van Stekelenburg L，Eid JP，Senior PV，Kazenwadel JS，Shandala T，Saint R，Smith PJ, Dziadek MA. Identification and characterization of the STIM(stromal interaction molecule)gene family :coding for a novel class of transmembrane proteins. Biochem J. 2001 ;357 (Pt3) :673-85.)。而 STIMl 基因恰好位于 llpl5. 5 區(qū)域，因此該基因在腫瘤中的調(diào)控功能格外引人注目。然而，在不同的腫瘤細(xì)胞株中，STIMl可能引起不同的生物學(xué)效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)STIMl在橫紋肌肉瘤細(xì)胞系和橫紋肌樣瘤細(xì)胞系中低表達(dá)或者不表達(dá)，過表達(dá) STIMl 可導(dǎo)致細(xì)胞生長阻滯(Sabbioni S, Barbanti-Brodano G，Croce CM, Negrini Μ· GOK :a gene at llpl5involved in rhabdomyosarcoma and rhabdoid tumor development. Cancer Res. 1997 ；57 (20) :4493-7. Sabbioni S，Veronese A，Trubia M， Taramelli R,Barbanti-Brodano G，Croce CM，Negrini M. Exon structure and promoter identification of STIMl(alias GOK)， a human gene causing growth arrest of the human tumor cell lines G401 and RD. Cytogenet Cell Genet. 1999 ；86 (3-4) :214-8.)， 提示STIMl作為一個重要的抑癌基因，在橫紋肌肉瘤發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮作用。在內(nèi)皮細(xì)胞中降低該基因的表達(dá)后，細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度降低，細(xì)胞周期發(fā)生改變，從而使細(xì)胞增殖減 ■ (Abdullaev IF, Bisaillon JM, Potier M， Gonzalez JC, Motiani RK, Trebak Μ. Stim land Orai lmediate CRAC currents and store-operated calcium entry important for endothelial cell proliferation. Circ Res. 2008 ;103 (11) : 1289-99.)；也有報道表明內(nèi)皮細(xì)胞中該基因的高表達(dá)，會促進(jìn)細(xì)胞的凋亡(Chiu WT，Tmg MJ，Jao HC，Shen MR. Soft substrateup-regulates the interaction of STIMl with store-operated Ca2+channels that lead to normal epithelial cell apoptosis. Mol Biol Cell. 2008 ； 19(5) :2220-30.)。此外，還發(fā)現(xiàn)STIMl與在惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)。在乳腺癌細(xì)胞中通過阻斷STMl和Orail這兩個基因可以抑制腫瘤血管的生成，抑制腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移 (Yang S, Zhang JJ, Huang XY. Orail and STIMl are critical for breast tumor cell migration and metastasis. Cancer Cell. 2009 ；15 (2) :124-34.)。在宮頸癌中 STIMl 表達(dá)降低抑制宮頸癌細(xì)胞增生，使細(xì)胞周期停留在G2/M期；在重度免疫缺失小鼠中皮下注射不同STIMl表達(dá)水平的宮頸癌細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)STIMl的細(xì)胞株促進(jìn)腫瘤生成及增加血管密度，而低表達(dá)STIMl的細(xì)胞株則延遲腫瘤生長并降低血管密度；在子宮頸癌臨床樣本中STIMl過表達(dá)，STIMl的表達(dá)水平與腫瘤大小、骨盆淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移這兩個不良預(yù)后因素呈正相關(guān)性(沈孟儒.基質(zhì)交互分子(STIMl)對癌細(xì)胞增生及轉(zhuǎn)移的重要性。成大研發(fā)快訊， 第十六卷第一期)。另外，在膠質(zhì)瘤組織中也檢測到STIMl基因的高表達(dá)(Scrideli CA,Carlotti CG Jr，0kamoto OKiAndrade VSiCortez MAiMotta FJ,Lucio-Eterovic AKiNeder L，Rosemberg S，Oba—Shinjo SM, Marie SK, Tone LG. Gene expression profileanalysis of primary glioblastomas and non—neoplastic brain tissue -identification of potential targetgenes by oligonucleotide microarray and real-time quantitative PCR. J Neurooncol. 2008 ；88 (3) :281-91.)。此外，已經(jīng)有文獻(xiàn)報道 STIMl 的 SiRNA 能夠抑制人 MDA-MB-231 乳腺癌細(xì)胞的增長和轉(zhuǎn)移。(Ymg SY, Zhang JL, Huang XY. Orail and STIMl Are Critical for Breast Tumor Cell Migration and Metastasis，Cancer Cell， 2009 ；15 (2) :124-134))綜上所述，STIMl在腫瘤進(jìn)程中發(fā)揮著具有重要的角色，但關(guān)于該基因在除膠質(zhì)瘤、宮頸癌和乳腺癌外其他腫瘤細(xì)胞增殖中的功能研究尚無深入報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于公開與人STIMl基因相關(guān)的治療方法及藥物。為了深入研究 STIMl在腫瘤發(fā)生中的調(diào)節(jié)功能，本發(fā)明選取人肺癌H1299細(xì)胞、肝癌SMMC-7721細(xì)胞、乳腺癌MCF-7細(xì)胞、前列腺癌PC-3細(xì)胞和胰腺癌Panc-I細(xì)胞為模型，以RNAi為手段研究STIMl 在上述腫瘤細(xì)胞的存活和凋亡命運中的作用。本發(fā)明第一方面，公開了將人STIMl基因用于制備或篩選腫瘤治療藥物，或者將人STIMl基因用于制備腫瘤診斷藥物。人STIMl基因用于制備或篩選腫瘤治療藥物包括兩方面的內(nèi)容其一，將人STIMl 基因作為藥物或制劑針對腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng)用于制備腫瘤治療藥物或制劑；其二，將人STIMl基因作為藥物或制劑針對腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng)用于篩選腫瘤治療藥物或制劑。所述將人STIMl基因作為藥物或制劑針對腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)具體是指將人 STIMl基因作為藥物或制劑針對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生RNA干擾作用的靶標(biāo)，從而能降低腫瘤細(xì)胞人STIMl基因的表達(dá)水平。所述將人STIMl基因作為藥物或制劑針對腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng)用于篩選腫瘤治療藥物或制劑具體是指將人STIMl基因作為作用對象對藥物或制劑進(jìn)行篩選，以找到可以抑制或促進(jìn)人STIMl基因表達(dá)的藥物作為腫瘤治療備選藥物。如之后所述的人STIMl 基因小分子干擾RNA即是以人STIMl基因為作用對象篩選獲得的，可用作具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用的藥物。諸如抗體藥物，小分子藥物等也可將STIMl基因作為作用對象。所述將人STIMl基因用于制備腫瘤診斷藥物，是指將人STIMl基因表達(dá)產(chǎn)物作為一項腫瘤診斷指標(biāo)應(yīng)用于腫瘤診斷藥物的制備。所述的腫瘤可以為其腫瘤細(xì)胞的增殖與人STIMl基因的表達(dá)相關(guān)的任一種腫瘤， 更進(jìn)一步的，為一種惡性腫瘤，例如選自肺癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌和胰腺癌所述腫瘤治療藥物可以為小分子化學(xué)藥，抗體藥，也可以為核酸類藥物。進(jìn)一步的，所述腫瘤治療藥物能降低人STIMl基因的表達(dá)水平從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。采用前述腫瘤治療藥物治療腫瘤的方法，主要是通過降低人STIMl基因的表達(dá)水平抑制腫瘤細(xì)胞的增殖來達(dá)到治療目的的。具體的，治療時，將能有效降低人STIMl基因表達(dá)水平的物質(zhì)給藥于患者。進(jìn)一步的，所述的能有效降低人STIMl基因表達(dá)水平的物質(zhì)，包括能夠特異性沉默人STIMl基因表達(dá)的小分子干擾RNA(siRNA)。該小分子干擾RNA(siRNA)可以起到特異性沉默腫瘤細(xì)胞中內(nèi)源STIMl基因的表達(dá)的作用。進(jìn)一步的，所述小分子干擾RNA以選自SEQ ID NO :1巧4之任一的序列作為特異性沉默人STIMl基因表達(dá)的靶點序列。所述小分子干擾RNA以選自SEQ ID NO 1-54之任一的序列作為特異性沉默人 STIMl基因表達(dá)的靶點序列是指該小分子干擾RNA能與SEQ ID NO :1巧4中的任一種序列所編碼的mRNA片段特異性結(jié)合，并特異性沉默人STIMl基因的表達(dá)。進(jìn)一步的，所述能夠特異性沉默人STIMl基因表達(dá)的小分子干擾RNA (SiRNA)經(jīng)由慢病毒載體表達(dá)。具體而言，這個過程包括將編碼所述人STIMl基因小分子干擾RNA的 DNA片段克隆入慢病毒載體獲得人STIMl基因干擾慢病毒載體，進(jìn)而利用該人STIMl基因干擾慢病毒載體經(jīng)過病毒包裝成為有感染力的病毒顆粒后，感染腫瘤細(xì)胞并最終表達(dá)所述 SiRNA0人STIMl基因干擾慢病毒載體為將編碼所述人STIMl基因小分子干擾RNA的DNA 片段克隆入慢病毒載體后獲得，能產(chǎn)生人STIMl基因小分子干擾RNA。進(jìn)一步的，所述的慢病毒載體可選自pLK0. 1-puro、pLKO. 1-CMV-tGFP、 pLKO.1-puro-CMV-tGFP、 pLKO.I-CMV-Neo, pLKO.l_Neo、 pLKO.l-Neo-CMV_tGFP、 pLKO. 1-puro-CMV-TagCFP、pLKO. l-puro-CMV_TagYFP、pLKO. l-puro-CMV_TagRFP、 pLKO. l-puro-CMV-TagFP635, pLKO. 1-puro-UbC-TurboGFP, pLKO. l-puro-UbC_TagFP635、 pLKO-puro-IPTG-lxLacO、pLK0-puro-IPTG_3xLac0、ρ LP U pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、 pLenti6/BL0CK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAl. 2/V5_GW/lacZ、pLenti6. 2/ N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP 或 pLenti6. 2/N-Lumio/V5-Gff/lacZ 中的任一種慢病毒載體，本發(fā)明實施例具體列舉了以PGCSIL-GFP為載體。慢病毒載體可在慢病毒包裝質(zhì)粒、細(xì)胞系的輔助下，經(jīng)過病毒包裝成為有感染力的病毒顆粒。本發(fā)明第二方面，公開了一種分離的人STIMl基因小分子干擾RNA (SiRNA)靶標(biāo)片段，其序列為SEQ ID NO :1-54中任意一條序列。所述分離的人STIMl基因小分子干擾RNA(SiRNA)靶標(biāo)片段可應(yīng)用于人STIMl基因小分子干擾RNA的篩選與制備。本發(fā)明第三方面，公開了一種人STIMl基因小分子干擾RNA(SiRNA)，能夠特異性沉默人STIMl基因的表達(dá)。所述人STIMl基因小分子干擾RNA以選自SEQ ID NO 1-54之任一的序列作為特異性沉默人STIMl基因表達(dá)的靶點序列。進(jìn)一步的，所述人STIMl基因小分子干擾RNA包含正義RNA片段和反義RNA片段， 所述正義RNA片段和所述反義RNA片段互補，所述正義RNA片段含有SEQ ID中之任一序列編碼的RNA。所述正義RNA片段和反義RNA片段存在于兩條不同的RNA鏈上或者存在于同一條 RNA鏈上。所述正義RNA片段和反義RNA片段的長度均為15_27個核苷酸；較佳的，長度均為 19-23個核苷酸；最佳的，長度均為19、20或者21個核苷酸。
進(jìn)一步的，所述人STIMl基因小分子干擾RNA為發(fā)夾型單鏈RNA，包括正義RNA片段、莖環(huán)片段和反義RNA片段，正義RNA片段和反義RNA片段中間由莖環(huán)片段分隔；其中，正義RNA片段和反義RNA片段互補，正義RNA片段的序列選自SEQ ID NO 1-54之任一。所述莖環(huán)片段結(jié)構(gòu)包括6個或9個堿基。進(jìn)一步的所述莖環(huán)片段的序列選自以下任一 UUCAAGAGA、AUG、CCC, UUCG, CCACC, CTCGAG, AAGCUU、CCACACC。本發(fā)明具體列舉了以 UUCAAGAGA 為莖環(huán)。如實施例列舉的，所述人STIMl基因小分子干擾RNA的序列為SEQ ID NO 55 :(XU GGAUGAUGUAGAUCAUAAUUCAAGAGAUUAUGAUCUACAUCAUCCAGG。本發(fā)明第四方面，公開了一種人STIMl基因干擾核酸構(gòu)建體，包含編碼前述人 STIMl基因小分子干擾RNA的基因片段，能表達(dá)前述人STIMl基因小分子干擾RNA。所述的人STIMl基因干擾核酸構(gòu)建體可以是將編碼前述人STIMl基因小分子干擾 RNA的基因片段克隆入已知載體獲得。進(jìn)一步的，所述人STIMl基因干擾核酸構(gòu)建體為人STIMl基因干擾慢病毒載體，為將編碼所述人STIMl基因小分子干擾RNA的基因片段克隆入慢病毒載體后獲得，能產(chǎn)生人 STIMl基因小分子干擾RNA。所述慢病毒載體可以選自pLK0.1-puro、pLKO. 1-CMV-tGFP、 pLKO.1-puro-CMV-tGFP、 pLKO.I-CMV-Neo, pLKO.l_Neo、 pLKO.l-Neo-CMV_tGFP、 pLKO. 1-puro-CMV-TagCFP、pLKO. l-puro-CMV_TagYFP、pLKO. l-puro-CMV_TagRFP、 pLKO. l-puro-CMV-TagFP635, pLKO. 1-puro-UbC-TurboGFP, pLKO. l-puro-UbC_TagFP635、 pLKO-puro-IPTG-lxLacO、pLK0-puro-IPTG_3xLac0、ρ LP U pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、 pLenti6/BL0CK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAl. 2/V5_GW/lacZ、pLenti6. 2/ N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP 或 pLenti6. 2/N-Lumio/V5-Gff/lacZ 中的任一。本發(fā)明實施例具體列舉了以pGCSIL-GFP為載體構(gòu)建的人STIMl基因干擾核酸構(gòu)建體,命名為 pGCSIL-GFP-STIMl-shRNA。進(jìn)一步的，編碼所述人STIMl基因小分子干擾RNA的基因片段的序列含有SEQ ID NO 1-54中之任一序列及其互補序列。本發(fā)明的人STIMl基因小分子干擾RNA可用于抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，進(jìn)一步地可以用作治療或診斷腫瘤的藥物或制劑。人STIMl基因干擾核酸構(gòu)建體則可用于制備所述人 STIMl基因小分子干擾RNA。當(dāng)用作治療腫瘤的藥物或制劑時，是將安全有效量的人STIMl基因小分子干擾 RNA施用于哺乳動物。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。本發(fā)明第五方面，公開了一種人STIMl基因干擾慢病毒，由前述人STIMl基因干擾慢病毒載體在慢病毒包裝質(zhì)粒、細(xì)胞系的輔助下，經(jīng)過病毒包裝而成。該慢病毒可感染腫瘤細(xì)胞并產(chǎn)生人STIMl基因小分子干擾RNA，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。本發(fā)明第六方面，還公開了一種藥物組合物，含有治療有效量的人STIMl基因小分子干擾RNA或人STIMl基因干擾慢病毒。進(jìn)一步的，所述藥物組合物含有1 99wt%如前所述的人STIMl基因小分子干擾 RNA或人STIMl基因干擾慢病毒，以及藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
在制備這些組合物時，通常將活性成分與賦形劑混合，或用賦形劑稀釋，或包在可以膠囊或藥囊形式存在的載體中。當(dāng)賦形劑起稀釋劑作用時，它可以是固體、半固體或液體材料作為賦形劑、載體或活性成分的介質(zhì)。因此，組合物可以是片劑、丸劑、粉劑、溶液劑、糖漿劑、滅菌注射溶液等。合適的賦形劑的例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、等。制劑還可包括濕潤劑、乳化劑、防腐劑 (如羥基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味劑等。綜上所述，本發(fā)明設(shè)計了針對人STIMl基因的M個RNAi靶點序列，構(gòu)建相應(yīng)的 STIMlRNAi 載體，其中編碼序列 SEQ ID NO 40 的 RNAi 載體 pGCSIL-GFP_STIMl_shRNA 能夠顯著下調(diào)STIMl基因在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)。使用慢病毒(lentivirus，簡寫為Lv) 作為基因操作工具攜帶RNAi載體pGCSIL-GFP-STIMl-shRNA能夠靶向地將針對STIMl基因的RNAi序列高效導(dǎo)入人肺癌H1299細(xì)胞、肝癌SMMC-7721細(xì)胞、乳腺癌MCF-7細(xì)胞、前列腺癌PC-3細(xì)胞和胰腺癌Panc-I細(xì)胞，降低STIMl基因的表達(dá)水平，顯著抑制上述腫瘤細(xì)胞的增殖能力。因此慢病毒介導(dǎo)的STIMl基因沉默是惡性腫瘤潛在的臨床非手術(shù)治療方式。本發(fā)明提供的SiRNA或者包含該SiRNA序列的核酸構(gòu)建體、慢病毒能夠特異性抑制人STIMl基因的表達(dá)，尤其是慢病毒，能夠高效侵染靶細(xì)胞，高效率地抑制靶細(xì)胞中 STIMl基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，在腫瘤治療中具有重要
眉、ο


圖1表示pGCSIL-GFP質(zhì)粒DNA圖譜圖2表示表示STIMlshRNA慢病毒侵染5天后，人肺癌H1299細(xì)胞、肝癌SMMC-7721 細(xì)胞、乳腺癌MCF-7細(xì)胞和前列腺癌PC-3細(xì)胞中的STIMl mRNA的表達(dá)水平降低圖3表示STIMl shRNA慢病毒侵染5天后，人肺癌H1299細(xì)胞的增殖能力被抑制圖4表示STIMl shRNA慢病毒侵染5天后，人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖能力被抑制圖5表示STIMl shRNA慢病毒侵染5天后，人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖能力被抑制圖6表示STIMl shRNA慢病毒侵染5天后，人前列腺癌PC_3細(xì)胞的增殖能力被抑制圖7表示STIMl shRNA慢病毒侵染5天后，人胰腺癌Panc-I細(xì)胞的增殖能力被抑制圖8使用STIMl抗體在腫瘤組織樣本上的免疫組化檢測結(jié)果.a為乳腺癌，b、c為肺癌，d為胰腺癌
具體實施例方式本發(fā)明基于STIMl的相關(guān)的研究，認(rèn)為STIMl可能參與了除乳腺癌外其他惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。本發(fā)明涉及了一組針對人STIMl基因的小分子干擾RNA(SiRNA)序列、RNA干擾載體和RNA干擾慢病毒。選取人STIMl mRNA編碼區(qū)序列作為siRNA的靶位點，根據(jù)靶位點中連續(xù)的10-30(優(yōu)選15-27，更優(yōu)選19-23)個堿基序列設(shè)計siRNA靶點序列。通過基因克隆，構(gòu)建表達(dá)上述siRNA的核酸構(gòu)建體，包裝表達(dá)上述siRNA的慢病毒。細(xì)胞實驗證明，上述siRNA序列能夠特異性沉默人腫瘤細(xì)胞中內(nèi)源STIMl基因的表達(dá)。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，采用RNAi方法下調(diào)人STIMl基因的表達(dá)后可有效地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，這一研究成果表明STIMl基因是原癌基因，可作為腫瘤治療的靶點。發(fā)明人進(jìn)一步合成和測試了多種針對STIMl基因的siRNA，篩選出了可有效抑制STIMl的表達(dá)進(jìn)而抑制人肺癌H1299細(xì)胞、肝癌SMMC-7721細(xì)胞、乳腺癌MCF-7細(xì)胞和前列腺癌PC-3細(xì)胞增殖和生長的siRNA，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。本發(fā)明提供了一系列干擾人STIMl基因的小干擾RNA(siRNA)序列，構(gòu)建了可特異性沉默STIMl基因表達(dá)的慢病毒。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，針對人STIMl基因設(shè)計的小干擾RNA及 RNAi慢病毒，穩(wěn)定并特異地下調(diào)STIMl基因的表達(dá)，并有效地抑制人腫瘤細(xì)胞的增殖。本發(fā)明表明STIMl基因可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長，有望成為腫瘤早期診斷和治療的靶點。而且，通過 RNAi方式沉默STIMl基因的表達(dá)，可作為抑制腫瘤發(fā)展的有效手段。本發(fā)明的設(shè)計思路為本發(fā)明通過如下方法來篩選獲得一種人STIMl基因RNAi慢病毒從Genbank中調(diào)取人STIMl基因序列；預(yù)測siRNA位點；合成針對STIMl基因的有效的siRNA序列，兩端含酶切位點粘端的雙鏈DNA Oligo ；慢病毒載體雙酶切后與雙鏈DNA Oligo連接，構(gòu)建表達(dá) STIMl基因siRNA序列的RNAi質(zhì)粒；將RNAi質(zhì)粒和慢病毒包裝需要的輔助載體(Packing Mix, Sigma-aldrich公司)共轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞^3T，產(chǎn)生重組慢病毒顆粒，即可制得高效沉默STIMl基因的慢病毒。基于上述方法，本發(fā)明提供了 M個干擾STIMl基因的有效靶點(具體如SEQ IDNO 1-54所示)，構(gòu)建了特異干擾人STIMl基因的慢病毒。同時本發(fā)明還公開一種人STIMl基因RNAi慢病毒RNAi及其制備與應(yīng)用。本研究發(fā)現(xiàn)，利用慢病毒介導(dǎo)的RNAi方法，在降低STIMl基因在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)后，可以有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。本研究表明，STIMl基因是一個原癌基因，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中具有重要的生物學(xué)功能，STIMl基因可以為腫瘤治療的靶標(biāo)，慢病毒介導(dǎo)的STIMl基因特異性沉默可作為腫瘤治療的一種新手段。下面結(jié)合實施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，實施例僅用于說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法及未說明配方的試劑均為按照常規(guī)條件，如[美]Sambrook. J等著；黃培堂等譯。分子克隆試驗指南，第三版。北京科學(xué)出版社 2002中所述的條件或者制造商建議的條件進(jìn)行或配置。實施例1 針對人STIMl基因RNAi慢病毒的制備1.篩選針對人STIMl基因的有效的siRNA靶點從Genbank調(diào)取STIMl (匪003156)基因信息；利用上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司的設(shè)計軟件Genechem設(shè)計針對STIMl基因的有效的siRNA靶點。在STIMl基因的編碼序列(CDQ區(qū)域內(nèi)，每隔一個堿基起始獲得21個堿基的序列，表1列出了其中M條針對 STIMl基因的有效siRNA靶點序列。表1靶向于人STIMl基因的siRNA靶點序列
權(quán)利要求
1.人STIMl基因在制備或篩選肺癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌和胰腺癌的腫瘤治療藥物，或者在制備肺癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌和胰腺癌之任一腫瘤診斷藥物中的用途。
2.一種分離的人STIMl基因小分子干擾RNA靶標(biāo)片段，其序列為SEQ ID NO :1_54中任意一條序列。
3.一種人STIMl基因小分子干擾RNA，能夠特異性沉默人STIMl基因的表達(dá)，所述人 STIMl基因小分子干擾RNA以選自SEQ ID NO 1巧4之任一的序列作為特異性沉默人STIMl 基因表達(dá)的靶點序列。
4.如權(quán)利要求3所述人STIMl基因小分子干擾RNA，其特征在于，所述人STIMl基因小分子干擾RNA包含正義RNA片段和反義RNA片段，所述正義RNA片段和所述反義RNA片段互補，所述正義RNA片段含有SEQ ID NO :1_54中之任一序列編碼的RNA。
5.如權(quán)利要求4所述人STIMl基因小分子干擾RNA，其特征在于，所述正義RNA片段和反義RNA片段的長度均為15-27個核苷酸。
6.如權(quán)利要求5所述人STIMl基因小分子干擾RNA，其特征在于，所述人STIMl基因小分子干擾RNA為發(fā)夾型單鏈RNA，所述正義RNA片段和所述反義RNA片段中間由莖環(huán)片段分隔。
7.如權(quán)利要求6所述人STIMl基因小分子干擾RNA，其特征在于，所述莖環(huán)片段的序列選自以下任一 UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACC。
8.如權(quán)利要求3所述人STIMl基因小分子干擾RNA，其特征在于，所述人STIMl基因小分子干擾RNA的序列為SEQ ID NO :55。
9.一種人STIMl基因干擾核酸構(gòu)建體，包含編碼權(quán)利要求3-8任一權(quán)利要求所述人 STIMl基因小分子干擾RNA的基因片段，能表達(dá)人STIMl基因小分子干擾RNA。
10.如權(quán)利要求9所述人STIMl基因干擾核酸構(gòu)建體，其特征在于，所述人STIMl基因干擾核酸構(gòu)建體為人STIMl基因干擾慢病毒載體。
11.如權(quán)利要求10所述人STIMl基因干擾核酸構(gòu)建體，其特征在于，所述慢病毒載體選自pLK0. 1-puro、pLKO. 1-CMV-tGFP、pLKO. l-puro-CMV-tGFP、pLKO. I-CMV-Neo, pLKO. l-Neo、pLK0. l-Neo-CMV-tGFP、pLKO. l-puro-CMV-TagCFP、pLKO. l-puro-CMV-TagYFP、 pLKO. 1-puro-CMV-TagRFP、pLKO. l-puro-CMV-TagFP635, pLKO. 1-puro-UbC-TurboGFP、 pLKO. l-puro-UbC-TagFP635> pLK0-puro_IPTG-lxLac0、pLK0-puro-IPTG_3xLac0、pLPl、 pLP2, pLP/VSV-G, pENTR/U6, pLenti6/BL0CK-iT-DEST, pLenti6-Gff/U6-laminshrna, pcDNAl. 2/V5-GW/lacZ、pLenti6. 2/N-Lumio/V5_DEST、pGCSIL-GFP 或pLenti6. 2/N-Lumio/ V5-Gff/lacZ 中的任一。
12.—種人STIMl基因干擾慢病毒，由權(quán)利要求9-11任一權(quán)利要求所述人STIMl基因干擾慢病毒載體在慢病毒包裝質(zhì)粒、細(xì)胞系的輔助下，經(jīng)過病毒包裝而成。
13.一種藥物組合物，含有治療有效量的權(quán)利要求3-8任一權(quán)利要求所述人STIMl基因小分子干擾RNA或權(quán)利要求12所述人STIMl基因干擾慢病毒，以及藥學(xué)上可接受的載體、 稀釋劑或賦形劑。
14.如權(quán)利要求13所述藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物用于治療肺癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌和胰腺癌之任一腫瘤。
全文摘要
本發(fā)明公開了人STIM1基因的用途及其相關(guān)藥物。本發(fā)明公開了人STIM1基因在腫瘤治療、腫瘤診斷及藥物制備中的用途。本發(fā)明還進(jìn)一步構(gòu)建了人STIM1基因小分子干擾RNA、人STIM1基因干擾核酸構(gòu)建體、人STIM1基因干擾慢病毒并公開了他們的用途。本發(fā)明提供的siRNA或者包含該siRNA序列的核酸構(gòu)建體、慢病毒能夠特異性抑制人STIM1基因的表達(dá)，尤其是慢病毒，能夠高效侵染靶細(xì)胞，高效率地抑制靶細(xì)胞中STIM1基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，在腫瘤治療中具有重要意義。
文檔編號C12N15/867GK102433383SQ20111042591
公開日2012年5月2日 申請日期2011年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月19日
發(fā)明者孫琴, 曹躍瓊, 沈浩, 瞿紅花, 金楊晟, 韓海雄, 顧雪峰 申請人:上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司