專利名稱：來源于嗜熱鹽絲菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶及其表達與純化的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種來源于嗜熱鹽絲菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的合成，更具體涉及該酶的原核表達與純化。
背景技術：
草甘膦是一種廣譜滅生性、內吸傳導型優(yōu)秀除草劑，廣泛用于果園、膠園、非耕地、免耕地中的玉米、大豆、棉花播前或播后處理，以及出苗后定向處理。1974年在美國注冊登記以來，至今已在世界100多個國家注冊，成為世界上使用面積最大的除草劑品種之一。但是該除草劑同樣是一種非選擇性除草劑，對農(nóng)作物同樣有著殺死作用。為了在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用草甘膦，必 須培育出具有草甘膦抗性或者降解性的農(nóng)作物。草甘膦(N-phosphonomethyl-glycine, glyphosate)毒性作用機理是競爭性抑制莽草酸途徑中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(簡稱EPSP合成酶)的活性。EPSP合成酶是植物和微生物體內芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等)生物合成過程中的一個關鍵酶，該酶由aroA基因編碼。目前種植抗除草劑轉基因作物的國家越來越多，面積也迅速增加，種植面積不斷擴大，占全球種植轉基因作物的78%以上。根據(jù)2002年資料表明，耐草甘膦大豆依舊是美國、阿根廷、加拿大、墨西哥、羅馬尼亞、烏拉圭和南非等七國的主要商品化轉基因農(nóng)作物。耐草甘膦除草劑大豆在全球范圍內種植3650萬公頃，占全球總轉基因農(nóng)作物種植面積的62%。然而現(xiàn)在主要研究的抗草甘膦基因主要是I型的，因而發(fā)掘新型的II類的EPSP合成酶基因將是必要的。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題在于提供一種源于嗜熱鹽絲菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因及其表達與純化。本發(fā)明通過對該酶基因的動力學參數(shù)以及在原核生物中表達進行研究，發(fā)現(xiàn)該酶基因可用于生產(chǎn)耐受草甘膦的轉基因作物。本發(fā)明所述的來源于嗜熱鹽絲菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No I所示，是通過化學合成方法得到的。即采用大量重疊的引物通過兩步PCR進行全基因的合成(PTDS) (Nucleic Acids Research，2004，32:e98)，該方法是目前基因合成的主流方法，通過重疊延伸獲得合成基因的片段，再通過最外側的引物將全長的基因擴增得到。該方法一個明顯的優(yōu)勢就是不需要對引物進行磷酸化處理，而且通過高通量的DNA合成儀器，可以較為便利地獲得大量的引物。所述的來源于嗜熱鹽絲菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的具體合成方法包括以下步驟:I)引物設計設計長度大概為60bp左右的覆蓋整個5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的寡核苷酸的序列34個，其中每相鄰的兩個寡核苷酸序列有20個堿基的重復。2) PCR 擴增利用PCR進行5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶擴增。其中，在IOOiU反應體系中，P2—P33共32個引物的添加量為2ng，兩個外側引物Pl和P34的添加量為30ng，擴增條件為:94°C預熱 lmin，94°C 30s, 50°C 30s, 72°C lOmin，使用的 Taq DNA 聚合酶為 KOD FXtaq酶(Toyobo公司，日本)，共25個循環(huán)。3)轉化PCR結束后，用I %瓊脂糖膠回收片段，取IOiU直接與T/A克隆載體相連(大連寶生物公司)。4°C連接過夜，在DH5a感受態(tài)中高效轉化，即獲得長度為1293bp的SEQ IDNo I序列的陽性克隆。將上述獲得的序列為SEQ ID No I陽性克隆直接與原核表達載體pYM4087 (上海市農(nóng)科院分子生物實驗室保存)相連，4°C連接2小時。然后將該載體轉化感受態(tài)大腸桿菌TOP 10 (Invitrogen)。將菌液涂布于含有50 y g/mL氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基(15g/L瓊脂，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸緩沖液pH 7.5)37°C過夜培養(yǎng)。次日，挑取3-5個菌落，接種于50ml液體LB培養(yǎng)基(5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸緩沖液PH 7.5)中，37°C搖床直到菌液的濃度達到0D_為1.0時停止培養(yǎng)。培養(yǎng)液在5，OOOg重力加速度下離心5min，無菌水清洗I次。所得的細胞沉淀用ImL磷酸裂解緩沖液重懸，然后將其轉移到微量離心管中。使用超聲波儀裂解菌液30min，以12，OOOg離心30min。使用微孔濾膜過濾離心好的上清,上到N1-Agarose柱上,純化出目的蛋白。將目的蛋白透析后使用蛋白保存液保存起來。然后對其進行酶動力學特性分析。有益效果本發(fā)明制得的來 源于嗜熱鹽絲菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶是一類應用性非常強的酶，試驗表明，該基因可用于生產(chǎn)耐受草甘膦的轉基因作物中。


圖1為本發(fā)明的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因化學合成的策略圖。圖2為本發(fā)明的以pYM 4087質粒構建DNA表達單元示意圖。
具體實施例方式以下結合附圖詳細描述本發(fā)明的技術方案。實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對發(fā)明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術方案的精神和范圍，其均應涵蓋在本發(fā)明的權利要求范圍中。本發(fā)明所用的試劑若未經(jīng)說明，均購自西格瑪-奧德里奇(Sigma-Aldrich)公司。本發(fā)明涉及分子生物學實驗，如沒有特別注明，均參考自《分子克隆》一書J.薩姆布魯克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994，科學出版社。實施例15-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的化學合成以基因合成方法(Nucleic Acids Research, 2004, 32, e 98)合成本發(fā)明的5_稀醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因，其中所設計的引物序列分別如下:
1.EMPI1-1:Tm = 54.60merGGA, TCC, ATG, GAA, CTG, AAG, ATC, AAG, AAG, TCC, AAT, CCA, CTG, AAG, GGT, GAG,ATC，AAC，ATT, CCA2.EMPI1-2:Tm = 54,60merAGG，TGA，AGA，TGA，CGG，ATC，TGT，GGG，AGA，TGG，ACT, TGT，CAC，CTG，GAA，TGT，TGA，TCT，CAC，CCT3.EMPI1-3:Tm = 54,60merCAG，ATC，CGT，CAT, CTT，CAC，CTC，TCT，TGC，TGA，AGG，CAG，ATC，CTT，GAT，CAG，AGG，CTT，CCT，GGA4.EMPI1-4:Tm = 54,60merCAT, CTG，GAA, GGC, TCT，CAG，AGT，GTT，CAG，ACA, GTC, CTC, AGA, CTC, CAG，GAA,GCC，TCT，GAT，CAA5.EMPI1-5:Tm = 54,60merCTC，TGA，GAG, CCT，TCC，AGA，TGA，TGG，GTG，TCA，ACA，TCG，AGA，AGA，TCA，AGC，CAG，GTG，AGT，ACA6.EMP11-6:Tm = 54,60merCCT，GGC，TCT，TTC，AGA，CCA, TAC，AGA，CCA, ACA，CCA, TTG，ACG，ATG，TAC，TCA，CCT，GGC，TTG，ATC7.EMPI1-7:Tm = 54,60merTAT，GGT，CTG，AAA，GAG, CCA，GGT，GAC，GTC，ATT, GAC，TGT，GGC，AAC，TCT，GGC，ACT, GGT，ATG，AGA8.EMP11-8:Tm = 54,60merCAG，AGT，AGA，ATG，GTT，GTG，GAG, CAA，GAA，GAC，CAC，ACA，ACA，GTC，TCA，TAC，CAG，TGC，CAG，AGT9.EMP11-9:Tm = 54,60merTCC, ACA, ACC, ATT, CTA, CTC, TGT，CTT，GAC, TGG，TGA, CAA, CTC, TCT，GAG, AAA，CAG，ACC，AAT，GGG10.EMPI1-10:Tm = 54,60merGAT，GGA，GGC，TCC，CAT, TTG，TCT，CAG，AGG，ATT, GAC，AAC，TCT，GCC，CAT, TGG，TCT，GTT，TCT，CAG11.EMPI1-11:Tm = 54,60merGAC，AAA，TGG，GAG, CCT，CCA，TCT，GGT，GCA，GAG, ATG，GTG，GTT，ATG，CTC，CAC，TGT，CCA，TCA，AAG12.EMPI1-12:Tm = 54, 60merGCA，ACT, GGC，AAG，GTG，TAG, GAG, ATG，CCT，TCC，AGC，TTC，TCA，CCT，TTG，ATG，GAC，AGT，GGA，GCA13.EMPI1-13:Tm = 54,60merTCC，TAC，ACC，TTG，CCA，GTT，GCC，TCT，GCT，CAG，GTC，AAG，TCC，TCT，CTG，CTG，CTG，GCT，GGC，TTG
權利要求
1.一種來源于嗜熱鹽絲菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID No I 所示。
2.權利要求1所述的合成酶基因與原核表達載體PYM4087連接在轉化大腸桿菌中的應用。
3.權利要求 1所述的合成酶基因在生產(chǎn)耐受草甘膦的轉基因作物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種來源于嗜熱鹽絲菌的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶及其表達與純化。所述合成酶基因的核苷酸序列如SEQ ID No 1所示，全長1293bp。將其與原核表達載體pYM4087連接并轉化至大腸桿菌，動力學實驗表明該合成酶基因可用于生產(chǎn)耐受草甘膦的轉基因作物。
文檔編號C12R1/19GK103160523SQ20111042599
公開日2013年6月19日 申請日期2011年12月19日 優(yōu)先權日2011年12月19日
發(fā)明者付曉燕, 姚泉洪, 彭日荷, 田永生, 趙偉, 朱波, 金曉芬, 韓紅娟 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學院